CN104770099A - 一种巫山淫羊藿的育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种巫山淫羊藿的育苗方法，属于中药材栽培技术领域。所述巫山淫羊藿的育苗方法包括以下步骤：步骤1，采集巫山淫羊藿种子并进行预处理；步骤2，对经过预处理的巫山淫羊藿种子进行变温层积处理；所述变温层积的条件为：将巫山淫羊藿种子于10℃放置12h，然后于20℃放置12h，交替进行上述过程；步骤3，利用含有氟啶酮的浸种液对巫山淫羊藿种子进行浸种；步骤4，对浸种后的巫山淫羊藿种子于3～6℃低温层积。采用本发明的方法，巫山淫羊藿种子发芽率、发芽势、发芽指数有显著提高，平均发芽时间显著降低。本发明操作简单，可控性强，具有高效解除巫山淫羊藿种子休眠并得到正常幼苗的作用。

Description

一种巫山淫羊藿的育苗方法

技术领域

本发明属于中药材栽培技术领域，具体是涉及一种巫山淫羊藿的育苗方法。

背景技术

巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.S.Ying为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属多年生阔叶植物，其药用部位为干燥的全株地上部，为《中华人民共和国药典》2010版所载品种，具有壮阳，治疗骨质疏松，袪风湿的功效，此外，其提取物在抗氧化，抗肿瘤、抗衰老，抗动脉粥样化、抗抑郁，增强免疫力等方面均疗效显著。在欧美国家，淫羊藿还被用于家庭观赏园艺作物。

自然条件下，巫山淫羊藿的繁殖方式是依靠地下根茎的无性繁殖以及种子繁殖(有性繁殖)，但是，巫山淫羊藿种子脱落后存活率低，具“蚁布”的分布特点，加之种子还具有深度形态生理休眠的特点，自然破眠时间长、破眠率低，其资源分布分散，种群小，不利于规模化繁育。

长期以来，巫山淫羊藿药材原料几乎全部依赖野生资源，随着国内外需求持续快速的增加，巫山淫羊藿野生资源受到严重破坏，并且这样的破坏还将持续。急需一种能够提高巫山淫羊藿种子发芽率，平均发芽时间显著降低的育苗方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供巫山淫羊藿的育苗方法，使巫山淫羊藿种子发芽率显著增加，克服巫山淫羊藿规模化育苗中的障碍。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种巫山淫羊藿的育苗方法，包括以以下步骤：步骤(1)，采集巫山淫羊藿种子并进行预处理；步骤(2)，对巫山淫羊藿种子进行变温层积处理；步骤(3)，利用含有氟啶酮的浸种液对经过变温层积处理的巫山淫羊藿种子进行浸种。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，包括以下步骤：

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，优选地，含有氟啶酮的浸种液由无菌水及氟啶酮及赤霉素组成，氟啶酮的质量浓度为0.2～5.0mg/L，赤霉素的质量浓度为100.0～500.0mg/L。更优选地，所述浸种液中氟啶酮的质量浓度为2.5mg/L，赤霉素的质量浓度为400.0mg/L。采用该浓度的氟啶酮和赤霉素可以有效提高巫山淫羊藿种子的发芽率，高达90％。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，优选地，步骤(3)中，将巫山淫羊藿种子与浸种液按质量/体积比为1:4的比例浸种24～72h，优选浸种温度20℃。更优选的所述浸种的时间为48h。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，优选地，步骤(2)所述变温层积处理包括以下步骤：

步骤201:经烘干、灭菌后的河沙按100重量份河沙加入20重量份无菌蒸馏水的比例混合制成含水河沙；优选的河沙烘干前，将河沙过40目方孔标准筛，除去石块与土块，用清水洗去河沙中夹杂的泥土，然后烘干。所述灭菌的操作是：将河沙进行120℃高温灭菌3h，冷却至室温。

步骤202，将经过预处理的巫山淫羊藿种子与含水河沙按照1:7～10的质量比混合拌种；

步骤203，将巫山淫羊藿种子及含水河沙于10℃放置12h，然后于20℃放置12h，交替进行上述过程进行变温层积30～180天，且变温层积过程中每15天捣种一次，并保持河沙含水量维持在20wt％。更优选地，203变温层积进行的时间为90天。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，优选地，含有氟啶酮的浸种液由氟啶酮和赤霉素的水溶液组成，所述浸种液中氟啶酮的质量浓度为2.5mg/L，赤霉素的质量浓度为400.0mg/L。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，优选地，还包括还包括步骤(4)：对浸种后的巫山淫羊藿种子于3～6℃低温层积，优选地，低温层积的时间为52～100天。浸种后的巫山淫羊藿种子于3～6℃低温层积具体的操作优选为将经浸种后的种子播种于0.5％琼脂培养基上，转入4℃条件低温层积，层积65d至73d。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，优选地，步骤(1)预处理包括以下步骤：

步骤101，在5～6月采集巫山淫羊藿蒴果，去除蒴果果皮及杂质，贮藏于10℃3～4天。

步骤102，清水冲洗，去除种子表面附着杂质，除去种子表面水分，进行消毒，获得巫山淫羊藿种子。

如上所述的巫山淫羊藿的育苗方法，步骤102消毒的具体过程为：对步骤101采集的巫山淫羊藿种子用1.0wt％次氯酸钠溶液消毒15～30mi n，然后用蒸馏水冲洗3～6次，再用体积分数为75％的酒精进行种子表面消毒10～50s，蒸馏水冲洗3～6次，去除种子表面水分。

本发明的有益效果是：

本发明的方法建立在变温层积的基础上，通过赤霉素与氟啶酮水溶液浸种，结合低温层积。其中，赤霉素是生产上广泛使用的促进种子休眠解除的调节剂，而氟啶酮作为一种ABA合成抑制剂，主要应用于除草剂中，由于氟啶酮易诱发白化苗的产生，现有技术中未有人将其应用于种子休眠解除工作中；本发明克服了现有技术的技术偏见，即赤霉素与氟啶酮均能促进巫山淫羊藿种子休眠的解除，两者存在显著的交互作用，得到了两者最佳浓度配比，得到了正常幼苗；采用本发明的方法，巫山淫羊藿种子发芽率、发芽势、发芽指数有显著提高，平均发芽时间显著降低。本发明操作简单，可控性强，具有高效解除巫山淫羊藿种子休眠并得到正常幼苗的作用，此法对巫山淫羊藿种质资源的保护具有积极意义，在生产应用中具有良好市场前景。

经变温层积后的巫山淫羊藿种子，种皮由绿色变为黑色，调节剂处理后，转入4℃条件，经73d，发芽率达到80％左右，经94d，发芽率可达90％左右。破眠种子转入发芽条件后，幼苗轻微失绿，不影响正常生长，可继续发育成正常植株。

附图说明

图1为巫山淫羊藿蒴果照片；

图2为变温层积前的巫山淫羊藿种子照片；

图3为变温层积90天的巫山淫羊藿种子照片；

图4为不同处理后巫山淫羊藿幼苗生长情况照片,图中标尺为5mm；

图5为本发明实施例提供的一种巫山淫羊藿的育苗方法流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的种子材料为巫山淫羊藿，所使用的试剂均可从商业途径获得。氟啶酮(Fluridone，买自Sigma公司，纯度≧99.9％，CAS：59756-60-4，赤霉素(GA)，买自国药集团，纯度≧90％，CAS：77-06-5。

本发明实施例提供一种巫山淫羊藿的育苗方法，包括以下步骤：

步骤1，采集巫山淫羊藿种子并进行预处理；

步骤2，对经过预处理的巫山淫羊藿种子进行变温层积处理；所述变温层积的条件为：将巫山淫羊藿种子于10℃放置12h，然后于20℃放置12h，交替进行上述过程；

步骤3，利用含有氟啶酮的浸种液对巫山淫羊藿种子进行浸种；所述浸种液中氟啶酮的质量浓度为0.2～5.0mg/L，赤霉素的质量浓度为100.0～500.0mg/L；

步骤4，对浸种后的巫山淫羊藿种子于3～6℃低温层积。

实施例1

如图1所示，本发明一种巫山淫羊藿的育苗方法，包括步骤1，巫山淫羊藿种子采集。5～6月份于贵州省黔南州龙里收集巫山淫羊藿蒴果，然后去除蒴果果皮，巫山淫羊藿种子保存于自封袋(10℃条件下)备用。

步骤2，巫山淫羊藿种子变温层积。

将河沙过40目方孔标准筛，除去石块与土块，用清水洗除河沙中泥土，烘干备用；拌种前先将沙进行120℃高温灭菌3h，冷却至室温后，用蒸馏水将河沙含水量控制至20wt％(100g沙加20ml蒸馏水并拌匀)；

使用1.0wt％次氯酸钠溶液对巫山淫羊藿种子消毒20mi n，蒸馏水冲洗4次，随后用体积百分比浓度为75％酒精溶液表面消毒30s，蒸馏水冲洗4次洗去酒精，去除种子表面水分；

将经过消毒的巫山淫羊藿种子与20wt％含水量的河沙按质量1:7的重量比混合，转入无光的变温条件(10/20℃，12/12h)下层积90天，层积过程中每15天捣种一次，并保持河沙含水量在20wt％。所述无光的变温条件是指10℃下12h，20℃下12h，10℃下12h，20℃下12h，重复交替进行。

步骤3，浸种处理

取出巫山淫羊藿种子与沙料的混合物，先经14目方孔标准筛分离出大部分粗沙，然后用40目方孔标准筛分离出大部分细沙，再用水洗去剩余的河沙，除去种子表面水分后即得到干净的变温层积后的巫山淫羊藿种子。

浸种液准备。母液配制：万分之一分析天平称取0.0100g氟啶酮(F)，溶于适量无水乙醇，蒸馏水定容至1L，得到10mg/L氟啶酮母液；称取1.0000g赤霉素(GA)，溶于适量无水乙醇，蒸馏水定容至1L，得到1000mg/L赤霉素母液；

不同浓度氟啶酮(F)与赤霉素(GA)混合溶液配制方法按下表操作：

混合溶液配制按F母液，GA母液，水顺序进行，以0.2:1.6:6.2为例，即将10mg/L氟啶酮母液0.2mL，1000mg/L赤霉素母液1.6mL混合，再加6.2mL蒸馏水定容至8.0mL。

将变温层积后的巫山淫羊藿种子与上述处理液按种子质量(g)：溶液体积(mL)1:4的比例在室温(20℃)下浸种48h，浸种过程中适时搅拌，保证浸种液充分渗入种子，浸种结束后蒸馏水清洗4次，除去种子表面水分，得到浸种后的巫山淫羊藿种子。

步骤5，低温层积及种子萌发率调查

培养基配制：称取5.0g琼脂粉于1L蒸馏水中，无菌透气封口膜封口，于高温灭菌锅中灭菌25min，灭菌结束后，转移至超净工作台中。本实施方案使用的培养皿为直径9cm的一次性培养皿，每个培养皿中加入20mL融化的琼脂，即得到0.5wt％琼脂培养基。

低温层积：将经上述浸种后的巫山淫羊藿种子转入0.5％琼脂培养基上，每皿50粒，重复3次，使用Parafilm封口膜密封培养皿，转入4℃冰柜中低温层积。

萌发调查：在低温层积第30天，第45天(以种子转入4℃时记为第0天)调查、记录各处理的发芽数(胚根突破种皮即认为萌发)及烂种数，从45天起每隔7天调查一次。调查过程在超净工作台中进行，每次调查时打开培养皿换气一次，并用镊子挑除发芽种子及烂种子，重新密封后转入4℃，操作过程应尽量迅速，少量多次地取出与放回培养皿种子，低温层积时间持续94天。

计算发芽率、发芽势、发芽指数、平均发芽时间、烂种率。

发芽率(GR)为发芽结束时(94天)发芽种子数占供试种子数的百分率；

绝对发芽率(AGR)为发芽结束时发芽数占未烂种子数的百分率。

发芽势(GE)为规定时间内(第66天)发芽种子数占供试种子数的百分率；

发芽指数(GI)＝ΣGt/Dt，其中，Dt为发芽日数，Gt指与Dt对应的每天发芽种子数；

平均发芽时间(MTG)＝ΣGt×Dt/N，其中，N为发芽结束时总发芽数；

四、数据处理与结果分析

表1为氟啶酮与赤霉素对巫山淫羊藿种子休眠影响方差分析结果

表1

由表1可知，对GI，MTG，GE，GR四个指标，氟啶酮、赤霉素的主效应(F和GA)及两者交互效应(F×GA)均显著(p＜0.05)。对于GI和GR，三者效应表现为F×GA(η²＝0.537＞·GA(η²＝0.465)＞·F(η²＝0.223)；对于MT和GE，三者效应表现为GA＞·F＞·F×GA。

表2为不同氟啶酮(F)赤霉素(GA)浓度组合对种子发芽率(GR)(第94天的发芽率)的影响

表2

注：不同小写字母表示同一行两数据间差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示同一列两数据间差异显著(p<0.05)。

以上结果表明，经变温层积3个月的巫山淫羊藿种子自然解除率可达到65.0％左右。在GA浓度大于200mg/L，F浓度大于2.5mg/L时，巫山淫羊藿种子萌发率显著提高，其中，F2.5GA400发芽率最高，接近90.0％，F2.5GA300，F5.0GA300次之。

根据发芽率结果，相比于F0GA0，F2.5GA300，F5.0GA300，F2.5GA400发芽率分别增加了26.54％，27.55％，33.68％，GA200，F0.5GA200，F1.0GA200，GA5.0GA200分别增加了22.46％，23.48％，21.43％，23.48％。

综上，F2.5GA400对巫山淫羊藿种子萌发促进作用最好，其次为F2.5GA300和F5.0GA300，GA200条件下F0，F0.5，F1.0，F5.0促进作用明显。

表3为不同氟啶酮(F)赤霉素(GA)浓度组合对淫羊藿绝对发芽率(AGR)(第94天的绝对发芽率)的影响

表3

注：不同小写字母表示同一行两数据间差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示同一列两数据间差异显著(p<0.05)。

绝对发芽率减去发芽率所得值为烂种率，以上结果表明，F0.5GA200，F5.0GA200，F2.5GA300，F5.0GA300，F2.5GA400，F5.0GA400绝对发芽率在90.0％左右，休眠解除率较高，而烂种率分别为8.09％，10.25％，9.86％，10.77％，4.29％，12.31％。可以看出，对于烂种率，F5.0>F2.5，在保证发芽率前提下，F2.5GA400烂种率最低。

对于绝对发芽率相比于F0GA0，F0.5GA200，F5.0GA200分别增加23.09％，26.09％；F2.5GA300，F5.0GA300分别增加28.28％，30.50％；F2.5GA400，F5.0GA400分别增加27.06％，22.47％。

综上，F2.5GA400为所有处理组合中的最佳处理，F5.0GA200，F2.5GA300，F5.0GA300效果次之。

表4为不同氟啶酮(F)赤霉素(GA)浓度组合对平均发芽时间(MTG)的影响

表4

注：不同小写字母表示同一行两数据间差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示同一列两数据间差异显著(p<0.05)。

以上结果表明，GA为0时，随着F浓度增加，MTG总体呈下降趋势；GA200条件下，当F2.5GA200，F5.0GA200平均发芽时间分别为1.48d和1.38d，两者差异不显著，但F5.0GA200显著低于其余各处组。

GA300时，各处理间差异不显著，F2.5GA300平均发芽时间最低，为1.51d；GA400条件下，F2.5GA400和F5.0GA400平均发芽时间分别为1.36d和1.50d，差异不显著，F5.0GA400平均发芽时间显著低于其他各处理组。

对于MTG，相比于F0GA0，F2.5GA200，F5.0GA200分别下降26.37％，31.34％；F2.5GA300，F5.0GA300分别下降24.88％，16.42％；F2.5GA400，F5.0GA400分别下降25.37％，32.34％。

综上，在GA浓度不为0时，F浓度为2.5或5.0时，可有效减少巫山淫羊藿种子平均发芽时间。所有处理中，F5.0GA400和F5.0GA200效应最佳，F2.5GA200，F2.5GA400，F2.5GA300次之。

表5为不同氟啶酮(F)赤霉素(GA)浓度组合对发芽势(GE)的(第66天的发芽势)影响

表5

注：不同小写字母表示同一行两数据间差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示同一列两数据间差异显著(p<0.05)。

以上结果表明，单独使用F不能显著增加巫山淫羊藿种子发芽势，但F与GA共同使用可以有效提高巫山淫羊藿种子的发芽势。所有处理组中，F2.5GA400发芽势最大，F5.0GA300其次，分别为80.00％，78.00％。

对于GE，相比于F0GA0，F2.5GA200，F5.0GA200分别增加73.24％，82.16％；F2.5GA300，F5.0GA300分别增加83.96％，108.95％；F2.5GA400，F5.0GA400分别增加114.30％，96.44％。

综上，在GA存在条件下，F为2.5mg/L或5.0mg/L时，可以有效提高巫山淫羊藿种子发芽势，F2.5GA400，F5.0GA400，F5.0GA300为最优处理，F5.0GA200，F2.5GA300，F2.5GA200次之。

表6为在不同氟啶酮(F)赤霉素(GA)浓度组合对发芽指数(GI)的影响

表6

注：表中不同小写字母表示同一行比较结果在P<0.05水平差异显著，不同大写字母表示同一列比较结果在P<0.05水平差异显著。

以上结果表明，除GA200外，F或GA单独使用时，巫山淫羊藿种子发芽指数均较小，两者共同使用时可有效增加GI值；GA200时，除F0.25外，其余各处理组GI值均较大。

对于GI，相比于F0GA0，F2.5GA400增加32.33％，F2.5GA300增加23.77％，F0GA200，F0.5GA200，F1.0GA200，F5.0GA200分别增加20.99％，22.91％，19.70％，22.91％。其中，F2.5GA400为最佳组合，其余几组次之。

综合GR，AGR，GE，MTG，GI数据，按处理效果选出5个最优处理方案，依次为F2.5GA400，F5.0GA300，F2.5GA300，F5.0GA200，F0GA200。

实施例2：幼苗性状观察

一、幼苗移植

调查发芽数时，挑出胚根突破种皮的种子，转移至0.5％琼脂培养基上，并在20℃，12h/12h光暗交替恒温箱中培养，观察不同处理后的幼苗特征。

二、幼苗观察

由图4可以看出，并非所有处理都能获得正常幼苗，由于氟啶酮对植物具有毒害作用，当超过一定浓度时，会引起植株发育不良的现象，如子叶无法突破种皮、心叶形成延迟或不形成，此外，高浓度的氟啶酮引起幼苗白化的现象，阻碍植株进行光合作用，最终不能形成正常植株。

对照(F0GA0)处理的巫山淫羊藿种子可以得到不失绿的正常幼苗，当氟啶酮浓度为5.0mg/L时，得到是白化幼苗，该幼苗无法正常生长；当氟啶酮浓度为2.5mg/L时，可得到部分失绿的幼苗，这样的幼苗可以正常生长，并形成正常植株。

结合不同调节剂组合对休眠解除效果及对幼苗性状的观察，F2.5GA400为所有组合中的最佳组合，其次为F2.5GA300。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)，采集巫山淫羊藿种子并进行预处理；步骤(2)，对巫山淫羊藿种子进行变温层积处理；步骤(3)，利用含有氟啶酮的浸种液对经过变温层积处理的巫山淫羊藿种子进行浸种。

2.根据权利要求1所述的巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，所述步骤(3)所述浸种液中氟啶酮的质量浓度为0.2～5.0mg/L，赤霉素的质量浓度为100.0～500.0mg/L。

3.根据权利要求2所述的巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，所述浸种液中氟啶酮的质量浓度为2.5mg/L，赤霉素的质量浓度为400.0mg/L。

4.根据权利要求1所述的巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，步骤(3)中，将巫山淫羊藿种子与浸种液按质量/体积比为1:4的比例浸种24～72h。

5.根据权利要求1所述的巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，步骤(2)所述变温层积处理包括以下步骤：

步骤201:经烘干、灭菌后的河沙按100重量份河沙加入20重量份无菌蒸馏水的比例混合制成含水河沙；

步骤202，将经过预处理的巫山淫羊藿种子与含水河沙按照1:7～10的质量比混合拌种；

步骤203，将巫山淫羊藿种子及含水河沙于10℃放置12h，然后于20℃放置12h，交替进行上述过程进行变温层积30～180天，且变温层积过程中每15天捣种一次，并保持河沙含水量维持在20wt％。

6.根据权利要求5所述的巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，步骤203变温层积进行的时间为90天。

7.根据权利要求1至6任一项所述的巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，还包括步骤(4)：对浸种后的巫山淫羊藿种子于3～6℃低温层积。

8.根据权利要求7所述的一种巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，步骤(4)中低温层积的时间为65～100天。

9.根据权利要求1至6任一项所述的一种巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，步骤(1)预处理包括以下步骤：

步骤101，在5～6月采集巫山淫羊藿蒴果，去除蒴果果皮及杂质，贮藏于10℃3～4天，

步骤102，清水冲洗，去除种子表面附着杂质，除去种子表面水分，进行消毒，获得巫山淫羊藿种子。

10.根据权利要求9所述的一种巫山淫羊藿的育苗方法，其特征在于，步骤102消毒的具体过程为：对步骤101采集的巫山淫羊藿种子用1.0wt％次氯酸钠溶液消毒15～30mi n，然后用蒸馏水冲洗3～6次，再用体积分数为75％的酒精进行种子表面消毒10～50s，蒸馏水冲洗3～6次，去除种子表面水分。