CN104792899B - 一种hplc‑esi‑ms/ms法检测饲料中多种喹诺酮类药残的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HPLC‑ESI‑MS/MS法检测饲料中多种喹诺酮类药残的方法，采用常温超声的方法同时提取饲料样品中的多种喹诺酮类药物，并建立了高效液相色谱‑三重串联四极杆质谱检测饲料中多种喹诺酮类药残的方法，不仅可以极大地缩短样品预处理时间，而且检测方法的回收率和重复性均满足饲料中兽药分析要求，回收率均在95％以上，RDS在6％以内，检测限可达50μg/kg。本发明操作简单，检测灵敏度高，且结果可靠，可实现饲料中8种喹诺酮类药残的快速、低成本检测。
Description
技术领域
本发明属于分析测试领域，特别涉及一种HPLC-ESI-MS/MS法检测饲料中多种喹诺酮类药残的方法。
背景技术
喹诺酮类，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。常用药物有诺氟沙星、达氟沙星、环丙沙星等。此类药物对多种革兰阴性菌有杀菌作用，广泛用于泌尿生殖系统疾病、胃肠疾病，以及呼吸道、皮肤组织的革兰阴性细菌感染的治疗。随着我国畜牧业的飞速发展，以及全球生态环境不断恶化引起的各种动物疾病频发，使得广大养殖户开始大量应用药物防治疾病或作为饲料添加剂以促进动物生长。然而，动物在使用药物治疗后，药物的原形或其代谢产物可能蓄积、储存在动物的细胞、组织或器官中，形成“兽药残留”。
人类长期食用含较低浓度喹诺酮类药物的动物性食品、中成药保健食品等，容易诱导耐药性的传递，从而影响该类药物的临床疗效。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。此外，兽残超标食品的出口也将严重影响我国在国际贸易中的声誉，影响出口贸易的稳定健康发展。喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、硝基呋喃类等兽药在动物饲喂过程中应用广泛，是国内外重点检测和监控的兽药，也是国际贸易间设置技术壁垒的重要指标内容。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。美国食品药品安全管理局于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。我国也于2002年规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种喹诺酮类药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10～500μg/kg。
发明内容
本发明的目的在于：利用高效液相色谱-串联质谱开发了一种同时检测饲料中8种喹诺酮类药残的方法，该方法具有快速、准确、简便、灵敏度高，适用范围广等特点，完全满足饲料的检测要求，具有一定的推广应用价值。
为解决上述问题，本发明采用如下方案：
一种HPLC-ESI-MS/MS法检测饲料中多种喹诺酮类药残的方法，包括如下步骤：对经前处理后的待测样品进行正离子MRM扫描，以环丙沙星-D8为内标，采用C18色谱柱分离，以含甲酸的水–含甲酸的乙腈为流动相作梯度洗脱，对样品进行质谱检测。
进一步地，所述多种喹诺酮选自二氟沙星、达氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星中的至少一种；优选的为二氟沙星、达氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星和诺氟沙星。
进一步地，所述梯度洗脱条件为：0～3min，B相从10％变到30％B，3～6min B相从20％变为90％，8min停止，将B相变到10％，运行5min；流速：0.3mL/min，柱温：30℃；其中，A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的乙腈溶液。
进一步地，所述质谱检测条件为：电喷雾电离源正离子扫描ESI+，多反应监测模式MRM；干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力：2.8×105Pa，毛细管电压：4000V。
进一步地，所述待测样品的进样量为：5μL。
进一步地，所述前处理的步骤为：准确称取0.50g样品，加入5.00mL甲醇和水的混合溶液，震荡混匀后，超声30min，有机滤膜过滤。
进一步地，所述甲醇和水的混合溶液中，甲醇和水的体积比为1:1。
进一步地，所述质谱检测中，目标组分MRM模式下质谱分析参数如下：
本发明的有益效果：
1.本发明建立了一种同时检测饲料中8种喹诺酮类药残的方法，该方法具有快速、准确、简便、灵敏度高，适用范围广等特点，完全满足饲料的检测要求，具有一定的推广应用价值。
2.本发明所述的高效液相色谱-三重串联四极杆质谱检测饲料中8种喹诺酮类药残的方法，不仅可以极大地缩短样品预处理时间，而且检测方法的回收率和重复性均满足饲料中兽药分析要求，回收率均在95％以上，RDS在6％以内，检测限可达50μg/kg。
3.样品前处理方法更简单快捷。本发明的超声提取方法不仅可以大大缩短样品的前处理时间，而且可有效避免操作过程中引入干扰，提高检测的准确度；
4.样品检测时间缩短。本方法只需要8分钟即可完成检测，缩短了样品的检测时间。
附图说明
图1.八种喹诺酮类药残的MRM检测质谱图(100μg/L)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例用于说明本发明内容，而不是限定本发明内容。
实施例1
1实验部分
1.1仪器与试剂
实验中使用的主要仪器有：Agilent-1200型快速分离高效液相色谱(美国Agilent公司)，6410型三重串联四级杆质谱(美国Agilent公司)。色谱级甲醇(瑞典OceanPak公司)，色谱级甲酸(美国ROE科技公司)，色谱级乙腈(瑞典OceanPak公司)，哇哈哈饮用纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)。
1.2HPLC-MS/MS条件
1.2.1HPLC条件
色谱柱：Unitary C18(2.1mm×150mm，5μm，华谱新创科技有限公司)。流动相：A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序：0～3min，B相从10％变到30％B，3～6min B相从20％变为90％，8min停止；将B相变到10％，运行5min，以平衡系统，然后即可再次进样。流速：0.3mL/min。柱温：30℃，进样量：5μL。
1.2.2MS/MS条件
离子源：电喷雾离子源(+ESI)，采用正离子模式检测。干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力：2.8×105Pa，毛细管电压：4000V。采用多反应监测模式(MRM模式)，8种喹诺酮类药残的母离子及子离子参数见表1，MRM谱图见图1。
表1.目标组分MRM模式下质谱分析参数
2结果与讨论
2.1线性关系及检出限
取8种喹诺酮类对照品储备液，精确配制一系列不同质量浓度的混合标准溶液，浓度分别为1.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、200μg/L(内标环丙沙星-D8的浓度为100μg/L)，进样5.00μL检测，以各目标化合物定量离子峰面积与内标物峰面积的比值(Y)对被测组分的质量浓度与内标物浓度比(X)进行线性回归，得到回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2。
表2.八种目标化合物的保留时间、线性方程、相关系数和线性范围
2.2加标回收率
称取0.10g样品，各加入80.0μL 5.00μg/mL的8种喹诺酮的混标溶液，加入4.90mL甲醇/水(体积比50/50)溶液，加入50.0μL内标环丙沙星-D8(内标液浓度10.0μg/mL，加入后内标浓度100μg/L)，震荡混匀后，超声30min，有机滤膜(0.22μm)过滤，进样5.00μL检测，平行做5组，计算8种喹诺酮样品的平均回收率及相对标准偏差。
加标样品的检测结果见下表3所示。
表3.八种喹诺酮样品的回收率和精密度试验结果(n＝5)
3.结论
本发明采用常温超声的方法同时提取饲料样品中的8种喹诺酮类药物，并建立了高效液相色谱-三重串联四极杆质谱检测饲料中8种喹诺酮类药残的方法，不仅可以极大地缩短样品预处理时间，而且检测方法的回收率和重复性均满足饲料中兽药分析要求，回收率均在95％以上，RDS在6％以内，检测限可达50μg/kg。本发明操作简单，检测灵敏度高，且结果可靠，可实现饲料中8种喹诺酮类药残的快速、低成本检测。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (7)
1.一种HPLC-ESI-MS/MS法检测饲料中多种喹诺酮类药残的方法，其特征在于，包括如下步骤：对经前处理后的待测样品进行正离子MRM扫描，以环丙沙星-D8为内标，采用C18色谱柱分离，以含甲酸的水–含甲酸的乙腈为流动相作梯度洗脱，对洗脱液进行质谱检测；
所述梯度洗脱条件为：0～3min，B相从10％变到30％B，3～6min B相从20％变为90％，8min停止，将B相变为10％，运行5min；流速：0.3mL/min，柱温：30℃；其中，A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的乙腈溶液；
所述质谱检测条件为：电喷雾电离源正离子扫描ESI+，多反应监测模式MRM；干燥气：N2，干燥气温度：300℃，干燥气流速：10L/min，雾化压力：2.8×105Pa，毛细管电压：4000V。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多种喹诺酮选自二氟沙星、达氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星中的至少一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品的进样量为：5μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理的步骤为：准确称取0.50g样品，加入5.00mL甲醇和水的混合溶液，震荡混匀后，超声30min，有机滤膜过滤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲醇和水的混合溶液中，甲醇和水的体积比为1:1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测中，目标组分MRM模式下质谱分析参数如下：
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多种喹诺酮为二氟沙星、达氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星和诺氟沙星。
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