CN104805107B - 一种基于gs筛选系统的动物细胞高效表达载体及应用 - Google Patents
一种基于gs筛选系统的动物细胞高效表达载体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于GS筛选系统的动物细胞高效表达载体及应用。本发明提供了一种构建表达载体的方法，包括如下步骤：将出发载体pIRSE‑EGFP‑B的驱动目的基因表达的CMV启动子替换为hCMV启动子，且在所述出发载体pIRSE‑EGFP‑B种插入标记基因，得到表达载体。本发明的实验证明，本发明先将pIRSE‑EGFP载体的BamHⅠ位点突变得到载体pIRSE‑EGFP‑B，在其基础上将原有CMV启动子替换为人hCMV启动子，并增加了GS标记基因，得到高效表达载体。该高效表达载体在表达目的蛋白更有优势，通过GS系统能够快速获得高效表达细胞系。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于GS筛选系统的动物细胞高效表达载体及应用。
背景技术
伴随着细胞培养技术的进步，特别是在哺乳动物细胞培养的发展，提高了单克隆抗体和其他重组蛋白的表达量。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白需要一个漫长的过程，涉及到目的基因转染到细胞的克隆的选择，适应不同的培养条件下(通常为悬浮液和无血清培养基)，在生物反应器中培养和规模化工业水平。事实上，由于单克隆抗体和其他重组蛋白的高需求，需要建立了大规模生产的过程，以满足市场的需求。然而在提高重组蛋白表达量涉及很多方面，其中携带目的蛋白载体是一个十分关键环节，而且载体上启动子和筛选标志是两个至关重要部分。对于常用的重组蛋白的表达，在哺乳动物细胞中，强烈的病毒启动子/增强子或细胞的启动子/增强子能够明显增强宿主细胞表达水平。最广泛使用的两个启动子是来自于猿猴病毒40(SV40)和巨细胞病毒(CMV)。稳定转染的标记基因通常与目的基因的转染宿主细胞，赋予选择优势。最常用的标记基因为二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因。DHFR表达系统是通过使用氨甲蝶呤(MTX，amethopterin)给药加压，而GS表达系统是通过蛋氨酸亚氨基代砜(MTS，methionine sulphoximine)加压。
传统加压方式，常常会出现使筛选标志基因被大量扩增，而目的蛋白很少扩增。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建表达载体的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将出发载体pIRES2-EGFP-B的驱动目的基因表达的CMV启动子替换为hCMV启动子，且在所述出发载体pIRES2-EGFP-B中插入标记基因，得到表达载体。
上述方法中，包括如下步骤：将所述标记基因插入所述出发载体pIRES2-EGFP-B的多克隆位点后，得到中间载体，再将所述中间载体的驱动目的基因表达的CMV启动子替换为hCMV启动子，得到表达载体。在本发明的实施例中，多克隆位点为AseⅠ和NheⅠ，中间载体pHGS为将GS标记基因插入pIRES2-EGFP-B的AseⅠ和NheⅠ酶切位点间得到的载体。
上述方法中，所述标记基因为GS标记基因。
上述方法中，所述GS标记基因的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第12-1797位核苷酸；
所述hCMV启动子的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第1806-3953位核苷酸。
上述方法中，所述出发载体pIRES2-EGFP-B为将pIRES2-EGFP载体的BamHⅠ位点去除的载体。
上述方法中，所述出发载体pIRES2-EGFP-B按照包括如下步骤的方法制备：将载体pIRES2-EGFP进行BamHⅠ单酶切后再补平粘性末端得到出发载体pIRES2-EGFP-B；
所述出发载体pIRES2-EGFP-B的核苷酸序列具体为序列表中序列4.
由上述的方法制备的表达载体也是本发明保护的范围。
上述表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列3。
上述的表达载体在提高目的蛋白表达中的应用也是本发明保护的范围。
上述的表达载体在筛选高效表达目的蛋白的细胞株中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述目的蛋白的编码基因为序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸。
本发明的实验证明，本发明先将pIRES2-EGFP载体的BamHⅠ位点突变得到载体pIRES2-EGFP-B，在其基础上将原有CMV启动子替换为人hCMV启动子，并增加了GS标记基因，得到高效表达载体。该高效表达载体在表达目的蛋白更有优势，通过GS系统能够快速获得高效表达细胞系。
通过改造质粒在很过方面具有优势：(1)它具备G418筛选标志；(2)具有GS筛选标志；(3)同时它也具有EGFP基因表达，很方便挑单克隆；(4)大大缩短了获得高效表达细胞系所需要时间；(5)获得高效表达细胞系成功率也提高；(6)重组蛋白获得量明显提高；(7)节约了成本。
附图说明
图1为GS PCR扩增(M：200bp Marker)
图2为AseⅠ/NheⅠ双酶切片段电泳图(M：200bp Marker)
图3为hCMV PCR扩增(M：200bpMarker)
图4为PacⅠ/NheⅠ双酶切片段电泳图(M：200bpMarker)
图5为IgG2PCR扩增(1：igu/igd引物，2：IGF/IGR引物，M：200bpMarker)
图6为细胞系免疫荧光下强度
图7为稳定细胞系的上清Wester Blot
图8为在不同选着压力下目标蛋白表达量
图9为细胞系在不同MSX浓度下蛋白表达量
图10为pIRES2-EGFP-B图谱
图11为GS基因组成图谱
图12为pHGS图谱
图13为hCMV启动子组成图谱
图14为pHGS1.0质粒完整图谱
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
部分材料和方法如下：
CHO-S细胞系购自Life technologies公司，产品目录号为10743；
大肠杆菌感受态Trans 10、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及DNA Marker购自北京天根科技有限公司；pIRES2-EGFP；pfu DNA聚合酶购自北京全式金公司；限制性内切酶AseⅠ、NheⅠ、BamHⅠ、PacⅠ、EcoRⅠ、T4DNA连接酶购自NEB公司；Invitrogen2000脂质体购自Life公司；DMEM/F12购自GIBCO公司；胎牛血清为杭州四季青公司；免疫球蛋白IgG定量试剂盒购自华科生物工程股份有限公司；G418购自INALCO公司；MTS购自Coring公司；其他的试剂都为国产分析纯试剂。引物合成和测序由英俊公司完成。
根据已有载体及合成基因设计引物，如表1所示：
表1为所需要引物
实施例1、高效表达载体的构建
一、高效表达载体pHGS1.0的构建
1、对照表达载体pIRES2-EGFP-B的构建
将pIRES2-EGFP(购自Clontech公司，产品目录号为6029-1)进行BamHⅠ单酶切后，胶回收，Klenow酶补平粘性末端，T4DNA连接酶4℃过夜连接，进行转化，涂板，挑单克隆，提质粒，送样测序，将测序正确的质粒命名pIRES2-EGFP-B(图10，该质粒的核苷酸序列为序列表中序列4)。
其中Klenow酶补平反应体系为：pIRES2-EGFP胶回收片段2μl，T4DNA连接酶1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，ddH2O 6μl。
2、表达载体pHGS1.0的构建
以金斯瑞合成标志基因GS的pUC57-GS(购自金斯瑞公司5005455S-1)为模板，设计引物上游5’端引入AseⅠ酶切位点，下游引入NheⅠ、AgeⅠ、PacⅠ酶切位点，引物序列为：
在50μl反应体系中PCR扩增GS基因序列，50μlPCR反应体系为：模板质粒pUC57-GS1μl，pfu DNA聚合酶1μl，上游引物GSF1μl，下游引物GSR1μl，2.5Mm dNTP5μl，5×pfu DNA聚合酶缓冲液10μl，灭菌dH2O 31μl，混匀后进行PCR反应。
反应条件为95℃预变性2min，95℃/20s，56℃/20s，72℃/30s，反应35个循环，72℃延伸5min。
结果如图1所示，得到1918bp的PCR产物，胶回收后，送去测序，该PCR产物即为GS基因序列，其核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第12-1797位核苷酸。
再将胶回收产物GS基因(图11)和pIRES2-EGFP-B通过AseⅠ/NheⅠ双酶切(结果如图2所示)，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：GS 2μl，pIRES2-EGFP-B1μl，T4DNA连接酶1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2μl，灭菌ddH2O4μl。16℃过夜连接，转化Trans 10感受态，涂板，挑单克隆，菌落PCR，将阳性克隆送样测序，测序正确提质粒，将提取质粒命名pHGS(图12)。
以金斯瑞合成hCMV的质粒为模板，用CMVF/CMVR作为上下游引物进行PCR，引物序列如下：
在50μl反应体系中PCR扩增hCMV启动子序列，50μlPCR反应体系为：模板质粒pUC57-hCMV-intron 1μl，pfu DNA聚合酶1μl，上游引物CMVF1μl，下游引物CMVR1μl，2.5MmdNTP 5μl，5×pfu DNA聚合酶缓冲液10μl，灭菌dH2O 31μl，混匀后进行PCR反应。
结果如图3所示，得到2316bp的PCR产物，胶回收后，送去测序，该PCR产物即为hCMV启动子，其核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第1806-3953位核苷酸。
将PCR产物hCMV(图13)胶回收，再将回收产物和质粒pHGS用PacⅠ和NheⅠ双酶切(如图4所示)，产物回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：hCMV-intron2μl，pHGS载体4.1μl，T4DNA连接酶1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2μl，灭菌dH2O10.9μl。16℃过夜连接，转染Trans10感受态，涂板，挑克隆，进行菌落PCR，引物CMVR和CMVF，得到2616bp的为阳性菌。
提取阳性菌的质粒，送去测序，该质粒为将pIRES2-EGFP-B载体中的CMV启动子替换为hCMV启动子，且将GS标记基因插入载体的AseⅠ和NheⅠ酶切位点间，得到的载体，命名为pHGS1.0(图14)。
pHGS1.0质粒完整序列见序列3。
实施例2、高效表达载体的应用
一、含有目标基因的重组载体p-IR-TV-IgG2和p-IR-TV-IgG2获得
1、对照重组载体p-IR-TV-IgG2的构建
以pUC57-IgG2为模板，用igu/igd上下游引物进行PCR，引物序列如下：
在50μl反应体系中PCR扩增。
50μlPCR反应体系为：模板质粒pUC57-IgG2 1μl，pfu DNA聚合酶1μl，上游引物igu1μl，下游引物igd1μl，2.5Mm dNTP 5μl，5×pfu DNA聚合酶缓冲液10μl，灭菌dH2O 31μl，混匀后进行PCR反应。
反应条件为95℃预变性2min，95℃/20s，56℃/20s，72℃/30s，反应35个循环，72℃延伸5min。
结果如图5所示，得到800bp的IgG2基因的PCR产物。
将IgG2基因的PCR产物胶回收后，再将胶回收产物和由实施例1制备的对照表达载体pIRES2-EGFP-B通过BamHⅠ/SalⅠ双酶切，酶切产物胶回收后用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：IgG2 4.2μl，pIRES2-EGFP-B 1μl，T4DNA连接酶1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2μl，灭菌ddH2O 1.8μl。16℃过夜连接，转化Trans10感受态，涂板，挑克隆，菌落PCR，阳性结果送样测序，测序结果正确提质粒，同时命名为pIRES2-IgG2。
将质粒pUC57-TV用NheⅠ和BamHⅠ双酶切，回收1200bp的酶切产物(TV基因)，将该酶切产物与经过同样酶切的pIRES2-IgG2的6.1kb载体骨架连接，得到对照重组载体p-IR-TV-IgG2，经过测序，该载体为将序列表中序列2(序列2自5’末端第7-1176位核苷酸为TV基因，自5’末端第1183-1863位核苷酸为IgG2基因)插入载体pIRES2-EGFP-B的NheⅠ和SalⅠ位点间得到的载体。
2、重组载体pHGS1.0-TV-IgG2的构建
以pUC57-IgG2为模板，用IGF/IGR为上下游引物进行PCR，引物序列如下：
在50μl反应体系中PCR扩增IgG2基因序列，50μlPCR反应体系为：模板质粒pUC57-IgG2 1μl，pfu DNA聚合酶1μl，上游引物igu1μl，下游引物igd1μl，2.5Mm dNTP5μl，5×pfuDNA聚合酶缓冲液10μl，灭菌dH2O 31μl，混匀后进行PCR反应。
反应条件为95℃预变性2min，95℃/20s，60℃/20s，72℃/30s，反应35个循环，72℃延伸5min。
将PCR产物胶回收后，用AvrⅡ和SacⅡ双酶切PCR产物，产物回收。再用NheⅠ和SacⅡ双酶切表达载体pHGS1.0，胶回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，其中连接体系为：IgG24.2μl，pHGS1.01μl，T4DNA连接酶1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2μl，灭菌ddH2O 1.8μl。16℃过夜连接，转化，涂板，挑克隆，菌落PCR，阳性结果送样测序，测序结果正确提质粒，同时命名为pHGS1.0-IgG2。
将质粒pUC57-TV用NheⅠ和BamHⅠ双酶切，回收1200bp的酶切产物(TV基因)，将该酶切产物与经过同样酶切的pHGS1.0-IgG2的9.6kb载体骨架连接，得到重组载体pHGS1.0-TV-IgG2。经过测序，该载体为将序列表中序列1所示的核苷酸(序列1自5’末端第25-1194位核苷酸为TV基因，自5’末端第1201-1881位核苷酸为IgG2基因)插入载体pHGS1.0的NheⅠ和SacⅡ位点间得到的载体。
二、转染细胞的获得
下述质粒为对照重组载体p-IR-TV-IgG2或重组载体pHGS1.0-TV-IgG2：
CHO-S细胞用含有10％血清DMEM/F12培养，转染24h传代细胞到24孔板中，待细胞长满24孔板70％-80％密度时即可进行转染。转染前，将含有10％血清DMEM/F12换成无血清OPTI-MEM培养液，取0.8μg质粒p-IR-TV-IgG2和pHGS1.0-TV-IgG2分别与50μl含有细胞的OPTI-MEM培养液混匀，室温放置5min，同时取2μl Invitrogen2000脂质体与50μl含有细胞的OPTI-MEM培养液混匀，室温(25℃)放置5min，再将它们轻轻混匀，室温放置20min，将100μl培养液逐滴加入24孔板中，并轻轻摇晃24孔板，使脂质体和质粒混合物能够均匀分布在培养基中，在5％CO2、37℃培养箱培养6h，换有血清培养基1ml，24h后，在荧光显微镜下观察并拍照。传代细胞到方瓶中，进行给药加压。
将转染p-IR-TV-IgG2细胞加入含有0.5mg/mlG418培养基中加压，而转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞一分为二，一瓶用含有0.5mg/mlG418培养基加压，另一瓶同时含有0.5mg/mlG418和50μM MSX培养基加压，两周后挑单克隆。
三、检测转染细胞
1、不同曝光时间下进行拍照
将转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞在不同加压条件不同曝光时间下进行拍照，
结果如图6所示，转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞在0.5mg/mlG418条件下细胞的荧光强度不是很高，细胞生长状态良好。
转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞在0.5mg/mlG418和50μM MSX条件下，筛选获得稳定细胞系；
在提高MSX浓度100μM、200μM，转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞明显生长缓慢，再提高细胞浓度，细胞出现大量死亡。
2、Western Blot
将在0.5mg/mlG418加压条件下获得的转染p-IR-TV-IgG2细胞、在0.5mg/mlG418和50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞、在50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞在相同细胞密度下，接种于24孔板，同时将空细胞在相同密度也接种于24孔板，24h后收集四种细胞上清液，离心四种收集上清液，并小心将上清液吸出。将上清液加入4×SDS上样缓冲液，95℃变性5min后，进行SDS-PAGE电泳，再转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉37℃封闭1h后，直接加1/5000倍稀释HRP标记山羊抗人IgG二抗，4℃过夜孵育，用1×TBST洗膜3次，每次5-10min。
上述过程都在水平摇床上进行。最后用ECL显色系统曝光。
结果如图7所示，可以看出，转染p-IR-TV-IgG2细胞和转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞均得到大小为90kD蛋白，如TV-IgG2的理论结果一致。
3、蛋白表达量检测
将在0.5mg/mlG418加压条件下获得的转染p-IR-TV-IgG2细胞、在0.5mg/mlG418和50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞、在50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞均用免疫球蛋白IgG定量试剂盒(华科生物工程股份有限公司成品编号ARB10206)测蛋白表达量。每个细胞系5株，实验重复3次，结果取平均值。
结果如图8所示，1为0.5mg/mlG418加压条件下获得的转染p-IR-TV-IgG2细胞，2为在50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞，3为在0.5mg/mlG418和50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞，可以看出，
在0.5mg/mlG418加压条件下获得的转染p-IR-TV-IgG2细胞的IgG表达量为0.14pg/cell/day；
在0.5mg/mlG418和50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞的IgG表达量为0.4pg/cell/day；
在50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞的IgG表达量为0.65pg/cell/day。
0.5mg/mlG418加压和50μM MSX加压条件下获得的转染p-IR-TV-IgG2细胞结果与在0.5mg/mlG418加压条件下获得的转染p-IR-TV-IgG2细胞的结果无显著差异。
将在0.5mg/mlG418和50、100、250μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞用免疫球蛋白IgG定量试剂盒测蛋白表达量。每个细胞系5株，实验重复3次，结果取平均值。
结果如图9所示，可以看出，
在0.5mg/mlG418和50μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞IgG表达量为0.6pg/cell/day；
在0.5mg/mlG418和100μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞IgG表达量为1.14pg/cell/day；
在0.5mg/mlG418和250μM MSX加压条件下获得的转染pHGS1.0-TV-IgG2细胞IgG表达量为3.5pg/cell/day；
从上述结果可以看出，pHGS1.0载体比对照表达载体pIRES2-EGFP-B对TV-IgG2蛋白的表达量有大量提高。
Claims (7)
1.一种构建表达载体的方法，包括如下步骤：将出发载体pIRES2-EGFP-B的驱动目的基因表达的CMV启动子替换为hCMV启动子，且在所述出发载体pIRES2-EGFP-B中插入标记基因，得到表达载体；
所述标记基因为GS标记基因；
所述GS标记基因的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第12-1797位核苷酸；
所述hCMV启动子的核苷酸序列为序列表中的序列3自5’末端第1806-3953位核苷酸；
所述出发载体pIRES2-EGFP-B按照包括如下步骤的方法制备：将载体pIRES2-EGFP进行BamHⅠ单酶切后再补平粘性末端得到出发载体pIRES2-EGFP-B；
所述出发载体pIRES2-EGFP-B的核苷酸序列具体为序列表中序列4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将所述标记基因插入所述出发载体pIRES2-EGFP-B的多克隆位点后，得到中间载体，再将所述中间载体的驱动目的基因表达的CMV启动子替换为hCMV启动子，得到表达载体。
3.由权利要求1或2所述的方法制备的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列3。
5.权利要求3或4所述的表达载体在提高目的蛋白表达中的应用。
6.权利要求3或4所述的表达载体在筛选高效表达目的蛋白的细胞株中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述目的蛋白的编码基因为序列表中的序列1或序列2所示的核苷酸。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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