CN104797557B

CN104797557B - 氨肽酶n和脑啡肽酶的混合抑制剂

Info

Publication number: CN104797557B
Application number: CN201380060249.5A
Authority: CN
Inventors: B·P·罗克; M-C·富尼耶-扎武斯基; H·波拉什
Original assignee: Pharmaleads SA
Current assignee: Zhiteng Greater China Co ltd
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2033-10-23
Also published as: IL238406A0; HK1212675A1; CA2888728C; ES2668902T3; CN104797557A; TW201420558A; DK2912015T3; FR2997081B1; IL238406B; US20150299116A1; US9388129B2; WO2014064166A1; JP2016503393A; EP2912015A1; WO2014064166A9; EP2912015B1; CA2888728A1; TWI667225B; FR2997081A1; NO2912015T3

Abstract

描述了氨肽酶N和脑啡肽酶的混合抑制剂。包含至少这些化合物中的一种，单独或与吗啡及其衍生物、内源性大麻素和内源性大麻素代谢物的抑制剂、GABA衍生物例如加巴喷丁或普瑞巴林、度洛西汀或美沙酮联合的药物组合物可以被用作镇痛药、抗焦虑药、抗抑郁药或抗炎药。

Description

氨肽酶N和脑啡肽酶的混合抑制剂

技术领域

本发明涉及氨肽酶N和脑啡肽酶(脑啡肽降解所涉及的酶)的混合抑制剂。

背景技术

脑啡肽，Tyr–Gly–Gly–Phe–Met(Leu)，是阿片受体μ和δ的内源性配体，并且参与中枢和外周神经系统的疼痛冲动的调节。然而，尽管它们对阿片受体的亲和力与吗啡类似，但啮齿动物脑室内施用时，这些肽由于它们在体内(包括人类)非常迅速的失活而仅诱导非常短暂的镇痛应答(Mosnaim等人(2008)Neurochem.Res.，33，81–86)。两种金属肽酶引起该失活：氨肽酶N(APN，EC3.4.11.2)和脑啡肽酶(NEP，EC3.4.24.11)，其分别裂解脑啡肽的Tyr¹–Gly²键和Gly³–Phe⁴键，因此导致失活代谢产物(Roques等人(1993)Pharmacol.Rev.，45，87–146)。

已知这两种酶的混合抑制剂完全保护内源性脑啡肽不被酶促降解，从而显示药理活性，特别是脑啡肽的镇痛和抗抑郁活性(Noble等人(2007)Expert.Opin.Ther.Targets，11，145–149)。现有技术中公开的这些抑制剂包括异羟肟酸盐(FR2518088和FR2605004)、氨基次膦酸化合物(FR2755135、FR2777780、FR0855015)、具有巯基官能团的氨基酸(FR2651229、FR0510862、FR0604030、FR0853092)、内源肽(Wisner等人PNAS(2006)，103，17979–17984)。这些各种各样的分子具有赋予它们静脉内或口服对于不同种类疼痛，特别是具有过度性伤害的急性或慢性疼痛(Noble等人(2007)Expert.Opin.Ther.Targets，11，145–149)和神经性疼痛(Menendez等人(2008)Eur J Pharmacol，596，50–55；Thibault等人(2008)Eur.J.Pharmacol.，600，71–77)的药理效力的物理化学性质(溶解性)和药效学性质(生物利用度)。

然而，至今公开的混合抑制剂均没有在锐痛的情况下(术后、癌症、外伤、牙科等)静脉施用后，以临床上合适的载体中扩展输液所能够使用的低剂量，使其能够获得迅速、强烈的镇痛应答并且伴有充分长的作用期。

本发明的目的为提供具有吗啡物质对于中枢神经系统的有利性质，特别是镇痛、行为效应(减少疼痛的情绪要素和抗抑郁应答)，而没有它们对于中枢神经系统(习惯化、身体和精神依赖、呼吸抑制)和外周神经系统(便秘)的主要缺陷的化合物。另外，化合物具有有利的外周效应(抗炎和抗神经)而没有如上所述的缺陷是有益的。

发明内容

本发明涉及具有以下通式(1)的化合物：

(1)R–NH–CH(R₁)–CH₂–S–S–C(R₂)(R₃)–COCH₂–CH(R₄)–COR₅

其中R、R₁、R₂、R₃、R₄和R₅如权利要求1中所定义。

本发明还涉及含有至少一种本发明化合物的药物组合物。

本发明还涉及含有至少一种本发明化合物和至少一种选自吗啡及其衍生物、内源性大麻素和内源性大麻素代谢物的抑制剂、GABA衍生物例如加巴喷丁或普瑞巴林、度洛西汀或美沙酮的化合物的药物组合物。

最后，本发明涉及本发明的化合物或含有其的药物组合物，其用作镇痛药、抗焦虑药、抗抑郁药或抗炎药。

附图说明

图1：静脉注射根据本发明的化合物(10mg/kg)后诱导的镇痛应答——小鼠热板试验。

具体实施方式

定义

烷基指直链或支链的C1、C2、C3、C4、C5或C6烃链，特别指甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

含有至少一个硫、氧或氮原子的芳香或饱和5-或6-原子杂环的例子包括以下基团：噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、异噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、噻二唑基、呋喃基、吡喃基、异噁唑基、吗啉基、呋吖基、噁唑基、噁唑烷基和噁唑啉基。

本文指定术语“卤素”为氯、溴、碘或氟。

发明详述

本发明的化合物对应于APN抑制剂和NEP抑制剂通过二硫键连接，其能够在纳摩浓度抑制这两种酶的活性。该二硫键在体内断裂并释放出能够与其各自的靶点(NEP或APN)相互作用的两种抑制剂(Fournié–Zaluski等人(1992)J.Med.Chem.，35，2473–2481)。

至今公开的NEP抑制剂通常具有肽样式，因此具有一个或多个酰胺键。例如，Roques等人(Nature Rev.Drug Discov.(2012)11，292–311)、Noble等人1992(Journal ofPharmacologyand Experimental Therapeutics 261(1992)，1，181–190)、Noble等人1997(Pain 73(97)，383–391)的文章和专利文献WO2009/138436和FR2892413公开了含有至少一个酰胺键和另外含有二硫键样式的拟肽类衍生物。另外，它们通常具有500Da以上的分子量(MW(法文缩写为PM))。这些特征对于穿过生理屏障，例如肠屏障不是非常有利，并且其结果是这些产品具有相当低的口服生物利用度。对于穿过血脑屏障事实同样如此。

本发明使用的并且使其能够克服这些缺陷的NEP抑制剂的结构特征在于：1)能够以单配位基或双配位基形式与NEP的锌相互作用的新颖的硫酮样式，ii)缺少肽样式(因此缺少酰胺键)，iii)含有最少基团的骨架，使其能够获得对于NEP的纳摩尔亲和力，iv)低的分子量。

本发明的化合物具有以下通式(1)：

其中R为：

a)R为：

-氢；

-烷氧基烷基羰基R’C(O)OCH(R”)OC(O)–，其中R’和R”独立地为含有1至6个碳原子的烷基；

b)R₁为1至6个碳原子的直链或支链烷基，其是未取代的或被–OR”’、–SOR”’或–SR”’基团取代，其中R”’为未取代的或被一个或多个卤素原子取代的1至6个碳原子的烷基；

c)R₂为：

-1至6个碳原子的直链或支链烷基，其是未取代的或被以下基团取代：

■–OR₆、–SR₆或–SOR₆基团，其中R₆为氢、1至4个碳原子的直链或支链烷基、苯基或苄基；

■–CO₂R₇基团，其中R₇为氢、含有2至4个碳原子的直链或支链烷基、或苄基；

■–NR₈R₉基团，其中R₈和R₉独立地为氢、1至4个碳原子的直链或支链烷基、苯基或苄基，或者其中–NR₈R₉一起为含有一个或多个选自N或O的杂原子的饱和5-或6-元杂环，优选为吗啉或哌啶；或

■甲酰胺基团–CONR₈R₉，其中–NR₈R₉如上所定义；

■苯基，其为未取代的或被一个或多个选自氟或溴的卤素、烷氧基–OR₆取代，其中R₆具有如上相同的定义，或者被苯基取代；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香5-或6-元杂环；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的饱和5-或6-元环或杂环化合物；

–含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的饱和5-或6-元环或杂环化合物；或

–苯基，其为未取代的或被一个或多个选自氟或溴的卤素取代，或被–OR₅基团取代，其中R₅具有如上相同的定义；

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为1至6个碳原子的直链或支链烷基；或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■与芳香环稠合或非稠合的饱和5-元环化合物(例如形成茚满环)；

■饱和6-元环化合物；

■在4位含有1个选自氧、氮和硫的杂原子的饱和6-元杂环化合物，其中当杂原子为氮时，所述氮为未取代的或被1至6个碳原子的烷基、苯基、苄基或烷酰基取代；

d)R₄为：

-1至6个碳原子的直链或支链烷基，其为未取代的或被以下基团取代：

■–CO₂R₇基团，其中R₇为氢、含有2至4个碳原子的直链或支链烷基、苄基；

■–NR₈R₉基团，其中R₈和R₉独立地为氢、1至4个碳原子的直链或支链烷基、苯基或苄基，或者其中–NR₈R₉一起为含有一个或多个选自N或O的杂原子的饱和5-或6-元杂环，优选为吗啉或哌啶；

■甲酰胺基团–CONR₈R₉，其中–NR₈R₉如上所定义；

■苯基，其为未取代的或被以下基团取代：

-一个或多个选自氟或溴的卤素；

-–OR₆基团，R₆具有如上相同的定义；

-苯基或噻吩基；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香5-或6-元杂环；或

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子饱和5-或6-元环或杂环化合物；

-苯基，其为未取代的或被以下基团取代：

■一个或多个卤素，尤其是氟或溴；

■–OR₆基团，其中R₆具有如上相同的定义；

■苯基；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香5-或6-元杂环；

e)R₅为：

-羟基；

-–NR₈R₉基团，其中R₈和R₉独立地为氢、1至4个碳原子的直链或支链烷基、苯基或苄基，或者其中–NR₈R₉一起为含有一个或多个选自N或O的杂原子的5–或6–元杂环，优选为吗啉或哌啶；

-烷氧基–OR₁₀，其中R₁₀为：

■含有2至6个碳原子的直链或支链烷基；

■苄基；

■–CHR₁₁–COOR₁₂、–CHR₁₁–O–C(＝O)R₁₂、–CHR_11–或–C(＝O)–OR₁₂基团，其中R₁₁和R₁₂独立地为1至6个碳原子的直链或支链烷基。

本发明的化合物可以为药学上可接受的加成盐的形式，例如当氨基官能团是游离的时，式(I)的化合物与无机或有机酸的加成盐，或者当酸官能团是游离的时，式(I)的化合物与无机或有机碱的加成盐。

通常进行R和R₅基团的N-末端和/或C-末端部分的保护以促进各种施用途径的生物利用度。

在本发明特别的实施方案中，所述化合物具有通式(1)，其中R₂为1至6个碳原子的直链或支链烷基或者被以下基团取代的1至6个碳原子的直链或支链烷基：

■苯基；

■被一个或多个选自氟或溴的卤素取代的苯基；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香5-或6-元杂环；

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为1至6个碳原子的直链或支链烷基，或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■饱和5–元环化合物；

■与芳香环稠合的饱和5–元环化合物；

■饱和6-元环化合物；或

■在4位含有1个选自氧、氮和硫的杂原子的饱和6-元杂环化合物；

并且R、R₁、R₄、R₅如上所述或者如下所述。

更特别地，R₂可以代表被以下基团取代的异丁基或甲基：

■苯基；

■在4位被选自氟或溴的卤素取代的苯基；

■在4位被苯基取代的苯基；

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为甲基或乙基，或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■饱和5–或6–元环基团；或

■与芳香环稠合的饱和5-元环基团。

在本发明特别的实施方案中，所述化合物具有通式(1)，其中R₄为1至6个碳原子的直链或支链烷基，其被以下基团取代：

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香5-或6-元杂环；

■饱和5–或6–元环化合物；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的饱和5-或6-元杂环化合物；

并且R、R₁、R₂、R₃、R₅如上所述或如下所述。

有利地，R₄为1至6个碳原子的直链或支链烷基，其被以下基团取代：

■苯基；或

■被以下基团取代的苯基：

-一个或多个选自氟或溴的卤素；

-苯基或噻吩基，

并且R、R₁、R₂、R₃、R₅如上所述或如下所述。

更特别地，R₄可以代表一个碳的烷基，其被以下基团取代：

■苯基；

■在4位被选自氟或溴的卤素取代的苯基；

■在4位被苯基取代的苯基。

在本发明特别的实施方案中，所述化合物具有通式(1)，其中R₅为：

-羟基；或

-烷氧基–OR₁₀，其中R₁₀为：

■含有2至6个碳原子的直链或支链烷基；

■苄基；

–CHR₁₁–COOR₁₂、–CHR₁₁–O–C(＝O)R₁₂、–CHR_11–或–C(＝O)–OR₁₂基团，其中R₁₁和R₁₂独立地为1至6个碳原子的直链或支链烷基；

并且R、R₁、R₂、R₃、R₄如上所述或如下所述。

有利地，R₅为羟基并且R、R₁、R₂、R₃、R₄如上所述或如下所述。

优选的化合物具有以下通式(1)其中：

a)R₁选自–CH₂CH₂SCH₃、–CH₂CH₂CH₂CH₃、–CH₂CH₂SOCH₃；

b)R₂为1至6个碳原子的直链或支链烷基或者被以下基团取代的1至6个碳

原子的直链或支链烷基：

■苯基；

■被一个或多个选自氟或溴的卤素取代的苯基；

■含有1或2个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香5-或6-元杂环；

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为1至6个碳原子的直链或支链烷基；或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■饱和5–元环化合物；

■与芳香环稠合的饱和5–元环化合物；

■饱和6–元环化合物；或

■在4位含有1个选自氧、氮和硫的杂原子的饱和6–元杂环化合物；

c)R₄为被以下基团取代的1至6个碳原子的直链或支链烷基：

■苯基；或

■被以下基团取代的苯基：

-一个或多个选自氟或溴的卤素；

-苯基或噻吩基；

d)R₅为羟基。

优选的化合物具有式(1)，其中：

–R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；或

–R₂＝iBu；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；或

–R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₃；R₃＝CH₃；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝C₂H₅；R₃＝C₂H₅；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₅H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₆H₁₀；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₉H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₆H₁₀；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₅H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₉H₈；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)。

在特别的实施方案中，本发明化合物具有式(1)，其中R₁选自–CH₂CH₂SCH₃、–CH₂CH₂CH₂CH₃、–CH₂CH₂SOCH₃。

在优选的实施方案中，本发明化合物具有式(1)，其中R₁选自–CH₂CH₂SCH₃、–CH₂CH₂CH₂CH₃、–CH₂CH₂SOCH₃、和

–R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；或

–R₂＝iBu；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；

–R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₃；R₃＝CH₃；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝C₂H₅；R₃＝C₂H₅；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₅H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₆H₁₀；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₉H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₆H₁₀；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₅H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝C₉H₈；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)。

在其它实施方案中，本发明化合物具有式(1)，其中：

–R₁＝CH₂CH₂SCH₃；R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；

–R₁＝CH₂CH₂CH₂CH₃；R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；

–R₁＝CH₂CH₂SOCH₃；R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；

–R₁＝CH₂CH₂CH₂CH₃；–C(R₂R₃)–＝环己基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；

–R₁＝CH₂CH₂SCH₃；–C(R₂)(R₃)–＝环己基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；或

–R₁＝CH₂CH₂CH₂CH₃；–C(R₂)(R₃)–＝环己基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；

并且R和R₅如上所述。

在本发明特别的实施方案中，本发明化合物具有式(1)，其中R为氢或R为R’C(O)OCH(R”)OC(O)–基团，其中R’为异丙基且R”为甲基，并且R₁、R₂、R₃、R₄和R₅如上所述。

本发明化合物可以被用作药物。更特别地，所述化合物可以被用于制备药物组合物，所述药物组合物包含至少一种如上所述的化合物作为活性成分和至少一种药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂根据所需施用的剂型和模式选自本领域技术人员公知的典型赋形剂。

由于本发明化合物共同抑制导致脑啡肽降解的酶活性，它们增加了脑啡肽细胞外内生的速率，因此证明可以有效镇痛和/或抗抑郁。所述化合物的镇痛作用出现于各种急性或慢性疼痛例如神经源性疼痛、神经性疼痛、神经炎症疼痛或伤害性疼痛，或者一般疼痛例如纤维肌痛。疼痛的例子包括机械性疼痛(例如肌肉痛、血管局部缺血)、幻肢痛、带状疱疹引起的疼痛、与癌症本身或其治疗结果有关的癌症疼痛、与炎症性疾病相关的疼痛(例如关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、痛风)、与I型糖尿病有关的疼痛、与偏头痛、面部神经痛有关的疼痛、头痛、与外周神经损伤有关的疼痛(例如术后)、背部神经痛、牙痛、与烧伤、晒伤、蚊虫叮咬或蜇伤有关的疼痛、与感染、代谢性疾病(糖尿病、酒精中毒)、神经压迫(疝气、腕管、纤维化……)、骨折、烧伤、血肿、割伤和炎症有关的疼痛。

最后，典型地和有利地，本发明化合物没有吗啡物质的主要缺陷(耐受、身体依赖、呼吸抑制、恶心、镇静、便秘……)。

因此，本发明化合物和包含其的药物组合物可以用于选自以下用途的至少一种用途：镇痛、抗焦虑、抗抑郁或抗炎。

本发明还涉及如上所定义的式(I)化合物及包含其的药物组合物在制备镇痛、抗焦虑、抗抑郁或抗炎药物中的用途，更特别地在制备治疗疼痛的药物中的用途。所述疼痛可以尤其是如上所定义的慢性或急性疼痛。

本发明化合物可以单独使用或与已知具有镇痛性质的化合物联合使用。这种联合使得药理作用增强，已知高剂量的镇痛化合物通常具有不良的副作用。

以往通过将化学结构不同于本发明混合抑制剂的混合抑制剂与已知镇痛化合物联合显示了这种药理作用的增强(协同作用)。因此，例如与吗啡(MasNieto等人(2001)Neuropharmacol.41，496–506、THC(Valverde等人(2001)Eur.J.Neurosci.，13，1816–1824)、加巴喷丁(Menendez等人(2007)Eur.J.Pharmacol.，596，50–55)及其类似物如普瑞巴林联合获得了强的镇痛应答的增强。这些联合使得对于等价的药理作用能够降低3至10倍的组合成分(例如吗啡和抑制剂)的剂量。

因此，在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种本发明化合物与至少一种镇痛剂联合作为活性成分，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。所述镇痛剂可以选自：

–吗啡及其衍生物，

–内源性大麻素、Δ⁹THC、合成的大麻素受体激动剂或大麻素降解抑制剂(FAAH)，或

–GABA类似物，例如加巴喷丁或普瑞巴林，或

–度洛西汀，一种血清素和去甲肾上腺素重摄取抑制剂。

在另一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种本发明化合物与美沙酮联合作为活性成分，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含：

a)至少一种如上所定义的式(1)化合物，和

b)至少一种镇痛剂，例如选自吗啡及其衍生物、内源性大麻素、Δ⁹THC、合成的大麻素受体激动剂或大麻素降解抑制剂(FAAH)、或GABA类似物例如加巴喷丁或普瑞巴林、或度洛西汀，

其作为组合产品在疼痛特别是慢性或急性疼痛的治疗中同时、单独或连续使用。

以往，已经显示化学结构不同于本发明化合物的混合抑制剂与美沙酮联合使其能够协同增加各成分的作用(Le Guen等人(2003)Pain，104，139–148)。该联合降低阿片类和可卡因的成瘾过程。

根据本发明的药物组合物可以肠道外例如静脉注射或皮内、或局部、经口或经鼻施用。

可以肠道外施用的形式包括水性混悬液、等渗盐水溶液或无菌注射溶液，其可以含有药理学相容的分散剂和/或湿润剂。可以经口施用的形式包括片剂、软胶囊或硬胶囊、粉末剂、颗粒剂、口服溶液和混悬剂。可以经鼻施用的形式包括气雾剂。可以局部施用的形式包括贴剂、凝胶剂、霜剂、软膏剂、洗剂、喷雾剂、洗眼剂。

本发明化合物的有效剂量根据许多参数变化，例如所选择的的施用途径、所要治疗的病理的体重、年龄、性别、进展和所要治疗的个体的敏感性。

根据另一方面，本发明还涉及治疗如上所述的病理学的方法，其包括向需要其的患者施用有效剂量的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或根据本发明的组合物，优选肠道外、经口或经鼻施用。

可以两步制备混合NEP–APN抑制剂1。在第一步中，利用甲氧羰基磺酰氯活化Bocβ-氨基硫醇11(Fournié–ZaluskiM–C.等人(1992)J.Med.Chem.，35，2473–2481)，然后在第二阶段中与巯基烷酸10缩合得到化合物12。

通过酸12与相应的醇R₅OH反应或者通过酸12与氯化衍生物R₅Cl在Et₃N存在下在乙酸乙酯中回流获得酯13。

通过甲酸的作用进行13的N-末端Boc基团的脱保护，释放1。

可选地，可以通过甲酸的作用使N-末端Boc基团脱保护，然后在SOCl₂存在下于室温用相应的醇酯化，由12获得酯1。

可选地，可以通过甲酸的作用使N-末端Boc基团脱保护，然后在CH₃CN中在2NNaHCO₃存在下与1–((2,5–二氧代吡咯烷–1–基氧基)羰基氧基)乙基异丁酸酯缩合，由12获得N-保护的化合物1(R＝iPrCOOCH(CH₃)OCO)(Cundy等人(2004)J.Pharm.Exp.Therap.，311，315–323)。

可以5步由确定绝对构型，优选(R)的氨基酸2获得其中R₃＝H和R₅＝OH的式10化合物。

步骤1：

通过脱氨基-卤化反应将氨基酸2转化为溴化衍生物3，其结果通常保持构型(ClaesonG.等人(1968)Acta Chem.Scand.22，3155–3159；DuttaA.等人(1987)J.Chem.Soc.P erkin Trans.1，111–120)。

通过4–甲氧基–α–甲苯硫醇(PMBSH)的作用在碱性介质中通过构型翻转的亲核取代反应将溴化衍生物3转化为硫醚4。

步骤2：由4制备卤代甲基酮6

方法1：从4的混合酸酐(通过氯甲酸异丁酯和N–甲基吗啉的作用而制得)或者从酰氯(通过亚硫酰氯对4作用而制得)将化合物4转化为烯酮5。

然后通过在1,4-二氧六环、二乙醚或乙酸乙酯中鼓吹HCl气体或者HBr气体将烯酮5转化为卤代甲基酮6。

方法2：可选地，通过氯碘甲烷对于4的甲酯(在DMAP和EDCI存在下或者通过甲醇中乙酰氯的作用而制得)的作用在新鲜制备的LDA存在下可以获得氯甲基酮6(X＝Cl)(Chen等人(1997)Tet.Lett.38，18，3175–3178)。

步骤3

方法1：用NaI处理卤代甲基酮6，经历卤素交换，然后与二烷基丙二酸钠盐反应，获得化合物7。R₁₃可以为甲基、乙基或叔丁基。

通过溴化衍生物R₄Br对于前述丙二酸酯7的阴离子的作用(用NaH原位去质子化)引入取代基R₄。获得化合物8。

方法2：如果X＝Br，则也可以将取代基R4直接引入至卤代甲基酮6上。后者用NaI处理，经历卤素交换，然后与被取代的二烷基丙二酸钠盐反应，得到化合物8。

该反应保持了携带巯基的碳的构型。

步骤4

通过TFA的作用(当R₁₃为叔丁基时)或者通过皂化(当R₁₃为甲基或乙基时)将8的酯水解后，例如在甲苯中回流脱羧，得到化合物9。

步骤5

通过三氟乙酸中DTNP(2,2’–二巯基双(5–硝基吡啶))的作用，然后与TCEP(三(2–羧乙基)膦)反应(HarrisK.M.等人(2007)J.Pept.Sci.(2)，81–93)或者直接在三氟乙酸中在苯甲醚存在下于50℃加热，以2个阶段进行化合物9上巯基的脱保护，以得到巯基烷酸10。

其中R₂＝R₃＝烷基、R＝H和R₅＝OH的化合物10可以如下获得：为了得到氯代甲基酮6，将溴乙酸和4-甲氧基苄硫醇反应，然后双烷基化并转化为如上所述的氯代甲基酮6。

其中R₂和R₃成环的化合物10可以如下获得：通过使用4-甲氧基苄硫醇二硫化物(或者由该硫醇的另一种活化形式)的烷基化并转化为氯代甲基酮6由相应的酯(例如甲酯)直接制备氯代甲基酮6。

可选地，可以通过使用活化的4-甲氧基苄硫醇的烷基化，由相应的酯(例如甲酯)直接制备环状双生(géminée)氯代甲基酮6，且使用TMSN₂溶液转化为溴甲基酮6。

如上所述地进行余下的合成。

当R₄是4–溴苄基时，化合物9可以经历Suzuki反应以在苄基上引入芳香基团。

化合物9(当R₃＝H时)具有2个不对称中心，并且有4个立体异构体。当R₂＝R₃＝烷基或环时，化合物9仅具有一个不对称中心并且因此为2个立体异构体的混合物。

9脱保护后得到化合物10。

如果化合物9为手性，则可以通过使用手性胺例如α–甲基苄胺或去甲麻黄碱的选择性沉淀或者通过手性柱HPLC将其分离。

实施例

以下进一步阐明本发明，但其并不以任何方式限制于以下的实施例。

1.NEP–APN混合抑制剂的合成

1.1NEP抑制剂的合成

1.1.1步骤1：(R)–2–溴羧酸的合成

将(R)–构型的氨基酸(39.3mmol)溶解于50mL水中。于0℃，分别滴加KBr(3.5eq，31.8g)和然后的H₂SO₄(7.73mL)，同时保持温度在5℃以下。将混合物冷却至–10℃并且滴加溶解于17mL水中的NaNO₂(1.3eq,3.59g)。将混合物于–5℃搅拌2小时。

恢复至室温后，用CH₂Cl₂(2×50mL)萃取混合物。用H₂O、饱和NaCl洗涤有机相，Na₂SO₄干燥得到预期的(R)构型产物。

3a R₂＝CH₂Ph：淡黄色油；(产率：50％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH):0.62

NMR(法文缩写为RMN)(CDCl₃,200MHz):3.15–3.40(2H,dd)；4.69(1H,m)；7.20–7.40(5H,m)

3b R₂＝CH₂CH(CH₃)₂：油；(产率：82.5％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH)：0.49

NMR(CDCl₃,200MHz):0.90–1.0(6H,m)；1.55(2H,m)；2.40(1H,m)；4.29(1H,d)

3c R₂＝CH₂(4–Br–Ph)：淡黄色油；(产率：50％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH):0.62

NMR(CDCl₃,200MHz):3.15–3.40(2H,dd)；4.70(1H,m)；7.20–7.40(4H,m)

3d R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)：淡黄色油；(产率：60％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH):0.7

NMR(CDCl₃,200MHz):3.15–3.40(2H,dd)；4.70(1H,m)；7.20–7.60(9H,m)

(S)–2–(4–甲氧基苄硫基)羧酸的合成

在惰性气氛下，将4–甲氧基苄硫醇(4.2mL；30.06mmol,，1eq)溶解于70mL无水THF中，并加入1.1eq 60％NaH(1.33g；33.07mmol)。于室温搅拌混合物15分钟，然后使用滴管将溶解于30mL THF中的溴化衍生物3(1eq,30.06mmol)滴加入溴中。于室温搅拌混合物过夜。将混合物蒸发至干，然后吸收于AcOEt中。用H₂O、饱和NaCl洗涤有机相，Na₂SO₄干燥，减压下蒸发以得到粗产物。后者通过硅胶色谱法纯化，使用CHex/AcOEt 5/5作为洗脱体系以得到油形式的(S)构型的化合物4。

4a R₂＝CH₂Ph：油；(产率：40％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH/9/1):0.5

NMR(CDCl₃,200MHz):2.80–3.10(2H,m)；3.68(2H,s)；3.76(3H,s)；4.53(1H,t)；6.84(2H,d)；7.09–7.49(7H,m)

4b R₂＝CH₂CH(CH₃)₂：油；(产率：26％)；Rf(CHex/AcOEt):0.65

NMR(CDCl₃,200MHz):0.90–1.0(6H,m)；1.55(2H,m)；2.25(1H,m)；3.40(1H,d)；3.70(2H,s)；3.90(3H,s)；6.8–6.9(4H,m)

4c R₂＝CH₂(4–Br–Ph)：油；(产率：40％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH/9/1):0.5

NMR(CDCl₃,200MHz):3.0–3.30(2H,m)；3.60(1H,q)；3.70(2H,s)；3.90(3H,s)；6.80–7.20(8H,m)

4d R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)：油；(产率：50％)；Rf(CH₂Cl₂/MeOH/9/1):0.6

NMR(CDCl₃,200MHz):3.0–3.30(2H,m)；3.60(1H,q)；3.70(2H,s)；3.90(3H,s)；6.80–7.2(13H,m)

1.1.2步骤2：

程序1：

方法1：由混合酸酐合成重氮酮

在惰性气氛下，于–20℃，向酸4(18.5mmol)在20mL干燥THF中的溶液相继加入N–甲基吗啉(2.15mL；1.05eq)和iBuOCOCl(2.52mL；1.05eq)。于–20℃搅拌混合物5–10分钟，然后在硅藻土上过滤沉淀并用20mL THF洗涤。

于0℃将CH₂N₂的乙醚溶液(2.5eq)(由和KOH在卡必醇中预先制得)转移至活化的酯溶液中。溶液变为黄色。于室温搅拌混合物2小时。

方法2：由酰氯合成重氮酮

将酸4(14.5mmol)溶解于23mL无水CH₂Cl₂中。于室温加入SOCl₂(1.5eq；21.75mmol)并在惰性气氛下将混合物回流2小时。然后将混合物蒸发至干以得到棕色油。以5mmol/mL的浓度将产物溶解于无水THF中。

于0℃将预先制备的CH₂N₂(2.5eq)乙醚溶液转移至酰氯溶液中。溶液变为黄色。在惰性气氛下，于室温搅拌混合物2小时。

氯代甲基酮的合成

在惰性气氛下，将化合物5的溶液置于维持在0℃的三颈瓶中。于0℃通过鼓吹用HCl使混合物饱和。

30分钟后，减压下蒸发溶剂和过量的HCl。将产物吸收于AcOEt(150mL)中，然后用10％NaHCO₃、H₂O洗涤，并经Na₂SO₄干燥，以得到粗产物。后者未经纯化而原样用于下面的步骤。

程序2：由甲酯的合成

于0℃，在惰性气体下，将乙酰氯(3eq；2mL)滴加入50mL无水MeOH中的酸溶液4(9.1mmol)。于室温搅拌混合物过夜。减压下浓缩混合物，吸收于MTBE(甲基–叔丁基醚)(200mL)。用10％NaHCO₃(100mL)、H₂O(100mL)和饱和NaCl(100mL)洗涤有机相。经Na₂SO₄干燥有机相，然后减压下浓缩以得到粗品甲酯。通过硅胶闪式色谱法纯化后者。

经过30分钟，向甲酯(4.42mmol)和氯碘甲烷(1.3mL；4eq)在25mL THF中的溶液滴加LDA(5eq)的THF(55mL)溶液(由己烷(15mL)中1.6M BuLi新鲜制备)和二异丙基胺(3.4mL)。在添加过程中，维持反应内部温度在–70℃以下，并于–75℃维持10分钟。保持温度在–65℃以下，同时加入乙酸溶液(6mL在44mL THF中)以中和介质。然后用AcOEt萃取混合物。用10％NaHCO₃、10％柠檬酸、饱和NaCl洗涤有机相，然后减压下浓缩以得到粗产物，其原样用于下面的步骤。

6a R₂＝CH₂Ph；R₃＝H：橙色油；(产率：93.0％)；Rf(CHex/AcOEt 6/4):0.73

HPLC:Kromasil C18CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)60/40Rt:19.18min

NMR(CDCl₃,200MHz):2.85(1H,dd)；3.2(1H,dd)；3.55(1H,d)；3.6(2H,d)；3.7(3H,s)；4.1(2H,d)；6.7(2H,d)；7.2–7.4(7H,m)

6b R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H：橙色油；(产率：94.0％)；Rf(CHex/AcOEt 5/5):0.68

NMR(CDCl₃,200MHz):0.90–1.0(6H,m)；1.55(2H,m)；2.25(1H,m)；3.40(1H,d)；3.70(2H,s)；3.90(3H,s)；4.25(2H,d)；6.80(2H,d)；7.15(2H,d)

6c R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H：橙色油；(产率：85.0％)；Rf(CHex/AcOEt 6/4):0.80

NMR(CDCl₃,200MHz):2.85(1H,dd)；3.2(1H,dd)；3.55(1H,d)；3.6(2H,d)；3.7(3H,s)；4.1(2H,s)；6.7(2H,d)；7.2–7.4(6H,m)

6d R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H橙色油；(产率：90.0％)；Rf(CHex/AcOEt 6/4):0.73

NMR(CDCl₃,200MHz):2.85(1H,dd)；3.2(1H,dd)；3.55(1H,d)；3.6(2H,d)；3.7(3H,s)；4.1(2H,s)；6.7(2H,d)；7.2–7.5(11H,m)

双生氯代甲基酮的合成

在惰性气氛下，将溴乙酸(10g,72mmol)溶解于50mL MeOH中。于4℃，加入11mL(1.1eq)4–甲氧基苄硫醇并且滴加入氢氧化钠醇溶液(6.4g NaOH(2.2eq)在100mL MeOH中的溶液)。于室温搅拌混合物40分钟。减压下蒸发溶剂。将产物吸收于Et₂O(200mL)和350mL10％NaHCO₃中。酸化水相至pH＝1，然后用350mL Et₂O萃取。用H₂O(100mL)、饱和NaCl(100mL)洗涤有机相，并经Na₂SO₄干燥以得到15g粗白色固体(产率：98％)，其原样用于下面的步骤。

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度10–90％15min，Rt＝10.64min

NMR(CDCl₃,200MHz):3.0(2H,s)；3.75(3H,s)；3.75(2H,s)；6.80(2H,d)；7.20(2H,d)

在惰性气氛下，于4℃，将乙酰氯(1.5eq；7.6mL；106mmol)滴加于前述酸(70.8mmol)在150mL无水MeOH中的溶液中。于室温搅拌混合物过夜。减压下浓缩混合物，吸收于MTBE(甲基–叔丁基醚)(350mL)中。用0.5N HCl(2×100mL)、10％NaHCO₃(2×100mL)、H₂O(100mL)和饱和NaCl(100mL)洗涤有机相。经Na₂SO₄干燥有机相，然后减压下浓缩以得到甲酯。

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝5.24min

NMR(CDCl₃,200MHz):3.1(2H,s)；3.75(3H,s)；3.83(2H,s)；3.85(3H,s)；6.85(2H,d)；7.30(2H,d)。

在惰性气氛下，于–78℃，向溶解于5mL无水THF的前述酯(1g；4.4mmol；1eq)的溶液中滴加1M LiHMDS在THF(4.4mL；1eq)中的溶液。于–78℃搅拌混合物1小时，然后在惰性气氛下，于–78℃，加入衍生物RX(1eq)的溶液。恢复至室温，搅拌混合物3小时。再次将混合物冷却至–78℃并且加入1eq LiHMDS，然后加入1.5eq RX。恢复至室温，搅拌混合物4小时。然后将混合物分配于200mL 1N HCl和300mL AcOEt之间。经Na₂SO₄干燥有机相，然后减压下浓缩以得到粗产物，其通过硅胶色谱法纯化。

R₂＝CH₃，R₃＝CH₃：油(产率：44％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝7.39min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60(6H,s)；3.70(3H,s)；3.80(2H,s)；3.80(3H,s)；6.85(2H,d)；7.25(2H,d)

R₂＝C₂H₅，R₃＝C₂H₅：油(产率：55％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝9.72min

NMR(CDCl₃,200MHz):0.90(6H,t)；1.85(4H,m)；3.68(2H,s)；3.70(3H,s)；3.80(3H,s)；6.82(2H,d)；7.22(2H,d)

如4b中所述合成氯代甲基酮。

6e R₂＝CH₃，R₃＝CH₃：琥珀油

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝7.91min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60(6H,s)；3.55(1H,d)；3.60(2H,s)；3.80(3H,s)；4.45(2H,s)；6.7(2H,d)；7.2(2H,d)

6f R₂＝C₂H₅，R₃＝C₂H₅：琥珀油

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝10.04min

NMR(CDCl₃,200MHz):0.85(6H,t)；1.80(4H,q)；3.55(1H,d)；3.60(2H,s)；3.80(3H,s)；4.45(2H,s)；6.7(2H,d)；7.2(2H,d)

环状氯代甲基酮的合成

方法1：

在惰性气氛下，于–10℃将2.5M BuLi在己烷中的溶液(2.77mmol；1.1mL；1.2eq)加入至DIPA(二异丙基乙基胺)(3mmol；1.3eq；420μL)在THF(9mL)中的溶液。于0℃搅拌混合物1小时。于–55℃将新鲜制备的该LDA溶液滴加入环戊酸甲酯在5mL THF中的溶液。在惰性气氛下，于–55℃搅拌混合物1小时。加入HMPA(六甲基磷酰胺)(3.46mmol；1.5eq；610μL)并于相同的温度搅拌混合物10分钟。然后，于–55℃滴加4–甲氧基苄硫醇二硫化物(3mmol；1.3eq；920mg)在12mL THF中的溶液。恢复至室温后，搅拌混合物过夜。将混合物分配在10mL饱和NH₄Cl和20mL AcOEt之间。用饱和NH₄Cl(2×10mL)、饱和NaCl(2×15mL)洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥，然后减压下浓缩以得到粗产物，其通过硅胶色谱法纯化。

C(R₂R₃)＝环戊基：油(产率：40％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度30–90％10min，Rt＝9.68min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60–2.40(8H,m)；3.67(3H,s)；3.77(2H,s)；3.80(3H,s)；6.83(2H,d)；7.24(2H,d)

如4b中所述合成氯代甲基酮。

6g C(R₂)(R₃)＝环戊基：琥珀油

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度60–90％10min，Rt＝6.47min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60–1.80(8H,m)；3.54(2H,s)；3.80(3H,s)；4.47(2H,s)；6.78(2H,d)；7.22(2H,d)

6h C(R₂)(R₃)＝环己基：琥珀油

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝8.11min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.40–2.20(10H,m)；3.45(2H,s)；3.80(3H,s)；4.40(2H,s)；6.80(2H,d)；7.20(2H,d)

方法2：

在惰性气氛下，于–10℃，将2.5M BuLi在己烷中的溶液(16mmol；6.4mL；1.15eq)加入至DIPA(二异丙基乙基胺)(16.7mmol；1.2eq；2.34mL)在THF(10mL)中的溶液。于0℃搅拌混合物1小时。于–78℃，将新鲜制备的该LDA溶液滴加入苯基环戊酸甲酯在5mL THF的溶液中和HMPA(六甲基磷酰胺)(1.0eq；2.5mL)。在惰性气氛下，于–78℃搅拌混合物1小时。于–78℃，加入固态活化的4–甲氧基苄硫醇(18mmol；1.3eq；6.37mg)。于–78℃搅拌混合物1.5小时。将混合物分配于200mL 1N HCl和200mL AcOEt之间。用200mL AcOEt稀释有机相，用饱和NaCl(200mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，然后减压下浓缩以得到粗产物，其通过硅胶色谱法纯化。

C(R₂R₃)＝苯基环戊基(茚满基)：白色固体(产率：25％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝9.59min

NMR(CDCl₃,200MHz):2.90–3.70(6H,m)；3.55(3H,s)；3.65(3H,s)；6.60–7.10(8H,m)

将前述步骤的产物(1.13g；3.44mmol)溶解于14mL THF/MeOH混合物中。加入14mL2N NaOH并于室温搅拌混合物3小时。用40mL H₂O稀释混合物。减压下浓缩混合物。用1N HCl酸化水相，然后用MTBE(3×100mL)萃取，用饱和NaCl(100mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，然后减压下浓缩以得到白色固体(产率：98％)。

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝6.50min

在惰性气氛下，于0℃，在20μL DMF(0.2eq)存在下，向前述酸(1.38mmol；434mg)在10mL CH₂Cl₂中的溶液滴加草酰氯(2mmol；1.5eq；177μL)。允许混合物恢复至室温，然后于室温搅拌30分钟。

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝6.70min。

减压下蒸发后，在惰性气氛下，将酰氯吸收于无水CH₃CN(5mL)中，并于0℃滴加TMSCHN₂(1M在Et₂O中)(1.5eq；1mL)。允许混合物恢复至室温，然后搅拌1.5小时。然后用300μL(1.65mmol；1.2eq)乙酸中33％HBr捕获混合物。于室温搅拌混合物15分钟。减压下浓缩混合物，然后吸收于MTBE(200mL)中。用10％NaHCO₃(100mL)、饱和NaCl(50mL)洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥，然后减压下浓缩以得到棕色油形式的化合物6h(产率：83％)。

6h C(R₂R₃)＝苯基环戊基(茚满基)：白色固体

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝5.30min

NMR(CDCl₃,200MHz):2.90–3.70(6H,m)；3.65(3H,s)；4.15(2H,s)；6.60–7.10(8H,m)

1.1.3步骤3

方法1

在惰性气氛下，将980mg 60％NaH(1eq)加入至25mL(1mL/mmol)DME(1,2–二甲氧基乙烷)中的二烷基丙二酸酯(1eq)。于室温搅拌混合物1小时。

于室温，搅拌氯代甲基酮6(24.42mmol)和NaI(24.42mmol,3.66g,1eq)在50mL DME中的混合物15分钟，然后将其加入至新鲜制备的二烷基丙二酸钠盐溶液中。于室温搅拌混合物4小时。

在反应结束时，减压下蒸发溶剂。将产物吸收于二氯甲烷中。用水洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥。通过硅胶柱色谱法纯化产物，以CHex/AcOEt9/1作为洗脱体系。

7a1 R₂＝CH₂Ph，R₃＝H，R₁₃＝CH₂CH₃：橙色油；(产率：60％)；Rf(CHex/AcOEt9/1)：0.16

HPLC:Kromasil C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)80/20Rt:6.57min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.30(6H,t)；2.70–3.40(4H,m)；3.45(1H,t)；3.50(2H,d)；3.60(1H,t)；3.65(3H,s)；4.15(4H,q)；6.75(2H,d)；7.2–7.4(7H,m)

7a2 R₂＝CH₂Ph，R₃＝H，R₁₃＝tBu：橙色油；(产率：62％)；Rf(CHex/AcOEt9/1)：0.36

HPLC:Kromasil C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)85/15Rt:15.51min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.40(18H,s)；2.70–3.40(4H,m)；3.45(1H,t)；3.50(2H,d)；3.60(1H,t)；3.65(3H,s)；6.75(2H,d)；7.2–7.4(7H,m)

7b R₂＝CH₂CH(CH₃)₂，R₃＝H，R₁₃＝tBu：橙色油；(产率：30％)；Rf(CHex/AcOEt9/1)：0.49

HPLC:Kromasil C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)90/10Rt:6.49min

NMR(CDCl₃,200MHz):0.90–1.0(6H,m),1.40(18H,s)；1.55(2H,m)；2.15(1H,m)；3.19(2H,m)；3.40(2H,m)；3.50(2H,d)；3.80(3H,s)；6.75(2H,d)；7.2(2H,d)

7c R₂＝CH₂(4–Br–Ph)，R₃＝H，R₁₃＝tBu：橙色油；(产率：62％)；Rf(CHex/AcOEt9/1)：0.36

HPLC:Kromasil C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)85/15Rt:15.51min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.40(18H,s)；2.70–3.40(4H,m)；3.45(1H,t)；3.50(2H,d)；3.60(1H,t)；3.65(3H,s)；6.75(2H,d)；7.2–7.4(6H,m)

7d R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)，R₃＝H，R₁₃＝tBu：橙色油；(产率：60％)；Rf(CHex/AcOEt9/1)：0.36

HPLC:Kromasil C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)85/15Rt:16.71min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.40(18H,s)；2.70–3.40(4H,m)；3.45(1H,t)；3.50(2H,d)；3.60(1H,t)；3.65(3H,s)；6.75(2H,d)；7.2–7.5(11H,m)

7e R₂＝CH₃，R₃＝CH₃，R₁₃＝Et(产率：40％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝4.87min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.30(6H,t)；1.55(6H,s)；3.40(2H,d)；3.55(2H,s)；3.75(1H,t)；3.82(3H,s)；4.25(4H,q)；6.85(2H,d)；7.25(2H,d)

7f R₂＝C₂H₅，R₃＝C₂H₅，R₁₃＝Et(产率：30％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min然后90–50％，Rt＝11.56min

NMR(CDCl₃,200MHz):0.80(6H,t)；1.20(6H,t)；1.75(4H,m)；3.30(2H,s)；3.38(2H,d)；3.65(1H,t)；3.72(3H,s)；4.15(4H,q)；6.72(2H,d)；7.15(2H,d)

7g C(R₂)(R₃)＝环戊基，R₁₃：Et(产率：24％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度60–90％10min，Rt＝8.04min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.29(6H,t)；1.60–2.30(8H,m)；3.39(2H,d)；3.52(2H,s)；3.74(1H,t)；3.79(3H,s)；4.22(4H,q)；6.83(2H,d)；7.20(2H,d)

7h C(R₂)(R₃)＝环己基，R₁₃：Et(产率：33％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝7.76min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.29(6H,t)；1.60–2.30(10H,m)；3.45(2H,d)；3.50(2H,s)；3.75(1H,t)；3.80(3H,s)；4.25(4H,q)；6.85(2H,d)；7.20(2H,d)

7i C(R₂)(R₃)＝苯基环戊基(茚满基)，R₁₃：Et(产率：80％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝6.57min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.20(6H,t)；2.90–3.60(9H,m)；3.65(3H,s)；4.15(4H,q)；6.60–7.10(8H,m)

丙二酸酯的烷基化

向产物7在15mL DME(二甲氧基乙烷)中的溶液加入1.5eq 60％NaH。

于室温搅拌混合物1小时，然后加入溴化衍生物R₄Br(3eq)。于室温搅拌混合物过夜。

减压下蒸发溶剂，然后将混合物吸收于H₂O和AcOEt中。用H₂O洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥，然后减压下浓缩。

通过硅胶色谱法纯化产物，以CHex/AcOEt 9/1作为洗脱体系，以得到所需产物8。

8a R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8b R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；R₁₃＝tBu：橙色油

8c R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8d R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；R₁₃＝Et：橙色油

8e R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8f R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；R₁₃＝tBu：橙色油

8g R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝tBu：橙色油

8h R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝tBu：橙色油

8i R₂＝CH₃；R₃＝CH₃；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8j R₂＝C₂H₅；R₃＝C₂H₅；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8k C(R₂)(R₃)＝环戊基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8l C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

8m C(R₂)(R₃)＝苯基环戊基(茚满基)；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；R₁₃＝Et：橙色油

1.1.4步骤4

当R₁₃为甲基乙基时，将化合物8(0.585mmol)溶解于10mL EtOH中，并加入2N NaOH(6eq)。于室温搅拌混合物过夜。减压下蒸发乙醇。将产物吸收于水，并用Et₂O萃取。3N HCl酸化水相，并用Et₂O萃取。有机相经Na₂SO₄干燥，然后减压下蒸发以得到黄色油。

当R₁₃为叔丁基时，将产物8溶解于10mL CH₂Cl₂中并加入10mL TFA。于室温搅拌混合物2小时。减压下蒸发溶剂。将产物吸收于水中，并用Et₂O萃取。有机相经Na₂SO₄干燥，然后减压下蒸发以得到黄色油。

然后将得到的产物溶解于6mL甲苯中，并加热至150℃持续12小时。

减压下蒸发溶剂，以得到化合物9。

9a R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9b R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；橙色油

9c R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；橙色油

9d R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；橙色油

9e R₂＝CH₂CH(CH₃)₂；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9f R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；橙色油

9g R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9h R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9i R₂＝CH₃；R₃＝CH₃；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9j R₂＝C₂H₅；R₃＝C₂H₅；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9k C(R₂)(R₃)＝环戊基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9l C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

9m C(R₂)(R₃)＝苯基环戊基(茚满基)；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；橙色油

Suzuki反应

在惰性气氛下，将化合物9l(180mg；0.356mmol)溶解于2mL甲苯中。加入Pd(PPh₃)₄(11mg；3％mol)并于室温搅拌混合物5分钟。将苯硼酸(46mg；0.374mmol；1.05eq)加入至1mLMeOH中，然后加入500μL 2M Na₂CO₃。回流混合物1.5小时，然后减压下浓缩混合物。将反应混合物吸收于30mL Et₂O和30mL 1N HCl中。用20mL 1N HCl、10mL饱和NaCl洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥并减压下浓缩。通过硅胶色谱法纯化产物，以Hept/AcOEt 65/35作为洗脱体系，以得到所需产物9n。

9n C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；75mg橙色油(产率：47％)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝525.2

HPLC：Atlantis T3CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝8.60min

根据相同的方案获得以下化合物。

9o C(R₂)(R₃)＝环戊基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；橙色油(产率：25％)

ESI(–)：[M–H]^–＝487.2

HPLC：Atlantis T3CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝6.60min

9p C(R₂)(R₃)＝苯基环戊基(茚满基)；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；橙色油(产率：55％)

ESI(–)：[M–H]^–＝535.2

HPLC：Atlantis T3CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min，Rt＝7.45min

1.1.5步骤5

方法1：将步骤7的化合物9(0.53mmol)溶解于2.1mL BTFA(三(三氟乙酸)硼烷)(1M)(预先由BBr₃和TFA制备)中并于室温搅拌1小时。减压下蒸发溶剂并通过半制备HPLC纯化混合物。

10a R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph

ESI(+)：[M+H]⁺＝329

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)梯度60/90 30min内；Rt：7.50min

10b R₂＝iBu；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝372和374

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1TFA)梯度60/90 30min内；Rt：8.60min

10c R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝384

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)梯度60/90 30min内；Rt：10.52min

10d R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph

ESI(+)：[M+H]⁺＝406和408

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)梯度60/90 30min内；Rt：9.01min

10e R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝406和408

HPLC：Kromasil C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)80/20；Rt：6.23min

10f R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝482和484

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)梯度60/9030 min内；Rt：11.4min

方法2：在5eq苯甲醚(1.1mL)的存在下，将产物9c(2.03mmol)溶解于10mL TFA中。于50℃将混合物加热2.5小时。减压下蒸发溶剂并通过半制备HPLC纯化混合物以得到化合物10b。

10b R₂＝iBu；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝372和374

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)梯度60/9030min内；Rt：8.60min

方法3：在惰性气氛下，向化合物9c(0.447mmol；120mg)在4.5mL TFA的溶液中加入茴香硫醚(2.8eq；0.936mmol；110μL)，然后加入2,2’–二硫基双(5–硝基吡啶)(3eq；1.0mmol；417mg)，溶液变为橙色。于室温搅拌混合物1小时。于30℃减压下浓缩混合物。通过半制备HPLC纯化所形成的二硫化物，以得到146mg产物(产率：62％)。

将前述二硫化物溶解于CH₃CN(720μL)/H₂O(180μL)中。然后加入三(2–羧乙基)膦盐酸盐(1.2eq；96mg)，并于室温搅拌混合物10分钟。减压下蒸发溶剂，并通过半制备HPLC纯化化合物以得到10b。

如果存在手性，则该合成方案保持分子的手性。

10b R₂＝iBu；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝372和374

HPLC：ACE C18CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)60/90 30min内；Rt：8.60min

NMR(CDCl₃,200MHz):0.87(3H,d)；0.89(3H,d)；1.50–1.80(3H,m)；2.7–3.5(6H,m)；7.08(2H,d)；7.43(2H,d)

根据相同的方案获得以下化合物。

10g R₂＝CH₃；R₃＝CH₃；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝366和368

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)50/90 10min内；Rt：6.51min

NMR(DMSO d6,200MHz):1.45(3H,s)；1.47(3H,s)；2.7–3.2(5H,m)；7.18(2H,d)；7.50(2H,d)

10h R₂＝C₂H₅；R₃＝C₂H₅；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝394和396

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)70/90 10min内；Rt：3.9min

NMR(DMSO d6,200MHz):1.30(6H,t)；1.75(4H,q)；2.6–3.1(5H,m)；7.0(2H,d)；7.40(2H,d)

10i C(R₂)(R₃)＝C₅H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝370和372

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)60/90 10min内；Rt：5.0min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60–2.25(8H,m)；2.75–3.20(5H,m)；7.10(2H,d)；7.44(2H,d)

10j C(R₂)(R₃)＝C₆H₁₀；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝382和384

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)70/90 10min内；Rt：8.97min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60–2.40(10H,m)；2.75–3.20(5H,m)；7.10(2H,d)；7.44(2H,d)

10k C(R₂)(R₃)＝C₉H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝442和444

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)70/90 10min内；Rt：3.84min

NMR(CDCl₃,200MHz):2.70–3.50(5H,m)；3.60(2H,d)；3.70(2H,d)；7.10–7.6(8H,m)

10l C(R₂R₃)＝C₆H₁₀；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝383

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)70/90 10min内；Rt：5.35min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60–2.40(10H,m)；2.75–3.20(5H,m)；7.20–7.60(9H,m)

10m C(R₂R₃)＝C₅H₈；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝368和370

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)60/40；Rt：9.79min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.60–2.25(8H,m)；2.75–3.20(5H,m)；7.05–7.55(9H,m)

10n C(R₂)(R₃)＝C₉H₈；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)

ESI(+)：[M+H]⁺＝415

HPLC：Atlantis T3CH₃CN/H₂O(0.1％TFA)70/90 10min内；Rt：4.73min

NMR(CDCl₃,200MHz):2.70–3.50(5H,m)；3.60(2H,d)；3.70(2H,d)；7.10–7.8(13H,m)

1.2NEP–APN混合抑制剂的合成

1.2.1boc–β–氨基硫醇11的合成

按照J.Med.Chem.，35，1992，2473中描述的方案制备化合物。

11a R₁：CH₂CH₂SCH₃；白色固体

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min，Rt＝6.45min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.45(9H,s)；1.85(2H,m)；2.12(3H,s)；2.52(2H,t)；2.75(2H,dd)；3.90(1H,t)；4.80(1H,NH)

11b R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；白色固体

HPLC：ACE C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)30％–70％，Rt＝13.53min

NMR(DMSO d6,200MHz):0.95(3H,t)；1.20–1.60(6H,m)；1.40(9H,s)；2.30(2H,m)；3.40(1H,t)；6.80(1H,NH)

11c R₁：CH₂CH₂OCH₃；白色固体

HPLC：ACE C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)50％–50％，Rt＝5.58min

NMR(DMSO d6,200MHz):1.40(9H,s)；1.60(2H,m)；2.75–3.10(2H,m)；3.20(3H,s)；3.30(2H,t)；3.60(1H,m)；6.80(1H,NH)

11d R₁：CH₂CH₂OCH₂CH₃；白色固体

HPLC：ACE C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)40％–60％，Rt＝13.33min

NMR(DMSO d6,200MHz):1.10(3H,t)；1.40(9H,s)；1.60(2H,m)；2.60(2H,m)；3.10–3.30(2H,m)；3.30(2H,q)；3.60(1H,m)；6.80(1H,NH)

11e R₁：CH₂OCH₂CH₃；白色固体

HPLC：ACE C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)40％–60％，Rt＝14.00min

NMR(DMSO d6,200MHz):1.10(3H,t)；1.40(9H,s)；3.20–3.40(4H,m)；3.30(2H,q)；3.60(1H,m)；6.70(1H,NH)

1.2.2不对称二硫化物12的合成

在惰性气氛下，于0℃，将Boc–氨基硫醇11(9.86mmol,2.5g)溶解于20mL脱气MeOH中。加入Et₃N(2eq；2.79mL)，然后加入甲氧羰基磺酰氯(2eq,1.78mL)在20mL脱气CHCl₃中的溶液。于0℃搅拌混合物15分钟，然后加入100mL CHCl₃。用10％柠檬酸(2×100mL)、H₂O(100mL)、饱和NaCl(100mL)洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥并减压下浓缩。

在硅胶上纯化产物。

R₁：CH₂CH₂SCH₃；白色固体(产率：40％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min内，Rt＝3.66min

NMR(CDCl₃,200MHz):1.45(9H,s)；1.85(2H,m)；2.12(3H,s)；2.52(2H,t)；2.75(2H,dd)；3.90(1H,t)；3.90(3H,s)；5.0(1H,NH)

R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；白色固体(产率：41％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min内，Rt＝5.57min

NMR(CDCl₃,200MHz):0.90(3H,t)；1.34(4H,m)；1.45(9H,s)；1.62(2H,m)；2.99(2H,d)；3.78(1H,m)；3.90(3H,s)；4.77(1H,NH)

在惰性气氛下，将化合物10加入至前述化合物(0.754mmol,1eq)在8mL脱气CHCl₃的溶液中。将混合物冷却至–10℃，并加入脱气Et₃N(0.754mmol,105μl,1eq)。于–10℃搅拌混合物30分钟，然后用10mL CH₂Cl₂稀释。用10％柠檬酸(5mL)、饱和NaCl(2×10mL)洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥，以得到粗产物，其通过半制备HPLC纯化以得到化合物12。

12a–b R₁：CH₂CH₂SCH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)(产率：64％)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝644和646

12b–b R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)(产率：87％)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝626和628

12b–l R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)(产率：85％)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝637

12b–j R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Br–Ph)(产率：90％)

ESI(+)：[M+Na]⁺＝638和640

12a–l R₁：CH₂CH₂SCH₃；C(R₂R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(Ph–Ph)(产率：90％)

ESI(+)：[M+H]⁺＝632

1.2.3化合物1的制备

方法1

部分1：酯的合成

化合物13a–b–1：1–(乙氧羰基氧基)乙基2–(4–溴苄基)–5–(((S)–2–(叔丁氧羰基氨基)–4–(甲硫基)丁基)二硫基)–7–甲基–4–氧代辛酸酯

将化合物12a–b(640mg；1.03mmol)和Et₃N(730μL,5eq)溶解于10mL AcOEt中。于室温搅拌混合物15分钟。加入乙基–1–氯乙基羧酸酯(根据Barcelo等人Synthesis，1986，627制备)(800μL；5eq)和NaI(800mg,5eq)。回流混合物3小时。用10mL H₂O和20mL AcOEt稀释混合物。用3×30mL AcOE萃取水相。用10％柠檬酸(2×15mL)、10％NaHCO₃(2×15mL)、饱和NaCl洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥并减压下蒸发，以得到粗产物。通过半制备HPLC纯化混合物，以得到80mg黄色油。

13a–b–1 R₁：CH₂CH₂SCH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：CH(CH₃)OCOOC₂H₅(产率10.5％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70–90％10min内，Rt＝12.85min

ESI(+)：[M+Na]⁺＝760和762

化合物13b–b–1：2–(4–溴苄基)–5–(((S)–2–(叔丁氧羰基氨基)己基)二硫基)–7–甲基–4–氧代辛酸乙酯

在惰性气氛下，于4℃，将化合物12b–b(395mg；0.653mmol)溶解4.3mL CH₂Cl₂中。加入EDCI–HCl(138mg；0.718mmol；1.1eq)，然后加入DMAP(88mg；0.718mmol；1.1eq)和EtOH(0.784mmol；1.2eq)。于室温搅拌混合物4小时。用10mL 10％柠檬酸和20mL CH₂Cl₂稀释混合物。用10％柠檬酸(2×10mL)、10％NaHCO₃(2×10mL)、饱和NaCl洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥并减压下蒸发，以得到粗产物。通过半制备HPLC纯化混合物以得到黄色油。

13b–b–1 R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：C₂H₅(产率60％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度80–90％10min内，Rt＝12.20–12.65min

部分2：胺的脱保护

化合物1a–b–1：1–(乙氧羰基氧基)乙基5–(((S)–2–氨基–4–(甲硫基)丁基)二硫基)–2–(4–溴苄基)–7–甲基–4–氧代辛酸酯

在2mL HCOOH中搅拌化合物13a–b–1(130mg；0.176mmol)1小时。减压下蒸发混合物，以得到粗产物，通过半制备HPLC纯化粗产物以得到13mg化合物1a–b–1。

1a–b–1R₁：CH₂CH₂SCH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：CH(CH₃)OCOOC₂H₅(产率11％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度10–90％15min内，Rt＝14.50min

ESI(+)：[M+H]⁺＝638和640

化合物1b–b–1：5–(((S)–2–氨基己基)二硫基)–2–(4–溴苄基)–7–甲基–4–氧代辛酸乙酯

在2mL HCOOH中搅拌化合物13b–b–1(141mg；0.223mmol)1小时。减压下蒸发混合物，以得到粗产物，通过半制备HPLC纯化粗产物，以得到92mg化合物1b–b–1。

1b–b–1R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：C₂H₅(产率64％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50–90％10min内，Rt＝7.79min

ESI(+)：[M+H]⁺＝532和534

化合物1f–b–1：5–((2–氨基–4–(甲基亚磺酰基)丁基)二硫基)–2–(4–溴苄基)–7–甲基–4–氧代辛酸乙酯

1f–b–1R₁：CH₂CH₂SOCH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：C₂H₅(产率47.9％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度10–90％15min内，Rt＝12.45min

ESI(+)：[M+H]⁺＝566和568

方法2

在4mL HCOOH中搅拌化合物12(0.323mmol)1小时。减压下蒸发混合物，以得到粗产物，通过半制备HPLC纯化粗产物，以得到酸。

R₁：CH₂CH₂SCH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)(产率69％)

HPLC：ACEC18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)60/40％，Rt＝8.0min

ESI(+)：[M+H]⁺＝522和524

R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)(产率60％)

HPLC：Luna T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)60/40％，Rt＝2.83min

ESI(+)：[M+H]⁺＝514

R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Br–Ph)(产率69％)

HPLC：ACE C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)60/40％，Rt＝8.0min

ESI(+)：[M+H]⁺＝516和518

R₁：CH₂CH₂SCH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)(产率70％)

HPLC：Luna C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)50/50％，Rt＝5.43min

ESI(+)：[M+H]⁺＝532

在惰性气氛下，于0℃，将SOCl₂(30μL,6eq)加入至前述酸(0.068mmol)在400μL无水EtOH(R₅＝Et)的混悬液中。溶液变得澄清。于室温搅拌混合物过夜。减压下蒸发混合物，以得到粗产物，通过半制备HPLC纯化粗产物，以得到35mg预期产物。

1a–b–2R₁：CH₂CH₂SCH₃；R₂：iBu；R₃：H；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：C₂H₅(产率82％)

HPLC：ACE C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50/90％30min内，Rt＝11.98min

ESI(+)：[M+H]⁺＝550和552

1b–l–1R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)；R₅：C₂H₅(产率80％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70/90％10min内，Rt＝4.0min

ESI(+)：[M+H]⁺＝542

1b–j–1R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Br–Ph)；R₅：C₂H₅(产率85％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70/90％10min内，Rt＝3.28min

ESI(+)：[M+H]⁺＝546和548

1a–l–1R₁：CH₂CH₂SCH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)；R₅：C₂H₅(产率86％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度50/90％10min内，Rt＝8.42min

ESI(+)：[M+H]⁺＝560

1b–l–2R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)；R₅：CH₂Ph(产率71％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70/90％10min内，Rt＝5.71min

ESI(+)：[M+H]⁺＝604

方法3

化合物1b–l–3：2–(联苯基–4–基甲基)–4–(1–((2–((1–(异丁酰氧基)乙氧基)羰基氨基)(S)–己基)二硫基)环己基)–4–氧代丁酸

在10mL HCOOH中搅拌化合物12b–l(590mg；0.961mmol)1小时。减压下蒸发混合物，以得到粗产物，通过半制备HPLC纯化粗产物，以得到2个非对映异构体。

R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)(产率89％)

HPLC Dia 1：Luna C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)55/35％，Rt＝3.90min

HPLC Dia 2：Luna C18，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)55/35％，Rt＝4.10min

ESI(+)：[M+H]⁺＝522.2

将前述化合物(155mg,0.246mmol)溶解于2mL无水CH₃CN中。加入370μL2N NaHCO₃，然后加入1mL H₂O。于室温搅拌混合物10分钟，并且加入CH₃CN(1mL)中的1–((2,5–二氧代吡咯烷–1–基氧基)羰基氧基)乙基异丁酸酯(90mg；0.329mmol；1eq)(Cundy等人(2004)J.Pharm.Exp.Therap.，311，315–323)。于60℃搅拌混合物30分钟。减压下蒸发溶剂。将产物吸收于AcOEt、1N HCl中。洗涤有机相，经Na₂SO₄干燥，并减压下浓缩，以得到粗产物，通过半制备HPLC纯化粗产物，以得到预期产物。

1b–l–3dia 1R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)(产率85％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70/90％15min内，Rt＝10.50min和10.80min

ESI(+)：[M+H]⁺＝672.1

1b–l–3dia 2R₁：CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)：C₆H₁₀；R₄：CH₂(4–Ph–Ph)(产率85％)

HPLC：Atlantis T3，CH₃CN(0.1％TFA)/H₂O(0.1％TFA)梯度70/90％15min内，Rt＝10.80min和11.10min

ESI(+)：[M+H]⁺＝672.1

2.抑制强度的测量

在特定荧光底物的存在下，在96孔板中进行测试。在Berthold Twinkle LS970B板阅读器中读取发射的荧光。然后使用GraphPad软件绘制抑制相对于抑制剂浓度的图，然后从Cheng Prusoff公式确定Ki：Ki＝IC₅₀/(1+(S/Km))。

对于2种靶酶的抑制强度如下确定：

-由前药1开始原位裂解N–和/或C–末端保护基和二硫键后

-由在前药合成中的中间体选择性抑制剂即化合物10(对于脑啡肽)和脱去胺官能团的11(对于APN)证实前述值。

脑啡肽酶(NEP)活性的抑制

以50mM Tris缓冲液(pH7.4)中200ng/mL的最终浓度，使用从兔子肾脏纯化的脑啡肽酶(AubryM.等人1987，Biochem.Cell.Biol.65，398–404)。将底物Dansyl–Gly–(NO₂)Phe–β–Ala(GoudreauN.等人(1994)Anal.Biochem.，219，87–95)(Km＝37μM)溶解于乙醇中，并以最终浓度20μM使用。于37℃，在50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中，用NEP-1预孵育增加浓度的抑制剂(10^–10至10^–3M)15分钟。然后加入底物并继续孵育60分钟。通过将孔板置于冰中10分钟淬灭反应。在荧光计中读取发射的荧光，其中λex＝355nm，λem＝535nm。结果呈现于下表中。

APN活性的抑制

通过使用L–Ala↓β–NA底物(50μM，Sigma Aldrich)测量氨肽酶N(APN)的抑制。使用重组人酶(Rh)(50ng/mL；R&D System)确定抑制强度。于37℃，在50mM Tris缓冲液(pH 7.4)中预孵育增加浓度的抑制剂(10^–10至10^–3M)30分钟。然后加入底物并于37℃继续孵育30分钟。通过将孔板置于冰中10分钟淬灭反应。在荧光计中读取发射的荧光，其中λex＝340nm，λem＝405nm。结果呈现于下表中。

化合物	R₁	Ki APN(nM)
			a	CH₂CH₂SCH₃	11±2
b	CH₂CH₂CH₂CH₃	13±2
			c	CH₂CH₂OCH₃	35±2
d	CH₂CH₂OCH₂CH₃	47±8
			e	CH₂OCH₂CH₃	55±10

3、药理学：热板试验

通过动物跳跃以逃避疼痛所需的时间(跳跃延迟)来测量置于52℃加热板上的小鼠的跳跃反射(Eddy，N.B等人J.Pharm.Exp.Therap.，1953，107，385–389)。

在溶解于乙醇/吐温80/水(1/1/8)混合物之后，将式(1a–b–1Dia 3)或(1b–l–1Dia

1)化合物静脉注射入雄性OF1小鼠(23–26g)(10mg/kg)中。

注射体积：10mL/kg

静脉注射10分钟后测量跳跃延迟时间。

以使用如下方程式的镇痛百分比表示结果：

镇痛％＝(测量的延迟时间–对照延迟时间)

(最大延迟时间–对照延迟时间)

最大延迟时间＝240秒

按照平均值±SEM表示结果。结果呈现于图1中。

Claims

1.一种通式(1)的化合物：

其中R为：

a)R为：

-氢；

b)R₁为1至6个碳原子的直链或支链烷基，其是未取代的或被–SOR”’或–SR”’基团取代，其中R”’为未取代的或被一个或多个卤素原子取代的1至6个碳原子的烷基；

c)R₂为：

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为1至6个碳原子的直链或支链烷基；或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■与芳香环稠合或非稠合的饱和5-元环化合物；

■饱和6-元环化合物；

d)R₄为：

■苯基，其为未取代的或被以下基团取代：

-一个或多个选自氟或溴的卤素；

-苯基或噻吩基；

e)R₅为：

-羟基；

-烷氧基–OR₁₀，其中R₁₀为：

■含有2至6个碳原子的直链或支链烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中R₂为1至6个碳原子的直链或支链烷基或被以下基团取代的1至6个碳原子的直链或支链烷基：

■苯基；

■被一个或多个选自氟或溴的卤素取代的苯基；

并且R₃为氢，或者

R₂和R₃相同且为1至6个碳原子的直链或支链烷基，或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■饱和5–元环化合物；

■与芳香环稠合的饱和5–元环化合物；

■饱和6–元环化合物。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中R₅为羟基。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中：

a)R₁选自–CH₂CH₂SCH₃、–CH₂CH₂SOCH₃、–CH₂CH₂CH₂CH₃；

b)R₂为1至6个碳原子的直链或支链烷基或者被以下基团取代的1至6个碳原子的直链或支链烷基：

■苯基；

■被一个或多个选自氟或溴的卤素取代的苯基；

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为1至6个碳原子的直链或支链烷基；或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

■饱和5–元环化合物；

■与芳香环稠合的饱和5–元环化合物；

■饱和6–元环化合物；或

c)R₄为被以下基团取代的1至6个碳原子的直链或支链烷基：

■苯基；或

■被以下基团取代的苯基：

-一个或多个选自氟或溴的卤素；

-苯基或噻吩基；

d)R₅为羟基。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中R₂为被以下基团取代的异丁基或甲基：

■苯基；

■在4位被选自氟或溴的卤素取代的苯基；

■在4位被苯基取代的苯基；

并且R₃为氢；或者

R₂和R₃相同且为甲基或乙基；或者

–C(R₂)(R₃)–一起为：

·饱和5–或6-元环基团；

■与芳香环稠合的饱和5–元环基团。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中R₄为一个碳的烷基，其被以下基团取代：

■苯基；

■在4位被选自氟或溴的卤素取代的苯基；

■在4位被苯基取代的苯基。

7.根据权利要求1所述的化合物，其中：

–R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；或

–R₂＝iBu；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Br–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂Ph；

–R₂＝CH₂Ph；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₂(4–Ph–Ph)；R₃＝H；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝CH₃；R₃＝CH₃；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–R₂＝C₂H₅；R₃＝C₂H₅；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

––C(R₂)(R₃)＝环戊基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝茚满基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；或

–C(R₂)(R₃)＝茚满基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)。

8.根据权利要求1所述的化合物，其中R₁选自–CH₂CH₂SCH₃、CH₂CH₂SOCH₃、–CH₂CH₂CH₂CH₃。

9.根据权利要求1所述的化合物，其中：

–R₁＝CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)–＝环己基；R₄＝CH₂(4–Br–Ph)；

–R₁＝CH₂CH₂SCH₃；C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)；

–R₁＝CH₂CH₂CH₂CH₃；C(R₂)(R₃)＝环己基；R₄＝CH₂(4–Ph–Ph)。

10.根据权利要求1至9任一项所述的化合物在制备药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述药物为镇痛药、抗焦虑药、抗抑郁药或抗炎药。

12.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1至9任一项所述的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其包含至少一种选自吗啡及其衍生物、内源性大麻素和内源性大麻素代谢物的抑制剂、GABA衍生物、度洛西汀或美沙酮的化合物。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述GABA衍生物为加巴喷丁或普瑞巴林。

15.根据权利要求12所述的药物组合物，其用于肠道外、局部、经口、或经鼻施用。

16.根据权利要求12所述的药物组合物在制备镇痛药、抗焦虑药、抗抑郁药或抗炎药中的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述药物组合物进一步包含至少一种选自吗啡及其衍生物、内源性大麻素和内源性大麻素代谢物的抑制剂、GABA衍生物、度洛西汀或美沙酮的化合物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中所述GABA衍生物为加巴喷丁或普瑞巴林。

19.根据权利要求16所述的用途，其中所述药物组合物用于肠道外、局部、经口、或经鼻施用。