CN105061616A - 三叶青藤多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三叶青藤多糖提取物及其制备方法和应用，该方法包括：取干燥的三叶青的藤粉碎得到干粉，用水提取，过滤，滤液经干燥后得到三叶青藤的水提物。三叶青藤的水提物经乙醇沉淀、双水相萃取后得到三叶青藤多糖提取物，其多糖含量为53.7％-97.8％。本发明方法制备的三叶青藤多糖提取物具有抗菌杀菌作用，可用于制备抑菌杀菌用品。如制成抗菌药液，该药液可作为成分用于药物、化妆品、保健食品、食品以及用于人、动物、水产养殖过程中的抑菌和抗菌。本发明为三叶青原有公开功效外的新的药物、化妆品、保健食品以及食品的用途，具有抑菌抗菌作用，具备广阔的应用前景。

Description

三叶青藤多糖提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及三叶青藤多糖提取物的技术领域，具体涉及一种三叶青藤多糖提取物及其制备方法和应用。

背景技术

中药三叶青(TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg)为葡萄科崖爬藤属三叶崖爬藤，生于阴湿的山坡、山谷或溪旁的林下，主要分布于我国西南以及浙江、安徽、江西、福建、广西等省区。三叶青主要以块根，也有用全草入药，但无特别说明，目前药房出售的三叶青和市售的三叶青中药饮片粉剂均为三叶青块根部位，药典和文献中的三叶青也大多是指三叶青的块根部位。三叶青的块根具有提高免疫力、抗病毒、增强肝功能等作用，尤其对乙肝、多种肿瘤、癌症、小儿高热惊厥、支气管炎、肺炎、咽喉炎、病毒性脑炎等具有独特的疗效，被中医药界誉为极品中草药。目前市场上三叶青块根的鲜药价格高达每千克2000元，中药饮片三叶青块根粉的市场价格达每克10元，供不应求。

三叶青块根的市场需求旺盛，而三叶青的藤和叶的部位的药理学研究相对较少，市场需求量也不大，大部分的三叶青的藤和叶被当做废料扔弃。因此对于积极开发三叶青藤和叶在药理学上面的应用，可以有效提高三叶青各部位的综合利用，提高经济效益。

三叶青因为对不明原因的高热、小儿高热惊厥、各类炎性水肿有独特疗效，民间素有“植物抗生素”的美誉。但现有药典和文献记载的都针对三叶青退热和消炎的功能，对于三叶青能直接抑制细菌生长和杀死细菌的作用未见记载，特别是三叶青抑制细菌生长和杀死细菌的作用的药效部位未见报道。

公开号为CN101417000A(申请号为200810120750.7)的中国发明专利申请公开了一种制备三叶青提取物的新方法，即从三叶青中高效提取分离黄酮类化合物的方法，将三叶青干燥、粉碎，加入水于超声波提取器中提取，将提取液浓缩至一定体积，再用活性炭进行吸附脱色，接着利用空化混悬萃取分离装置，先用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，将水溶液部分用氯仿萃取，回收氯仿，将水溶液部分浓缩至无有机试剂味，通过大孔吸附树脂，依次用水和50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，回收溶剂，得到三叶青提取物。该技术方案通过乙酸乙酯和氯仿萃取，高效提取分离黄酮类化合物，但是对其提取分离的黄酮类化合物的用途无法知晓。此外，通过该方法提取得到的黄酮类物质为小极性物质，一般难以溶于水，需要一定有含量的机溶剂才能溶解。

申请公布号为CN103381222A(申请号为201210144289.5)的中国发明专利申请公开了一种植物三叶青气体制剂及制备方法，其中，三叶青原液成分提取方法包括：三叶青原药1Kg乙醇50％3～4倍浸取两次，将两次提取的上清液混合，回收乙醇制成1：1原液备用。该技术方案通过以下重量百分含量的组分制成喷雾剂，配制组分如下：三叶青原液10％～30％、聚维酮3％～6％、泊洛沙姆0.3％～5％、甘油1％～3％、乙醇2％～6％、薄荷脑0.02％～0.05％、木糖醇2％～4％、纯化水余量。该喷雾剂通过上述组分的复配可用于抗病毒、镇痛消肿，可具体用于治疗上感风寒、口腔等粘膜部分的上呼吸道感染、以及外用于治疗痔疮脓肿。但是如何通过提取液，提取出抗菌性最好的三叶青原液，该专利申请说明书并未公开。

发明内容

本发明提供了一种三叶青藤多糖提取物及其制备方法和应用，三叶青藤多糖提取物极易溶于水，能够有效抑制细菌生长和杀死细菌。

一种三叶青藤多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)取干燥的三叶青的藤粉碎得到干粉，用水提取，过滤，滤液经干燥后得到三叶青藤的水提物；

2)将步骤1)中的三叶青藤的水提物用水溶解，形成前置溶液，加体积百分数70％-95％的乙醇水溶液于2-8℃条件下沉淀6-48h，干燥沉淀物得到三叶青藤的粗多糖提取物；

3)将步骤2)中的三叶青藤的粗多糖提取物用双水相萃取，进一步得到三叶青藤多糖提取物。

本发明中，通过水作为溶剂提取，将三叶青的藤中的多糖提取出来，通过乙醇沉淀，双水相萃取最终得到三叶青藤多糖提取物，得到的三叶青藤多糖提取物能够有效抑制细菌生长和杀死细菌。

步骤1)中，用水提取60min～120min。上述条件下能够更好地提取三叶青藤中抑菌和杀菌成分。进一步优选，用水提取90min，该提取时间有利于三叶青的藤中抑菌和杀菌成分的提取。

所述的水(即提取溶剂)的用量为干粉质量的0.1-100mL/g。即所述的干粉的质量与水的体积之比为1g：0.1-100mL，即每克干粉加入0.1-100mL的水。进一步优选，所述的水的用量为干粉质量的5-40mL/g，更优选为40mL/g。

步骤2)中，所述的乙醇水溶液与前置溶液的体积比为1-20：1。

步骤3)中，所述的双水相萃取，包括：

将水、三叶青藤的粗多糖提取物、离子液体[C₄min]Cl以及K₃PO₄或者K₂HPO₄混合，形成双水相溶液，双水相溶液在20-35℃条件下静置20-60min，3000-5000rpm离心5-20min后分成上下两相，下相液体用1-20倍体积的体积百分数70％-95％的乙醇水溶液于2-8℃条件下沉淀6-48h后干燥，得到三叶青藤多糖提取物。上相为包含离子液体[C₄min]Cl，蛋白质，矿物质，下相包含三叶青多糖。

所述的双水相溶液采用以下比例混合：

水5mL，三叶青藤的粗多糖提取物0.001-10g，离子液体[C₄min]Cl0.1-10mL，K₃PO₄或者K₂HPO₄0.001-10g。双水相溶液的体积可等比例放大或者缩小。

得到的三叶青藤多糖提取物，用苯酚-硫酸法(《中药提取物——鉴别与质量标准参考》，陈冲主编，化学工业出版社，2013年818页)测得三叶青藤多糖提取物中多糖的含量(重量含量)为53.7％-97.8％。

一种抗菌药液的制备方法，包括以下步骤：

将三叶青藤多糖提取物溶解于水中，经0.2～0.5μm的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液；

所述的三叶青藤多糖提取物的质量与水的体积之比为1-128mg：1mL。

作为优选，所述的三叶青藤多糖提取物的质量与水的体积之比为55-75mg：1mL。进一步优选，所述的三叶青藤多糖提取物的质量与水的体积之比为64mg：1mL。

经0.2～0.5μm的滤膜除去杂质，杂质主要为不能溶解(无抗菌功效)的杂质。本发明最大限度地将抗菌和杀菌成分保留在抗菌药液中，使得本发明制得的抗菌药液对抑制细菌生长和杀死细菌具有较好的作用。

所述的抗菌药液可用于制备抑菌杀菌用品，用于药物、化妆品、保健食品、食品以及用于人、动物、水产养殖过程中的抑菌和抗菌。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明中，通过水作为溶剂提取，将三叶青的藤中抑菌和杀菌成分提取出来，通过乙醇沉淀和双水相萃取最后得到三叶青藤多糖提取物，得到的三叶青藤多糖提取物能够有效抑制细菌生长和杀死细菌。

本发明方法制备的三叶青藤多糖提取物具有抗菌杀菌作用，可用于制备抑菌杀菌用品。如制成抗菌药液，最大限度地将抗菌和杀菌成分保留在抗菌药液中，使得本发明制得的抗菌药液对抑制细菌生长和杀死细菌具有较好的作用。该药液可作为成分用于药物、化妆品、保健食品、食品以及用于人、动物、水产养殖过程中的抑菌和抗菌。本发明为三叶青原有公开功效外的新的药物、化妆品、保健食品以及食品的用途，具有抑菌抗菌作用，具备广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例1

(1)取干燥的三叶青的藤50g粉碎得到干粉，用250mL水为溶剂提取90min，过滤，滤液干燥得到三叶青藤的水提物；三叶青藤的水提物用5mL的水溶解，加入40mL的体积百分数90％的乙醇水溶液于4℃条件下沉淀12h，干燥沉淀物得到三叶青藤的粗多糖提取物。5mL水中加入三叶青藤的粗多糖提取物50mg，离子液体[C₄min]Cl10mL，K₃PO₄1g，在35℃条件下静置20min，3000rpm离心10min后分成上下两相。取下相液体，用5倍体积的体积百分数90％的乙醇水溶液于4℃条件下沉淀12h，得到三叶青藤多糖提取物，用苯酚-硫酸法测得三叶青藤多糖的含量为87.7％。三叶青藤多糖提取物以64mg/mL的溶度溶解于水中，0.45μm的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液，各药液在4℃条件下备用。

(2)检测各药液对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。即细菌在LB培养基中于37℃条件下过夜培养，1:15转接到新的LB培养基中继续培养到OD₆₂₀＝0.2±0.02。细菌1:10000稀释到LB培养基中，加入等体积的药液，混匀后取相同体积的混合物加入到下一个稀释度，一直对倍稀释到最后一个浓度。阴性对照加入等体积的水。

(3)细菌在37℃条件下培养18-20小时，读取OD₆₂₀，OD₆₂₀小于0.1(即小于本底数值)判定为无细菌生长。试验结果如表1所示。

表1

MIC(mg/mL)	三叶青藤多糖提取物
		金黄色葡萄球菌ATCC6538	1
单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973	2
		大肠杆菌ATCC8739	4
肠炎沙门氏菌CGMCC50760	4
		铜绿假单胞菌ATCC9027	4
副溶血弧菌ATCC17082	1
		鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028	4

上述结果表明，当三叶青藤多糖提取物的浓度大于等于1mg/mL时，能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538和副溶血弧菌ATCC17082的生长；当浓度大于等于2mg/mL，能够抑制单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973的生长；当浓度大于等于4mg/mL，能够抑制大肠杆菌ATCC8739、肠炎沙门氏菌CGMCC50760、铜绿假单胞菌ATCC9027和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的生长。以上结果说明三叶青藤多糖提取物对细菌具有较好的抑制作用，具有抑菌杀菌作用。

实施例2

(1)取干燥的三叶青的藤50g粉碎得到干粉，用2L水为溶剂提取90min，过滤，滤液干燥得到三叶青藤的水提物；三叶青藤的水提物用10mL的水溶解，加入40mL的体积百分数80％的乙醇水溶液于4℃条件下沉淀12h得到三叶青藤的粗多糖提取物。5mL水中加入三叶青藤的粗多糖提取物10mg，离子液体[C₄min]Cl1mL，K₂HPO₄1g，在20℃条件下静置60min，5000rpm离心20min后分成上下两相。取下相液体，用4倍体积的体积百分数80％的乙醇水溶液于4℃条件下沉淀12h，得到三叶青藤多糖提取物，用苯酚-硫酸法测得三叶青藤多糖的含量为92.3％。三叶青藤多糖提取物以64mg/mL的溶度溶解于水中，0.22μm的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液，各药液在4℃条件下备用。

(2)检测各药液对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。即细菌在LB培养基中于37℃条件下过夜培养，1:15转接到新的LB培养基中继续培养到OD₆₂₀＝0.2±0.02。细菌1:10000稀释到LB培养基中，加入等体积的药液，混匀后取相同体积的混合物加入到下一个稀释度，一直对倍稀释到最后一个浓度。阴性对照加入等体积的水。

(3)细菌在37℃条件下培养18-20小时，读取OD₆₂₀，OD₆₂₀小于0.1(即小于本底数值)判定为无细菌生长。试验结果如表2所示。

表2

MIC(mg/mL)	三叶青藤多糖提取物
		金黄色葡萄球菌ATCC6538	1
单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973	2
		大肠杆菌ATCC8739	4
肠炎沙门氏菌CGMCC50760	2
		铜绿假单胞菌ATCC9027	4
副溶血弧菌ATCC17082	2
		鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028	4

上述结果表明，当三叶青藤多糖提取物浓度大于等于1mg/mL时，能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538的生长，当浓度大于等于2mg/mL时，能够抑制单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973、肠炎沙门氏菌CGMCC50760和副溶血弧菌ATCC17082的生长；当浓度大于等于4mg/mL时能够抑制大肠杆菌ATCC8739、铜绿假单胞菌ATCC9027和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的生长。以上结果说明三叶青藤多糖提取物对细菌具有较好的抑制作用，具有抑菌杀菌作用。

对比例1

(1)取干燥的三叶青的根、藤和叶各50g粉碎得到干粉，用250mL水为溶剂提取90min，过滤，滤液干燥分别得到三叶青根、藤和叶的水提物；三叶青根、藤和叶的水提物用5mL的水溶解，加入40mL的体积百分数90％的乙醇水溶液于4℃条件下沉淀12h得到三叶青根、藤和叶的粗多糖。三叶青根、藤和叶的水提物和粗多糖以64mg/mL的溶度溶解于水中，0.45μm的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液，各药液在4℃条件下备用。

(2)检测各药液对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。即细菌在LB培养基中于37℃条件下过夜培养，1:15转接到新的LB培养基中继续培养到OD₆₂₀＝0.2±0.02。细菌1:10000稀释到LB培养基中，加入等体积的药液，混匀后取相同体积的混合物加入到下一个稀释度，一直对倍稀释到最后一个浓度。阴性对照加入等体积的水。

(3)细菌在37℃条件下培养18-20小时，读取OD₆₂₀，OD₆₂₀小于0.1(即小于本底数值)判定为无细菌生长。试验结果如表3所示。

表3

上述结果表明，当三叶青藤的水提物的浓度大于等于4mg/mL时，能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538和副溶血弧菌ATCC17082的生长；当浓度大于等于8mg/mL，能够抑制单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973的生长；当浓度大于等于16mg/mL，能够抑制大肠杆菌ATCC8739、肠炎沙门氏菌CGMCC50760、铜绿假单胞菌ATCC9027和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的生长。

当三叶青藤粗多糖的浓度大于等于4mg/mL时，能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538、单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973和副溶血弧菌ATCC17082的生长；浓度大于等于8mg/mL，能够抑制鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的生长；浓度大于等于16mg/mL，能够抑制大肠杆菌ATCC8739、肠炎沙门氏菌CGMCC50760、铜绿假单胞菌ATCC9027的生长。

16mg/mL的三叶青的根和叶的水提物和粗多糖对金黄色葡萄球菌ATCC6538，单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973，大肠杆菌ATCC8739，肠炎沙门氏菌CGMCG50760，铜绿假单胞菌ATCC9027，副溶血弧菌ATCC17082，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028均无抑制作用。效果要远远低于三叶青藤的水提物和粗多糖。

以上结果说明三叶青藤的水提物和粗多糖对细菌具有较好的抑制作用，具有抑菌杀菌作用。但综合表1和表2的结果，三叶青藤多糖提取物的杀菌和抑菌效果要优于三叶青藤水提物和粗多糖。

对比例2

取干燥的三叶青的根粉碎得到干粉，分别用50％，75％，95％(体积百分数)的乙醇水溶液提取90min，干粉的质量与乙醇水溶液的体积之比为1g：3mL，过滤，滤液干燥得到三叶青的提取物，加2％的二甲基亚砜的水配制成16mg/mL浓度的抗菌药液(乙醇提取物难溶于水，需要用含2％的二甲基亚砜的水溶液溶解)。试验结果如表4所示。

表4

上述结果表明，16mg/mL的三叶青的根的醇提物对金黄色葡萄球菌ATCC6538，单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973，大肠杆菌ATCC8739，肠炎沙门氏菌CGMCG50760，铜绿假单胞菌ATCC9027，副溶血弧菌ATCC17082，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028均无抑制作用。与表1、2和3结果相比较，三叶青根的醇提物的抑菌效果要明显低于三叶青藤的水提物、粗多糖和多糖提取物。

一般乙醇提取物比较难溶于水，需要添加一定浓度的二甲基亚砜、乙醇或者吐温-80等助溶剂才可溶于水。试验中，含2％二甲基亚砜的水溶液对三叶青根的醇提物的最大溶解度为16mg/mL。助溶剂在实际应用中有浓度限制：比如二甲基亚砜浓度大于2％会对细菌细胞产生毒性，超过1％会对真核细胞产生细胞毒性；乙醇浓度大于0.5％也会对真核细胞产生细胞毒性。而三叶青藤的水提物、粗多糖和多糖提取物在溶解的过程中不需要添加助溶剂，其安全性要优于醇提物。

对比例3

取干燥的三叶青的藤粉碎得到干粉，用体积百分数50％的乙醇水溶液提取90min，干粉的质量与乙醇水溶液的体积之比为1g：3mL，过滤，滤液干燥得到三叶青的提取物，加含2％二甲基亚砜的水溶液配制成16mg/mL浓度的抗菌药液。试验结果如表5所示。

表5

MIC(mg/mL)	三叶青藤的醇提物
		金黄色葡萄球菌ATCC6538	>16
单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973	>16
		大肠杆菌ATCC8739	>16
肠炎沙门氏菌CGMCC50760	>16
		铜绿假单胞菌ATCC9027	>16
副溶血弧菌ATCC17082	>16

鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028

>16

上述结果表明，16mg/mL的三叶青藤的醇提物对金黄色葡萄球菌ATCC6538，单核细胞增多性李斯特菌NCTC7973，大肠杆菌ATCC8739，肠炎沙门氏菌CGMCG50760，铜绿假单胞菌ATCC9027，副溶血弧菌ATCC17082，鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028均无抑制作用。与表1、2和3结果相比较，三叶青藤的醇提物的抑菌效果要明显低于三叶青藤的水提物、粗多糖和多糖。

Claims (10)

1.一种三叶青藤多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取干燥的三叶青的藤粉碎得到干粉，用水提取，过滤，滤液经干燥后得到三叶青藤的水提物；

2)将步骤1)中的三叶青藤的水提物用水溶解，形成前置溶液，加体积百分数70％-95％的乙醇水溶液于2-8℃条件下沉淀6-48h，干燥沉淀物得到三叶青藤的粗多糖提取物；

3)将步骤2)中的三叶青藤的粗多糖提取物用双水相萃取，进一步得到三叶青藤多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的三叶青藤多糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，用水提取60min～120min。

3.根据权利要求1所述的三叶青藤多糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的水的用量为干粉质量的0.1-100mL/g。

4.根据权利要求1所述的三叶青藤多糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的乙醇水溶液与前置溶液的体积比为1-20：1。

5.根据权利要求1所述的三叶青藤多糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的双水相萃取，包括：

将水、三叶青藤的粗多糖提取物、离子液体[C₄min]Cl以及K₃PO₄或者K₂HPO₄混合，形成双水相溶液，双水相溶液在20-35℃条件下静置20-60min，3000-5000rpm离心5-20min后分成上下两相，下相液体用1-20倍体积的体积百分数70％-95％的乙醇水溶液于2-8℃条件下沉淀6-48h后干燥，得到三叶青藤多糖提取物。

6.根据权利要求5所述的三叶青藤多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述的双水相溶液采用以下比例混合：

水5mL，三叶青藤的粗多糖提取物0.001-10g，离子液体[C₄min]Cl0.1-10mL，K₃PO₄或者K₂HPO₄0.001-10g。

7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法制备的三叶青藤多糖提取物。

8.根据权利要求7所述的三叶青藤多糖提取物在制备抑菌杀菌用品中的应用。

9.一种抗菌药液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求7所述的三叶青藤多糖提取物溶解于水中，经0.2～0.5μm的滤膜过滤除菌后，制得抗菌药液；

所述的三叶青藤多糖提取物的质量与水的体积之比为1-128mg：1mL。

10.一种抗菌药液在制备抑菌杀菌用品中的应用，其特征在于，所述的抗菌药液采用权利要求9所述的制备方法制备。