CN104758332A - 徐长卿c21甾体转化产物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种徐长卿C21甾体转化产物及其在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的应用，转化产物中C21甾体苷元重量百分含量大于等于90%，逆转人胃癌多药耐药细胞、人结肠癌多药耐药细胞、人肺癌多药耐药细胞对临床常用药物紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂耐药作用，同时还提供徐长卿C21甾体转化产物制备方法，制备方法简便。本发明的徐长卿C21甾体转化产物与抗肿瘤药物联合应用于临床，提高化疗的疗效，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及徐长卿C21甾体转化产物及其在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的应用，还涉及徐长卿C21甾体转化产物制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一，它以细胞异常增殖和转移为特点。世界卫生组织统计资料表明，2000年全球新发恶性肿瘤病例约1000万，死亡620万，患病2200万例；预计到2020年恶性肿瘤新发病例将达到1500万，死亡1000万，患病3000万例。化疗是恶性肿瘤综合疗法的方法之一，广泛用于术前、术中和术后，但肿瘤细胞多药耐药现象严重影响化疗对恶性肿瘤的疗效。克服肿瘤药物的多药耐药，恢复耐药肿瘤细胞对药物的敏感性，寻找高效低毒的肿瘤细胞多药耐药逆转剂是当前肿瘤治疗药物的研究方向。
肿瘤细胞多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。肿瘤细胞多药耐药是肿瘤难治愈的主要原因之一，据美国癌症协会估计，90%的癌症化疗失败归因于多药耐药。
徐长卿系萝藦科Asclepiadaceae牛皮消属植物徐长卿Cynanchum paniculatum (Bge.) Kitag.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，为《中国药典》2010年版所收载，味辛，性温，具有祛风化湿，止痛止痒的功能，用于风湿痹痛，胃痛胀满，牙痛，腰痛，跌扑损伤，荨麻疹，湿疹。现代中医临床应用主要集中在镇痛和皮肤疾病等方面（张永清，等. 中医研究，2005，18（11）：55-58.），药理研究集中在其所含的化学成分丹皮酚上，研究表明丹皮酚具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗蛇毒、保护心血管和免疫调节等药理作用（曾粤. 内蒙古中医药，2012，31（11）：125-126.）。已有文献报道从徐长卿中分离鉴定C21甾体类化合物，但目前未见高含量徐长卿C21甾体转化产物的产品；未见有关徐长卿C21甾体转化产物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂方面的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，开发利用迄今为止应用尚不广泛的萝藦科牛皮消属植物徐长卿Cynanchum paniculatum (Bge.) Kitag.，尤其是其C21甾体类成分。
本案发明人通过对徐长卿进行细致深入的研究，发明了高含量徐长卿C21甾体提取物提取分离纯化方法，制得的提取物经药理活性研究证明具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用。在此基础上，本案发明人制备了徐长卿C21甾体转化产物，比较了徐长卿C21甾体提取物和徐长卿C21甾体转化产物逆转肿瘤细胞多药耐药作用，结果表明徐长卿C21甾体转化产物的逆转作用显著增强，因而完成了本发明。
本发明目的在于提供徐长卿C21甾体转化产物及其在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的应用。
本发明另一目的在于提供徐长卿C21甾体转化产物制备方法。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供的徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量大于等于90%，制备方法包括以下步骤：徐长卿干燥根和根茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为徐长卿干燥根和根茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为徐长卿干燥根和根茎重量的2倍体积量，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积徐长卿干燥根和根茎重量的1倍体积量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物。
本发明提供徐长卿C21甾体转化产物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的用途。
本发明的徐长卿C21甾体转化产物通过下列研究证明其具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用，徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量大于等于90%，通过下列方法得到的：徐长卿干燥根和根茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为徐长卿干燥根和根茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为徐长卿干燥根和根茎重量的2倍体积量，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积徐长卿干燥根和根茎重量的1倍体积量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物。
构建人胃癌多药耐药细胞株SGC-7901/VCR，采用MTT法测定人胃癌多药耐药细胞株对阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的耐药倍数分别为276.28倍、3.63倍和1.56倍；构建人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR，采用MTT法测定人结肠癌多药耐药细胞株对阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药倍数分别为273.66倍、4.05倍和2.92倍；构建人肺癌多药耐药细胞株A549/T，采用MTT法测定人肺癌多药耐药株对紫杉醇、阿霉素和顺铂的耐药倍数分别为7.16倍、5.30倍和2.14倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对5-氟尿嘧啶耐药作用：单独5-氟尿嘧啶对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为29.63±0.83 μg/ml；5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为0.42±0.12 μg/ml，逆转倍数为70.54倍；5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为1.67±1.53 μg/ml，逆转倍数为17.86倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对5-氟尿嘧啶耐药作用：单独5-氟尿嘧啶对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为31.87±1.49 μg/ml； 5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为0.31±0.05 μg/ml，逆转倍数为102.81倍；5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为0.37±0.06 μg/ml，逆转倍数为86.14倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对阿霉素耐药作用：单独阿霉素对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为145.04±9.64 μg/ml；阿霉素联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为0.84±0.13 μg/ml，逆转倍数为172.67倍；阿霉素联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为1.36±0.16 μg/ml，逆转倍数为106.65倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对顺铂耐药作用：单独顺铂对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为19.73±0.81 μg/ml；顺铂联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为1.19±0.04 μg/ml，逆转倍数为16.58倍；顺铂联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR半数抑制浓度为1.54±0.09 μg/ml，逆转倍数为12.81 倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对紫杉醇耐药作用：单独紫杉醇对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为41.15±1.04 μg/ml；紫杉醇联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为13.14±2.62 μg/ml，逆转倍数为3.13倍；紫杉醇联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为14.49±3.26 μg/ml，逆转倍数为2.84 倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对阿霉素耐药作用：单独阿霉素对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为107.75±5.79 μg/ml；阿霉素联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为22.39±2.65 μg/ml，逆转倍数为4.81倍；阿霉素联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为64.06±7.45 μg/ml，逆转倍数为1.68倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对顺铂耐药作用：单独顺铂对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为2.05±0.16 μg/ml；顺铂联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为0.26±0.08 μg/ml，逆转倍数为7.88倍；顺铂联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR半数抑制浓度为1.04±0.18 μg/ml，逆转倍数为1.97 倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对阿霉素耐药作用：单独阿霉素对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为2.97±0.03 μg/ml；阿霉素联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为0.92±0.11 μg/ml，逆转倍数为3.23倍；阿霉素联合徐长卿C21甾体提取物50μg/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为1.09±0.04 μg/ml，逆转倍数为2.72倍。
徐长卿C21甾体转化产物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对顺铂耐药作用：单独顺铂对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为2.63±0.12 μg/ml；顺铂联合徐长卿C21甾体转化产物50 μg/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为2.12±0.21 μg/ml，逆转倍数为1.24倍；顺铂联合徐长卿C21甾体提取物50 μg/ml对人肺癌多药耐药细胞株A549/T半数抑制浓度为2.30±0.16 μg/ml，逆转倍数为1.14倍。
因此，本发明的徐长卿C21甾体转化产物可用于制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂。
作为优选方案，徐长卿C21甾体转化产物用于制备胃癌多药耐药细胞耐5-氟尿嘧啶逆转剂。
作为优选方案，徐长卿C21甾体转化产物用于制备结肠癌多药耐药细胞耐5-氟尿嘧啶逆转剂。
作为优选方案，徐长卿C21甾体转化产物用于制备结肠癌多药耐药细胞耐阿霉素逆转剂。
作为优选方案，徐长卿C21甾体转化产物用于制备结肠癌多药耐药细胞耐顺铂逆转剂。
作为优选方案，徐长卿C21甾体转化产物用于制备肺癌多药耐药细胞耐紫杉醇逆转剂。
作为优选方案，徐长卿C21甾体转化产物用于制备胃癌多药耐药细胞耐顺铂逆转剂。
本发明提供萝藦C21甾体提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：徐长卿干燥根和根茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为徐长卿干燥根和根茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为徐长卿干燥根和根茎重量的2倍体积量，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积徐长卿干燥根和根茎重量的1倍体积量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物。
本发明还提供用本发明的徐长卿C21甾体转化产物以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。
本发明的含有徐长卿C21甾体转化产物的药物制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。
本发明徐长卿C21甾体转化产物的优点为其中C21甾体苷元重量百分含量大于等于90%，这是以前技术尚未报道的，由于含量高，从而提高了疗效。本发明徐长卿C21甾体转化产物的制备方法工艺简单，操作方便，技术易掌握，能耗小，溶剂可回收循环使用，生产成本低。
本发明的徐长卿C21甾体转化产物逆转人胃癌多药耐药细胞、人结肠癌多药耐药细胞、人肺癌多药耐药细胞对临床常用药物紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂耐药作用，这是以前技术尚未报道的，徐长卿C21甾体转化产物与抗肿瘤药物联合应用于临床，提高化疗的疗效，具有广泛的应用前景。
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不受限于具体实施例。
具体实施方式
实施例1
比色法测定徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量的方法
溶液的制备
对照品溶液的制备
精密称取白前苷元C对照品适量，加甲醇制成每1 ml含186.32 μg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备
取徐长卿C21甾体转化产物0.1 g，精密称定，加甲醇溶解，转移至50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取10 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
含量测定方法
精密吸取供试品溶液100μl，置具塞试管中，挥干溶剂，精密加入新鲜配制的浓硫酸-甲醇（6：1）5 ml，摇匀，置60℃水浴中加热60分钟，取出，立即置冰水中放置15分钟。以浓硫酸-甲醇（6：1）为空白，在420 nm的波长处测定吸收度，标准曲线法以白前苷元C计算C21甾体苷元的重量百分含量。
实施例2
取徐长卿（产地山东）干燥根和根茎粗粉300 Kg，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为2400 L，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为150 L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为150 L，用90%乙醇900 L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为600 L，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积为300 L，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物0.59 Kg，采用实施例1的方法测定徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量为94%。
实施例3
取徐长卿（产地广西）干燥根和根茎粗粉300 Kg，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为2400 L，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为150 L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为150 L，用90%乙醇900 L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为600 L，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积为300 L，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物0.68 Kg，采用实施例1的方法测定徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量为92%。
实施例4
取徐长卿（产地江苏）干燥根和根茎粗粉300 Kg，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为2400 L，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为150 L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为150 L，用90%乙醇900 L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为600 L，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积为300 L，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物0.77 Kg，采用实施例1的方法测定徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量为91%。
实施例5
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对阿霉素耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：取徐长卿（产地山东）干燥根和根茎粗粉300 Kg，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为2400 L，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为150 L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为150 L，用90%乙醇900 L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为600 L，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积为300 L，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物0.59 Kg。
徐长卿C21甾体提取物的制备：取徐长卿（产地山东）干燥根和根茎粗粉300 Kg，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为2400 L，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为150 L，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为150 L，用90%乙醇900 L洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得徐长卿C21甾体提取物0.84 Kg。
取对数生长期的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 μl/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度阿霉素的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度阿霉素的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度阿霉素的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=阿霉素IC50/阿霉素联合徐长卿C21甾体转化产物IC50或阿霉素联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表1。
表1 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物
逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对阿霉素耐药作用
实施例6
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对5-氟尿嘧啶耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 μl/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=5-氟尿嘧啶IC50/5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体转化产物或5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表2。
表2 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对5-氟尿嘧啶耐药作用
实施例7
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对顺铂耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 μl/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度顺铂的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度顺铂的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度顺铂的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=顺铂IC50/顺铂联合顺铂联合徐长卿C21甾体转化产物或徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表3。
表3 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR对顺铂耐药作用
实施例8
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对阿霉素耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 μl/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度阿霉素的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度阿霉素的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度25 μg/ml）和不同浓度阿霉素的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=阿霉素IC50/阿霉素联合徐长卿C21甾体转化产物或阿霉素联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表4。
表4 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对阿霉素耐药作用
实施例9
徐长卿C21甾体转化产物和逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对5-氟尿嘧啶耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 ul/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=5-氟尿嘧啶IC50/5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体转化产物或5-氟尿嘧啶联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表5。
表5 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对5-氟尿嘧啶耐药作用
实施例10
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对顺铂耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 ul/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度顺铂的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度顺铂的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度顺铂的培养基、加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=顺铂IC50/顺铂联合顺铂联合徐长卿C21甾体转化产物或徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表6。
表6 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人结肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR对顺铂耐药作用
实施例11
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对紫杉醇耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人肺癌多药耐药细胞株A549/T用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 ul/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度紫杉醇的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度紫杉醇的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度紫杉醇的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=紫杉醇IC50/紫杉醇联合徐长卿C21甾体转化产物或紫杉醇联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表7。
表7 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对紫杉醇耐药作用
实施例12
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对阿霉素耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人肺癌多药耐药细胞株A549/T用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 μl/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度阿霉素的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度阿霉素的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度阿霉素的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=阿霉素IC50/阿霉素联合徐长卿C21甾体转化产物或阿霉素联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表8。
表8 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对阿霉素耐药作用
实施例13
徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对顺铂耐药作用
徐长卿C21甾体转化产物的制备：同实施例5
徐长卿C21甾体提取物的制备：同实施例5
取对数生长期的人肺癌多药耐药细胞株A549/T用含10%FBS的PPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 个/ml，接种于96孔细胞培养板中，100 ul/孔，置于含有5%CO2的37℃恒温培养箱中培养24小时，然后在各孔中加入100 μl含有不同浓度顺铂的培养基、徐长卿C21甾体提取物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度顺铂的培养基、徐长卿C21甾体转化产物（终浓度50 μg/ml）和不同浓度顺铂的培养基，加药后继续培养48小时后，在各孔中加入20 μl浓度为5%的MTT，继续培养4小时，吸弃培养液，在各孔中加入DMSO，经微量混合振荡器振荡10分钟后，全自动酶联免疫检测仪于570 nm处测定吸光度值，计算抑制率和IC50，计算逆转指数=顺铂IC50/顺铂联合徐长卿C21甾体转化产物或顺铂联合徐长卿C21甾体提取物IC50。结果见表9。
表9 徐长卿C21甾体转化产物和徐长卿C21甾体提取物逆转人肺癌多药耐药细胞株A549/T对顺铂耐药作用
实施例14
徐长卿C21甾体转化产物用药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙。上述制备工艺均为本领域常规操作，在此不加赘述。
实施例18
徐长卿C21甾体转化产物为原料制得的药物制剂不仅包括单独使用徐长卿C21甾体转化产物的药物制剂，还包括添加徐长卿C21甾体转化产物作为活性成分的药物制剂。
Claims (9)
1.徐长卿C21甾体转化产物，其特征在于，转化产物中C21甾体苷元重量百分含量大于等于90%，制备方法包括以下步骤：徐长卿干燥根和根茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为徐长卿干燥根和根茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为徐长卿干燥根和根茎重量的2倍体积量，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积徐长卿干燥根和根茎重量的1倍体积量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物。
2.徐长卿C21甾体转化产物在制备肿瘤细胞多药耐药逆转剂中的应用，其特征在于，所述的徐长卿C21甾体转化产物中C21甾体苷元重量百分含量大于等于90%，通过下列方法得到的：徐长卿干燥根和根茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为徐长卿干燥根和根茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为徐长卿干燥根和根茎重量的2倍体积量，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积徐长卿干燥根和根茎重量的1倍体积量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物。
3.一种具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用的徐长卿C21甾体转化产物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：徐长卿干燥根和根茎粉碎后，加90%乙醇回流提取三次，每次用量为徐长卿干燥根和根茎重量的8倍体积量，每次提取时间为2小时，分次滤过，提取液合并，减压回收乙醇，所得提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，填充大孔吸附树脂D101体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30%乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，经已处理好的脱色树脂D941柱色谱，填充脱色树脂D941体积为徐长卿干燥根和根茎重量的0.5倍体积，用6倍柱体积90%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得洗脱物，洗脱物加2 %硫酸溶液水解，硫酸溶液体积为徐长卿干燥根和根茎重量的2倍体积量，置80℃水浴中加热回流5小时，取出，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取5次，乙酸乙酯每次体积徐长卿干燥根和根茎重量的1倍体积量，提取液合并，回收乙酸乙酯得徐长卿C21甾体转化产物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该转化产物在制备胃癌多药耐药细胞耐5-氟尿嘧啶逆转剂中的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该转化产物在制备结肠癌多药耐药细胞耐5-氟尿嘧啶逆转剂中的应用。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该转化产物在制备结肠癌多药耐药细胞耐阿霉素逆转剂中的应用。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该转化产物在制备结肠癌多药耐药细胞耐顺铂逆转剂中的应用。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该转化产物在制备肺癌多药耐药细胞耐紫杉醇逆转剂中的应用。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该转化产物在制备胃癌多药耐药细胞耐顺铂逆转剂中的应用。
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