CN104762217A - 一株猪源产果香白地霉菌株及其制备的液体饲料诱食剂 - Google Patents

Abstract

本发明从健康母猪新鲜粪便中分离筛选得到的产果香白地霉菌株，菌株名称YSJY-25，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCC No.9061。利用该菌株液态发酵制备产香液体诱食剂，经气质联仪检测该液体饲料诱食剂能够产生异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯等果香物质。本发明获得菌株具有猪源宿主特异性，所制液体饲料诱食剂工艺方法简单，成本低廉，适于作为猪源饲料诱食剂和饲料添加剂。

Description

一株猪源产果香白地霉菌株及其制备的液体饲料诱食剂

技术领域

本发明涉及一株猪源产果香白地霉菌株及应用其制备的液体饲料诱食剂。

背景技术

我国GB10647-89标准中将能够改善饲料适口性、提高动物食欲和采食量而添加于饲料中的添加剂称为饲料诱食剂，也称饲料调味剂、风味剂、食欲增进剂。最早开始使用饲料诱食剂的是美国依阿华州大学D .V .Cat ron 博士等人，他们分别在猪、鸡饲料中添加一种能提高饲料适口性的物质后效果显著。1946年美国成立了饲料香味剂公司（FCA），1963年日本从FCA引进饲料香味剂并开始从仔猪香味剂着手自主研发，上世纪80年代欧美已普遍使用饲料诱食剂，90年代饲料诱食剂扩展到东欧、独联体和东南亚国家。我国饲料诱食剂的出现始于上世纪80年代末，90年代我国开始自己研发生产饲料诱食剂。

研究表明，动物对饲料风味的感受是通过其味觉和嗅觉来实现的。猪平均味蕾数15000个，高于人味蕾数9000个，人的嗅觉敏感度迟钝于猪许多，因此猪的味觉和嗅觉均比人的更加敏感。众所周知，动物采食量是决定动物生产性能优劣的主要因素之一，而猪摄食量的多少在很大程度上取决于猪饲料风味的好坏。在猪饲料中，为了营养均衡，添加了可能产生异味的物质，如某些微量元素、维生素及药物等；为了降低猪饲料的成本，饲料中添加了适口性差的的农副产品下脚料，如菜籽粕、棉籽粕、玉米胚芽饼等；猪在应激状态下，如断奶、生病、热应激、运输、惊吓等情况下，常出现摄食量下降。因此，为了在任何情况下保持猪正常的摄食量，向饲料中添加诱食剂是非常必要的。

诱食剂主要包括调味剂和香味剂，调味剂的成分包括芳香部分、味觉部分和味觉调整部分。香味剂是只具有芳香部分的添加剂。诱食剂按照制备方法分为天然、人工合成和复合型三类。按照剂型分为液体和固体两类，固体多为粉末状，又分为吸附型和微胶囊型两种。目前国内外生产大多是粉末状吸附型。

   猪用诱食剂主要分为两大类:仔猪饲料诱食剂和生长肥育猪饲料诱食剂。子猪天性偏爱母乳的气味，喜食具有奶香和甜味的饲料。因此，在子猪饲料中应首选具有奶香和甜味的饲料调味剂。1997年Makinde给刚断奶的仔猪饲喂带有诱食剂补料的饲料，发现与没有采食诱食剂补料的仔猪相比，具有良好的肠道发育形态和生长速度。泰国Kasetsart 大学研究人员用乳香味饲料饲喂仔猪，结果采食量增加7%，日增重提高8%。美国的研究也证明添加乳香调味剂可使仔猪采食量增加4.6%，增重提高11%。国内1992年杨加杰采用诱食剂后，仔猪9～30日的采食量比对照组多0.1～0.29kg/头，日增重提高了17%～25%，同时仔猪成活率也明显提高。1995年华中农业大学用含诱食剂乳香素的饲料饲喂仔猪，增重提高14.6%。1996年冯定远等在仔猪饲料中添加乳猪香，饲料采食量提高5.4%；在应激情况下，采食量提高9%～12%。与仔猪喜好相比，生长育肥猪在消化道发育、消化酶分泌及生理功能等方面已比较完善，适应力较强。生长育肥猪喜欢水果风味饲料，如柑橘风味等。生长肥育猪饲料诱食剂主要有甜乳香型、水果香型、甘草香型和谷实香型等。

   目前，国内饲料诱食剂主要是人工合成和复合型的固体剂型。如成都大地饲料有限公司生产的猪饲料诱食剂大帝香，其主要含有天然香料提取物、桔子油、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、甜味剂及增效剂等，具有鲜水果香味、并伴有青苹果的清香、口味甘甜。河北科瑞生物科技有限公司生产的科瑞香饲料诱食剂，主要成分为香兰素、乙基麦芽酚、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、椰子醛等，特点也是具有清新、自然的水果香气。国内饲料诱食剂中采用的香味剂几乎是人工合成的香精香料。

近年研究结果已知，食用香精对人体和动物的毒害有积累作用，体现在损伤生物有机体的生殖系统、肝脏、致癌性等方面。随着人类回归自然, 崇尚天然食品，对生物香精、香料的需求日益增加。但天然动植物香料由于原料生长周期长、数量有限，使天然香料的开发和应用受到限制。因此，利用微生物开发和生产天然香料物质，受到广泛关注。

  1975 年Gueguen 等发现白地霉可以水解蛋白质而形成香气化合物, 1982 年Koizumi 等证明了一些白地霉菌株可以产脂肪酸酯而形成特殊的水果香气。Daigle等用白地霉菌株ATCC 62217 发酵酵母废水( 含35%面包屑和65%水) 产香气化合物(菠萝香味)。2007 年王庆国等从新疆土壤中分离得到的两株产果香白地霉菌株，产香成分主要为酯类和p- 苯乙醇。

白地霉(Geotrichum candidum) 最初归属于霉菌, 丛梗孢科、地霉属，1983 年Barnett 等在其编写的《Yeasts: Characteristicsand Identification》一书中将其纳入酵母类群中。20 世纪50～70 年代国内出现白地霉的研究热潮。为了解决饲料中蛋白质不足问题，曾经用淘米水培养白地霉用于饲料喂养，收效良好。近年来白地霉在香气化合物、奶酪制作、污水处理以及饲料蛋白生产等方面的应用研究进展迅速。1992 年Nell 等利用南非石油煤气公司的一种酸性工业废水生产白地霉制品粗蛋白53.4%, 其中含赖氨酸1.63%、蛋氨酸1.14%。白地霉饲料营养价值高，一般白地霉饲料的粗蛋白50%～60%、粗脂肪3%～6%、无氮浸出物3%～10%、粗灰分8%～10%、钙3%～11%、磷0.01%～0.1%。何国庆利用小麦淀粉废水培养白地霉，生产单细胞蛋白产品中具有蛋白酶、糖化酶等多种消化酶。

   王志芳等用白地霉做发酵黄酒糟， 生产的白地霉酵母培养物，粗蛋白含量达40 .2% ,粗纤维2.9%,活菌总数52亿/g 。将此白地霉酵母培养物应用于育成猪饲喂试验，按0.5%比例添加, 白地霉试验组比对照组日增重提高了9.2% , 每增重1kg节省饲料0.25 kg，饲料利用率提高7.6%。

发明内容

目前市场上销售的猪用诱食剂都是采用人工合成的香精复配而成的，而利用微生物发酵制备饲料诱食剂还未见报道。本发明涉及利用一株猪源产果香白地霉菌株及其制备的一种液体饲料诱食剂。利用白地霉菌株发酵产生的天然果香风物物质刺激饲喂动物的嗅觉器官，诱食动物摄食，促进动物的消化液分泌及胃肠蠕动，引发食欲，增加采食量，提高动物生产能力。

    本发明中一株猪源产果香白地霉菌株及其制备的液体饲料诱食剂包括以下步骤：

   从健康母猪新鲜粪便中分离筛选得到一株产果香白地霉菌株YSJY-25。

该白地霉的菌落白色、扁平、圆形，边缘整齐或不整齐，菌丝短绒状或粉状，菌落中心突起，菌落从中心向四周呈放射状分布，有的菌落近外缘呈同心圆。

   该白地霉菌丝体在固体PDA培养基上成熟后可形成两端平切的长筒形孢子，单个或连成链状。

该白地霉菌株名称YSJY-25，分类命名为白地霉Geotrichum candidum，保存编号为CGMCC No.9061，保藏日期2014年4月16日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

   应用该产果香白地霉菌株经液态发酵可制备液体饲料诱食剂。将活化后的白地霉液体种子液接种于液体PDA培养基中，28℃～33℃摇床振荡培养或发酵罐通风培养18h～48h。无菌条件下向上述发酵液中添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌装入容器，加盖密封，即为含白地霉菌液、具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。或者将上述发酵液离心取上清液，无菌条件下添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌密封包装，即为具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。

该液体饲料诱食剂能够产生异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯等果香物质。

本发明所用白地霉菌株分离于健康母猪新鲜粪便，菌株具有宿主特异性，适于猪饲料添加剂的应用。液体饲料中含有的葡萄糖及白地霉产生的水果香气适合猪生长的生理特点，能够满足猪味觉和嗅觉对饲料诱食剂的要求。除此之外，含白地霉菌液的液体饲料诱食剂还能够增加饲料中菌体蛋白含量，其代谢产物中还包括蛋白酶、糖化酶等多种消化酶，白地霉培养物中还含有多糖、维生素、矿物质、多种氨基酸及促生长因子等。本发明利用猪源白地霉制备的液体饲料诱食剂是集营养、保健、诱食、香气于一体的绿色饲料添加剂。

附图说明

   图1是本发明的生产工艺流程图

 图2白地霉菌株YSJY-25基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

 图3白地霉菌株YSJY-25基因组PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

 图4是白地霉菌株YSJY-25平板菌落形态

 图5是白地霉菌株YSJY-25菌体显微镜镜下形态（400倍）

 图6是白地霉菌株YSJY-25制备的液体饲料诱食剂GC/MC总离子流图谱

 图7是白地霉菌株YSJY-25 5.8rRNA基因序列

 图8白地霉菌株YSJY-25 5.8rRNA基因序列比对结果。

具体实施方式

    从健康母猪新鲜粪便中分离筛选得到一株产果香白地霉菌株YSJY-25的方法如下。取新鲜母猪粪便放入无菌容器中，密封，冰盒保存，快速送入实验室进行常规菌种分离。分离平板培养基为PDA培养基，梯度稀释后，将涂布平板于30℃倒置培养2～3天，分别挑取若干个白地霉单菌落于PDA斜面培养基，30℃倒置培养2～3天，备用。

    将上述斜面菌株分别接入25ml/250ml瓶的PDA液体培养基各一菌环，30℃180rpm摇床培养16h，离心取上清液，测定蛋白酶活，取蛋白酶活力最高的菌株作为实验用菌株，定名为YSJY-25。

    平板菌落观察描述：菌落白色、扁平、圆形，边缘整齐或不整齐，菌丝短绒状或粉状，菌落中心突起，菌落从中心向四周呈放射状分布，有的菌落近外缘呈同心圆。

  斜面菌体显微镜下形态观察描述：菌丝长有隔，偶有分支，菌丝成熟后可形成两端平切的长筒形孢子，多呈单个，少数两三个连成链状。

    提取菌体基因组DNA：挑取一菌环斜面菌体接入2ml PDA液体培养基，30℃培养16h～18h，取1.5ml活化菌菌悬液， 12 000r /min 离心1 min，去上清液，收集菌体，按照酵母菌基因组DNA 提取试剂盒说明书上的方法提取酵母菌基因组DNA，－20℃保存备用。0.8%的琼脂糖凝胶检测提取的基因组DNA，凝胶成像系统观察拍照，见说明书附图。

    pcr扩增ITS间隔序列：

    引物： ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’， ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’。引物由上海生工合成。

   以提取的菌体基因组DNA为模板，25 μL 反应体系，PCR扩增程序：95℃ 预变性 3min。95℃变性2min，53℃退火35s，72℃延伸 1min，（34个循环），72℃ 补平 10min。4℃备用。上述PCR 产物经1.7%的琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳结束，凝胶成像系统观察拍照，见说明书附图。

    回收5.8S ITS区PCR扩增产物，送上海生工测序，测序结果见说明书附图。将测序结果在NCBI进行Blast比对，结合形态学特征，初步鉴定为白地霉。

[   产果香白地霉液体饲料诱食剂的制备过程。

  PDA培养基的制备：马铃薯去皮，切成小块，加入约6～8倍水，煮制15～20min，冷却过滤，上清液中添加2%的葡萄糖，溶解定容至马铃薯：水=1:5。

   白地霉种子培养液制备：取活化的白地霉斜面菌种，无菌条件下接入一菌环至已灭菌的20ml/300ml瓶的PDA液体培养基中，30℃180r/min16h～20h。

  将上述活化后的白地霉液体种子液以1%～10%接种量接种于50ml/500ml瓶无菌液体PDA培养基，28℃～33℃摇床振荡培养18h～48h。得到的发酵液中添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌装入容器，加盖密封，即为含白地霉菌液、具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。或者发酵液离心取上清液，无菌条件下添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌密封包装，即为具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。保质期3个月。

    将上述活化后的白地霉液体种子液以1%～10%接种量无菌条件下接种于5L发酵罐，罐压0.1MPa，，28℃～33℃通风搅拌培养18h～48h。得到的发酵液添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌装入容器，密封包装，即为含白地霉菌液、具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。或者将得到的发酵液离心取上清液，无菌条件下添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌密封包装，即为具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。保质期3个月。

   产果香液体饲料诱食剂的气质联仪分析，采用气相色谱-质谱联用仪对白地霉YSJY-25制备的产果香液体饲料诱食剂挥发性成分进行测定。

  1.气相色谱条件：

   色谱柱型号：VF 5ms(30m×0.25mm×0.25μm)；

   进样口温度：250℃；

   载气：He，99.999%；

初始温度40℃，保持3min，以4℃/min，升至150℃，保持1min，再以8℃/min升至250℃，保持6min。

2.质谱条件：

  质量分离器：离子阱；

  离子源：EI；

  电离能量：70eV；

    离子阱温度：220℃；

   传输线温度：280℃；

    溶剂延迟时间：1min；

   3.扫描方式：全扫描；

   扫描范围：50-500m/z；

4.检索谱库：NIST02

    5.检测的化合物主要为酯类。检测结果如表1所示。

   表1：GC/MS检测白地霉YSJY-25产果香液体饲料诱食剂挥发性成分及相对比例

Claims (10)

1.一株猪源产果香白地霉菌株，其特征在于：一株从健康母猪新鲜粪便中分离筛选得到的产果香白地霉菌株。

2.权利要求1中所述的猪源产果香白地霉菌株，其特征在于：菌落白色、扁平、圆形，边缘整齐或不整齐，菌丝短绒状或粉状，菌落中心突起，菌落从中心向四周呈放射状分布，有的菌落近外缘呈同心圆，菌丝体在固体PDA培养基上成熟后可形成两端平切的长筒形孢子，单个或连成链状。

3.权利要求1中所述的猪源产果香白地霉菌株，其特征在于：菌株名称YSJY-25，分类命名为白地霉Geotrichum candidum，保存编号为CGMCC No.9061，保藏日期2014年4月16日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4.权利要求1所述的一株猪源产果香白地霉菌株经液态发酵可制备产果香液体饲料诱食剂。

5.权利要求4中所述方法，其特征在于：将活化后的白地霉液体种子液接种于液体PDA培养基中，28℃～33℃摇床振荡培养18h～48h。

6.权利要求4中所述方法，其特征在于：无菌条件下向权利要求5中得到的发酵液添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌装入容器，密封包装，即为含白地霉菌液、具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。

7.权利要求4中所述方法，其特征在于：将权利要求5中得到的发酵液离心取上清液，无菌条件下添加已灭菌葡萄糖至终浓度2%～5%，溶解后混匀，无菌密封包装，即为具有果香气味的液体饲料诱食剂，4℃～7℃冷藏。

8.权利要求4中所述方法，其特征在于：该液体饲料诱食剂能够产生异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯等果香物质。

9.权利要求4中所述的产果香液体饲料诱食剂也包含采用发酵罐通风培养所获的液体饲料诱食剂。

10.权利要求1—9任意一项所述方法得到的液体饲料诱食剂。