CN104782493A - 一种凤丹组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凤丹组织培养方法，凤丹(Paeonia ostii)为芍药科芍药属多年生小灌木牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）品种，集药、食、观赏为一体,尤其以其根皮中丹皮酚具有良好的临床应用和开发价值。植物组织培养技术是获得整齐一致材料的快捷途径，目前国内外对牡丹离体培养的研究己经有了一定的基础,但至今未能应用于生产实践。本发明以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种凤丹组织培养方法。
背景技术
凤丹(Paeonia ostii)为芍药科芍药属多年生小灌木牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）品种，集药、食、观赏为一体,尤其以其根皮中丹皮酚在镇痛、抗菌消炎、治疗心血管、肿瘤等疾病方面显示出较好的药理活性,同时,除用于医药制剂原料外,现还广泛应用于牙膏及护发、护肤、美容等日化产品的原材料,具有良好的临床应用和开发价值。
凤丹,实为牡丹品种,其具有药用价值的同时,也兼有观赏价值。关于牡丹的组织培养,国内的研究不少,但绝大部分的研究都是为了获得观赏型牡丹品种的无菌苗为目的。本发明以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
发明内容
本发明以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种凤丹组织培养方法，包括以下的步骤：
（1）外植体消毒处理：选择0.5g/L GA3处理2年生实生苗后新抽的新芽为外植体，先用洗衣粉水浸泡10～30min,再用自来水漂洗干净,然后置于超净台上,用75%酒精消毒30～60s,无菌水冲洗4～6遍后再用2.5 %次氯酸钠溶液消毒10～30min，消毒滤纸吸干水分后备用。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的新芽切取0.5cm左右长度的茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。
（4）丛生芽诱导：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况。
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1.0～3.0mg/L 6-BA+ 0.1～0.5mg/L NAA+0.1～0.5g/L LH+1～2g/L PVP+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L6-BA+0.1～0.2mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（4）所述的芽诱导培养基为：MS+0.5～1.0mg/LNAA+0.1～0.5mg/L6-BA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+1.0～5.0mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
本发明的优点是：以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
（1）外植体消毒处理：选择0.5g/L GA3处理2年生实生苗后新抽的新芽为外植体，先用洗衣粉水浸泡10min,再用自来水漂洗干净,然后置于超净台上,用75%酒精消毒30s,无菌水冲洗4遍后再用2.5 %次氯酸钠溶液消毒10min，消毒滤纸吸干水分后备用。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的新芽切取0.5cm左右长度的茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到76.9%。所述的诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+ 0.3mg/L NAA+0.4g/L LH+1g/L PVP+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.5。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为2.8。所述的芽诱导培养基为：MS+0.6mg/LNAA+0.3mg/L6-BA+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.8。
（4）丛生芽诱导：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率为64.9%。所述的芽诱导培养基为：MS+0.7mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到96%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.5mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.6。
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
实施例2
（1）外植体消毒处理：选择0.5g/L GA3处理2年生实生苗后新抽的新芽为外植体，先用洗衣粉水浸泡15min,再用自来水漂洗干净,然后置于超净台上,用75%酒精消毒40s,无菌水冲洗6遍后再用2.5 %次氯酸钠溶液消毒15min，消毒滤纸吸干水分后备用。
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的新芽切取0.5cm左右长度的茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照14小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到81.5%。所述的诱导培养基为：MS+1.8mg/L 6-BA+ 0.5mg/L NAA+0.5g/L LH+1.5g/L PVP+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.5。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖系数为3.1。所述的芽诱导培养基为：MS+0.9mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+27g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.8。
（4）丛生芽诱导：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率为59.8%。所述的芽诱导培养基为：MS+0.6mg/LNAA+0.3mg/L6-BA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率达到96%。所述的生根培养基为：1/2MS+2.5mg/LNAA+25g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.6。
炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。
Claims (5)
1.一种凤丹组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）外植体消毒处理：选择0.5g/L GA3处理2年生实生苗后新抽的新芽为外植体，先用洗衣粉水浸泡10～30min,再用自来水漂洗干净,然后置于超净台上,用75%酒精消毒30～60s,无菌水冲洗4～6遍后再用2.5 %次氯酸钠溶液消毒10～30min，消毒滤纸吸干水分后用；
（2）愈伤组织诱导：将步骤（1）消毒处理好的新芽切取0.5cm左右长度的茎段接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养,接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率；
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导培养得到的愈伤组织转接到增殖培养基中进行继代,接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况；
（4）丛生芽诱导：将步骤（3）继代得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养,接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况；
（5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根,接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持以凤丹新抽芽为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、增殖、丛生芽诱导、生根诱导等过程实验了凤丹的离体培养，为凤丹的工厂化生产和推广应用提供了技术支持；
（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天,移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理,移栽后经常喷水,保持空气湿度,植株成活后转入正常土壤中定植。
2. 根据权利要求1所述的一种凤丹组织培养方法，其特征在于步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+1.0～3.0mg/L 6-BA+ 0.1～0.5mg/L NAA+0.1～0.5g/L LH+1～2g/L PVP+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种凤丹组织培养方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L6-BA+0.1～0.2mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种凤丹组织培养方法，其特征在于步骤（4）所述的芽诱导培养基为：MS+0.5～1.0mg/LNAA+0.1～0.5mg/L6-BA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
5.根据权利要求1所述的一种凤丹组织培养方法，其特征在于步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+1.0～5.0mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
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