CN104789668A - 一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物 - Google Patents

一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于叶酸代谢水平评估的飞行质谱生物芯片及检测方法和试剂盒。一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。本发明针对该位点的基因芯片能揭示受检者在遗传方面叶酸代谢能力的高低，进而给予具有个性化的膳食建议，使得受检者维持在良好的健康水平。

Description

一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物
技术领域
本发明涉及一种用于叶酸代谢水平评估的飞行质谱生物芯片及检测方法和试剂盒。
背景技术
叶酸在新鲜绿叶蔬菜中含量最多，食物中的叶酸经过胆汁和小肠中的γ-谷氨基羧肽酶(γ-glutamyl carboxypeptidase)水解成蝶酰单谷氨酸和二谷氨酸始能吸收。吸收的叶酸以N5-甲基四氢叶酸的形式存在于血中，和白蛋白疏松结合运输，通过叶酸受体被摄取进入细胞内，在维生素B12依赖的蛋氨酸合成酶作用下形成四氢叶酸而发挥作用。四氢叶酸在体内转移"一碳基团"等过程中起辅酶作用。丝氨酸是一碳基团的来源，它和四氢叶酸作用形成N5。10-甲烯基四氢叶酸和甘氨酸；另一来源系在组氨酸分解代谢中的亚氨甲酰谷氨酸和四氢叶酸作用生成N5-亚氨甲酰四氢叶酸和谷氨酸。
MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。
甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合成酶(MTR基因编码)催化的，MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合成酶。
单核苷酸多态(SNP)，属于DNA多态性的一种，指DNA序列中发生频率大于1％的单碱基变异，包括单碱基转换，颠换，插入或缺失等变化。SNP作为一种常见的遗传变异，可能导致个体表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性，以及对环境因素和药物及治疗反应的差异。研究表明，MTHFR和MTRR基因缺陷的孕妇人群尤其需要补充叶酸，因此，检测孕妇人群的MTHFR和MTRR基因SNP位点，尤其是MTHFR C677T rs1801133、MTRR A1298Crs1801131、酸甲硫氨酸合成酶还原酶MTRR A66G rs1801394位点，可作为补充叶酸的个性化膳食建议依据。
MassARRAY基因分析技术基于MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离)飞行时间质谱技术。先通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒(10sec)强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。MALDI产生的离子用飞行时间(Time-of-Flight，TOF)检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。利用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开，推导出SNP分型。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物。第二个目的是提供一种用于叶酸代谢能力评估的检测方法。本发明的第三个目的是提供一种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片。本发明的第四个目的是提供一种用于叶酸代谢能力评估的试剂盒及其使用方法。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种用于叶酸代谢能力评估的检测方法，该方法检测rs1801131、rs1801133和rs1801394中至少一种，包括如下步骤：
1)以受检者样本DNA为模板，加入PCR扩增引物对以及单碱基延伸引物进行PCR扩增反应；
用于检测rs1801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
用于检测rs1801133的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
用于检测rs1801394的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
2)步骤1)的PCR扩增系统中加入SAP酶，消化PCR产物；
3)步骤2)的反应产物进行单碱基延伸反应；
4)步骤3)的单碱基延伸反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点。
作为优选，所述的步骤1)中，对提取的受检者样本DNA进行分光光度计定量和琼脂糖凝胶电泳，DNA浓度>10ng/μL，OD260/OD280>1.7，取电泳条带明亮清晰无拖带的样本进行后续操作；优选的，步骤1)所述的PCR扩增条件为：93～95℃预变性1.5～2.5min；93～95℃变性25～35S，55～58℃退火25～35s，70～73℃延伸45～75s，42～48个循环；再于70～73℃继续延伸4.5～6min；再优选，步骤1)中，反应体系中模板DNA的含量为1～4ng/μL，各引物的含量为80～150mM。
作为优选，所述的步骤2)所述的反应条件为：36～38℃保温35～50min，再于83～88℃反应4.5～6min。
作为优选，所述的步骤3)所述的单碱基延伸反应条件为：93～95℃预变性25～35S；延伸36～45个循环，每个循环的条件为：93～95℃预变性4～7s，50～53℃退火4～7S+78～83℃延伸4～7s共4～7次；再于70～73℃继续延伸2.5～4min。
作为最优选，所述的步骤1)所述的PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30S，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环；再于72℃延伸5min；
步骤2)的反应条件为：37℃保温40min，再于85℃反应5min；
步骤3)所述的单碱基延伸反应条件为：94℃预变性30S；延伸40个循环，每个循环的条件为：94℃变性5s，52℃退火5S+80℃延伸5s共5次；再于72℃继续延伸3min。
作为优选，所述的步骤4)中用树脂纯化延伸反应产物，并且步骤4)中，利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱进行分析。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片，该飞行质谱生物芯片包括样品分析物和质谱芯片基质，并且样品分析物与所述质谱芯片基质共结晶；
所述样品分析物包括用于叶酸代谢能力评估的目的基因、PCR扩增引物和单碱基延伸引物，所述目的基因对应的SNP位点包括rs1801131、rs1801133和rs1801394中的至少一种；
用于检测rs1801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
用于检测rs1801133的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
用于检测rs1801394的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种用于叶酸代谢能力评估的试剂盒，＝该试剂盒包括用于检测rs1801131、rs1801133和rs1801394中一种、两种或三种的PCR扩增引物及单碱基延伸引物；
用于检测rs1801131的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
用于检测rs1801133的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
用于检测rs1801394的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
上述的试剂盒的使用方法，该方法包括以下的步骤：
1)以受检者样本DNA为模板，加入试剂盒中的PCR扩增引物对以及单碱基延伸引物进行PCR扩增反应；所述的PCR扩增条件为：93～95℃预变性1.5～2.5min；93～95℃变性25～35S，55～58℃退火25～35s，70～73℃延伸45～75s，42～48个循环；再于70～73℃继续延伸4.5～6min；
2)步骤1)的PCR扩增系统中加入SAP酶，消化PCR产物；反应条件为：36～38℃保温35～50min，再于83～88℃反应4.5～6min；
3)步骤2)的反应产物进行单碱基延伸反应；条件为：93～95℃预变性25～35S；延伸36～45个循环，每个循环的条件为：93～95℃预变性4～7s，50～53℃退火4～7S+78～83℃延伸4～7s共4～7次；再于70～73℃继续延伸2.5～4min；
4)步骤3)的延伸反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点。
作为优选，所述的步骤1)所述的PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30S，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环；再于72℃延伸5min；
步骤2)的反应条件为：37℃保温40min，再于85℃反应5min。
步骤3)所述的单碱基延伸反应条件为：94℃预变性30S；延伸40个循环，每个循环的条件为：94℃变性5s，52℃退火5S+80℃延伸5s共5次；再于72℃继续延伸3min。
亚甲基四氢叶酸还原酶单核苷酸多态位点MTHFRC677Trs1801133、MTRRA1298Crs1801131、酸甲硫氨酸合成酶还原酶MTRRA66Grs1801394单独或协同作用时，与叶酸代谢能力相关。检测这些位点能揭示受检者在遗传方面叶酸代谢能力的高低，进而给予具有个性化的膳食建议，使得受检者维持在良好的健康水平。
上述方法和试剂盒有助于评估叶酸代谢能力水平，有针对性提供叶酸服用方案，有效进行产品早期干预。本发明技术方案的优点有:敏感性较高；直接检测分子量，不需要荧光标记；检测结果更直接准确；成本低。使用普通引物且可进行多重检测。完成同样数量的靶标检测；对临床样品需求量较低。
附图说明
图1为使用对照组1和2的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，所获得的Massarray分型图。其中a为对照组1，b为对照组2。
图2为使用如SEQ ID No.1～9的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，所获得的Massarray分型图。
具体实施方式
实施例1
使用Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega)或NucleoSpin Tissue(MN)等试剂盒或类似产品提取受检者组织、细胞、血样或口腔粘膜中的DNA，用分光光度计定量，并用琼脂糖凝胶电泳质检。基因组DNA电泳条带通常不小于20kb，DNA浓度>10ng/μL，OD260/OD280>1.7，取电泳条带明亮清晰无拖带的样本进行后续操作。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/mL，转移至384孔板，-20℃储存备用。
实施例2
1.分别使用如表1中所设计的PCR引物及单碱基延伸引物(SEQ ID No.1～9)，并用Sequenom公司Genotyping Tool及MassARRAY Assay Design软件设计2套引物作为平行对照(SEQ ID No.10～21)，针对SNP位点利用设计PCR引物及单碱基延伸引物(见表1)。实验组及对照组1、2的各序列如表2。
表1
表2序列表
SEQ ID No.1 ACGTTGGATGAGGAGCTGCTGAAGATGTGG
SEQ ID No.2 ACGTTGGATGTCTCCCGAGAGGTAAAGAAC
SEQ ID No.3 ACGTTGGATGCTTCACAAAGCGGAAGAATG
SEQ ID No.4 ACGTTGGATGCACTTGAAGGAGAAGGTGTC
SEQ ID No.5 ACGTTGGATGGAAAATCCATGTACCACAGC
SEQ ID No.6 ACGTTGGATGGATGAGGAGGTTTCTGTTAC
SEQ ID No.7 GAGCTGACCAGTGAAG
SEQ ID No.8 AGCGGCGTGATGATGAAATCG
SEQ ID No.9 CCACAGCTTGCTCACA
SEQ ID No.10 ACGTTGGATGAGGAGCTGCTGAAGATGTGG
SEQ ID No.11 ACGTTGGATGTCTCCCGAGAGGTAAAGAAC
SEQ ID No.12 ACGTTGGATGTTCTACCTGAAGAGCAAGTC
SEQ ID No.13 ACGTTGGATGAACGAAGACTTCAAAGACAC
SEQ ID No.14 ACGTTGGATGGAAAATCCATGTACCACAGC
SEQ ID No.15 ACGTTGGATGGATGAGGAGGTTTCTGTTAC
SEQ ID No.16 ACGTTGGATGAAGAATGTGTCAGCCTCAAA
SEQ ID No.17 ACGTTGGATGCTGAAGCACTTGAAGGAGAA
SEQ ID No.18 ACGTTGGATGCTTCACAAAGCGGAAGAATG
SEQ ID No.19 ACGTTGGATGCACTTGAAGGAGAAGGTGTC
SEQ ID No.20 ACGTTGGATGGATCTGCAGAAAATCCATGT
SEQ ID No.21 ACGTTGGATGCTATATGCTACACAGCAGGG
2.对样本DNA进行目的基因的PCR扩增:采用多重PCR扩增技术，每个反应总体积5μL，包含模板DNA 10ng。
(1)首先按表3配制4ul混合液，然后加入1uL(10ng/μL)模板DNA，用封膜将PCR板封上，轻微振荡混合，1000rpm离心1分钟。
表3   PCR混合液配置表
(2)用以下热循环程序进行PCR扩增反应：
94℃(2min)→[94℃(30S)→56℃(30S)→72℃(1min)]*45cycles→72℃(5min)→12℃(∞)
3.SAP反应
(1)配制2μL SAP酶反应液，用封膜将PCR板封上，轻微振荡混合，1000rpm离心1分钟
表4配制SAP酶混合液
成分 体积
纯水 1.53μL
SAP缓冲液(10x) 0.17μL
SAP酶(1.7U/μL) 0.30μL
总体积 2.00μL
(2)用以下热循环程序进行SAP反应：
37℃(40min)→85℃(5min)→12℃(∞)
4.延伸反应：
使用的试剂为Sequenom公司的CompleteGold Genotyping Reagent Set 384.
(1)PCR板每孔中加2μl延伸反应混合物，用封膜将PCR板封上，轻微振荡混合，1000rpm离心1分钟。
表5配制延伸反应混合液
(2)用以下热循环程序进行延伸反应：
94℃(30S)→{94℃(5S)→[52℃(5S)→80℃(5S)]*5cycles}*40cycles→72℃(3min)→12℃(∞)
5.样品分析物的树脂提纯:每个延伸反应产物用6mg Clean Resin树脂纯化。加16μL纯水到延伸产物中；将干燥后的树脂倒入延伸产物中，低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底。
6.样品分析物的共结晶及检测:将纯化产物移至384孔SpectroCHIP芯片上，上机测定。SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析,检测结果使用TYPER 4。0软件(sequenom)分型并输出结果。结果显示，发明者设计的引物分型图形效果要明显好于软件设计引物的分型效果。
实施例3
取实施例2步骤2获得的PCR产物使用ABI BigDye Terminator v3.1Cycle SequencingKit进行双脱氧链终止法测序，对分型结果进行验证。
不同位点分型方法比对方案：选取40个样本分别使用Massarray方法和DNA测序方法进行基因分型，比较两种方法检测结果的一致性。
(一)使用Massarray方法分型检测结果
表6使用飞行质谱方法分型检测结果
Massarray分型图：
采用序号为20的样本为模板，采用对照组1、2及SEQ ID No.1～9的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，结果如图1和图2。
1.使用软件自动设计的PCR引物和单碱基延伸引物(对照组1和2)进行检测，结果显示样本rs1801131和rs1801394分型信号值比较低，没有检测到rs1801133位点分型信号。如图1所示，其中a为对照组1，b为对照组2。
2.使用如SEQ ID No.1～9的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，结果显示待检样本3个SNP位点分型结果清晰准确，如图2。其他样本作为模板，分别用对照组1、2及SEQ ID No.1～9的PCR引物和单碱基延伸引物进行检测，结果同上，对照组分型信号值低或检测不到信号，采用SEQ ID No.1～9的引物检测，待检样本3个SNP位点分型结果清晰准确。
(二)使用DNA测序法进行分型检测结果
设计3对PCR引物扩增上述3个SNP位点所在片段，使用DNA测序法进行SNP分析，引物设计如下：
表7引物序列
检测结果显示，使用DNA测序法，上述40个样本的检测结果与实施例2使用飞行质谱方法分型检测结果一致(即表6)：
(三)检测结论
1.使用如SEQ ID No.1～9的PCR引物及单碱基延伸引物，检测结果清晰。
使用Sequenom公司Genotyping Tool及MassARRAY Assay Design软件自动设计的2套引物信号值(对照组1和2)低，其中一个待检位点始终无法检测到信号。
2.通过对40个样本的3个待检测SNP位点所在片段采取基因分型金标准-测序法进行验证，发现两种方法的SNP分型结果完全一致，即飞行质谱检测法准确率为100％。
<110>浙江博惠生物科技有限公司
 
<120>一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物
 
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gagctgacca gtgaag                                                     16
 
 
<210>  8
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<212>  DNA
<213>人工序列
 
<400>  8
agcggcgtga tgatgaaatc g                                               21
 
 
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<212>  DNA
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ccacagcttg ctcaca                                                     16
 
 
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acgttggatg aggagctgct gaagatgtgg                                      30
 
 
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<213>人工序列
 
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acgttggatg tctcccgaga ggtaaagaac                                      30
 
 
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<213>人工序列
 
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acgttggatg ttctacctga agagcaagtc                                      30
 
 
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<213>人工序列
 
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acgttggatg aacgaagact tcaaagacac                                      30
 
 
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acgttggatg gaaaatccat gtaccacagc                                      30
 
 
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acgttggatg gatgaggagg tttctgttac                                      30
 
 
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acgttggatg aagaatgtgt cagcctcaaa                                      30
 
 
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acgttggatg ctgaagcact tgaaggagaa                                      30
 
 
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acgttggatg cttcacaaag cggaagaatg                                      30
 
 
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acgttggatg cacttgaagg agaaggtgtc                                      30
 
 
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acgttggatg ctatatgcta cacagcaggg                                      30
 
 

Claims (1)

1.一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物，PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
CN201510169809.1A 2015-04-10 2015-04-10 一种叶酸代谢能力评估的检测位点rs1801394的检测PCR扩增引物和单碱基延伸引物 Pending CN104789668A (zh)

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