CN102250106A

CN102250106A - 一种艾叶中倍半萜内酯化合物的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN102250106A
Application number: CN2011101311470A
Authority: CN
Inventors: 蓝闽波; 张艳红; 袁慧慧; 赵红莉; 郭晶; 包晓丽; 王呈仲; 王金威
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明提供一种从艾叶中提取倍半萜内酯类化合物Chloroklotzchin的提取方法，其包括首先用乙醇提取，经大孔吸附树脂、聚酰胺树脂和硅胶柱层析分离。最后利用乙醇重结晶，得到了高纯度的化合物。该方法成本低，所用树脂可以重复利用，无需采用有毒试剂。本发明还提供包含上述的药物制剂，其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

一种艾叶中倍半萜内酯化合物的提取方法及其应用

【技术领域】

本发明涉及医学技术领域，具体地说，是一种艾叶中倍半萜内酯化合物的提取方法及其应用。

【背景技术】

肿瘤已经成为危害人类健康最严重的疾病之一，我国每年癌症的发病率为200万，约有140万人死于癌症且有增加的趋势。近半个世纪以来，肿瘤的发病率逐年上升，目前已成为多发病、常见病，成为居民死亡的主要原因之一，严重威胁着人民的健康。肿瘤学在医学领域的地位越来越重要，寻找和开发毒副作用低、选择性高的抗肿瘤药物已经成为亟待解决的问题。

艾叶为菊科蒿属植物艾(Artemisia argyi Levl.et Vant.)的叶。艾叶性温味苦、辛，归肝、脾、肾经，具有散寒止痛，温经止血和理气安胎等功效。艾叶作为抗肿瘤治疗药物开始于上世纪70年代，以煎剂、注射液和片剂入药，对胃癌、乳腺癌有一定的缓解症状的作用并能控制病情的恶化。Shoemaker等对几种植物的体外活性筛选表明：艾叶水提物对9种不同肿瘤细胞(A549、LLC、Panc-1、Panc02、PC-3、LNCaP、MCF-7、MCNeuA、HuMEC)均表现出较强的抑制活性(Phytotherapy Research，2005.19(7)：649-651)。刘延庆等发现野艾、蕲艾乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均具有不同程度的抑制人癌细胞株SGC-7901、SMMC-7721、Hela细胞的作用，并有明显的量效关系(中药材，2006.29(11)：1213-1215)。本实验组之前对艾叶水提物进行的抗肿瘤活性筛选发现艾叶多糖对小鼠移植性Lewis瘤、Heps瘤、Eac瘤有显著抑制作用(EC₅₀＜100mg/kg)(CN 1962698A)。

艾叶中的倍半萜内酯类化合物是艾叶中具有抗肿瘤作用的主要药效成分。日本人上里新一等从艾叶醇提物中分离出抗肿瘤活性很强的三个倍半萜内酯的光学异构体(JP 07206839)。另外，Lee(J.Org.Chem.2002，67：7670-7675)等从艾叶中分离得到一系列倍半萜内酯的二聚物都具有很强的法尼基蛋白抑制活性，提示其抗癌活性与这一机制有关。

申清人在对艾叶粗提物进行抗癌活性评价后，对具有抗肿瘤活性的组分进行分离，从艾叶中分离得到含氯倍半萜内酯Chloroklotzchin，并发现该化合物具有很强的体外抗肿瘤活性。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种艾叶中倍半萜内酯类化合物的提取方法及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种艾叶中倍半萜内酯化合物的提取方法，具体步骤为，

(1)粉碎过的艾叶，加入8～10倍量(w/v)的60％～100％(v/v)乙醇回流提取1～3次，每次1～3小时，减压蒸馏除去乙醇，得到艾叶醇提物；

(2)将艾叶醇提物经大孔吸附树脂柱层析，用不同浓度的乙醇/水体系洗脱，将70％～100％(v/v)乙醇洗脱部分收集并浓缩，得到膏状固体；

(3)将膏状固体用50％(v/v)乙醇溶解后，上聚酰胺柱，6～10倍柱体积的去离子水洗脱，收集水洗脱部分并浓缩；

(4)将水洗脱部分浓缩后，上硅胶柱，以石油醚/乙酸乙酯(3∶1～1∶4)进行梯度洗脱，洗脱后得到的各组分化合物利用TLC定性鉴定并合并相同组分；进一步利用乙醇重结晶进行纯化，得到倍半萜内酯化合物；本发明所涉及的化合物Chloroklotzchin的结构式为：

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包括按上述提取方法制得的化合物与药学可接受的载体；

所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如，稀释剂、赋形剂如水，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外，还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于患者。用于口服时，可将其制成常规固体制剂如片剂、颗粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水悬浮剂或其他液体制剂如酊剂、糖浆等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、粉针剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备，如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

本发明利用大孔吸附树脂和聚酰胺树脂作为化合物初步分离手段，使用水和乙醇作为分离手段，避免了有毒溶剂的使用，且所用填料可再生使用。所得到的倍半萜内酯类化合物具有较强的体外抗肿瘤活性，且其对癌细胞和正常细胞有较强的选择性。

【附图说明】

图1为化合物Chloroklotzchin的1HNMR谱图；

图2为化合物Chloroklotzchin的13CNMR谱图；

图3为化合物Chloroklotzchin对四种细胞的抑制结果。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种艾叶中倍半萜内酯类化合物的提取方法及其应用的具体实施方式。

实施例1

1、化合物的提取分离

2kg粉碎过的艾叶，用20L的60％(v/v)的乙醇回流提取2次，每次1小时，减压蒸馏除去溶剂，得到约10L的浓缩液。将浓缩液以1∶3(v/v)的比例上已处理好的Hz-818大孔吸附树脂，分别用水，10％乙醇，70％乙醇洗脱，每个组份洗脱约6倍柱体积至洗脱液基本无色为止。将70％乙醇洗脱部分收集并浓缩。浓缩后得到的70％馏分，上聚酰胺柱，收集水洗脱部分。将水洗脱部分浓缩后，得到粘稠膏状固体。将该部分继续上硅胶柱，以石油醚/乙酸乙酯(3∶1～1∶4)进行梯度洗脱。洗脱后得到的棕红色油状物，用二氯甲烷进行反复重结晶，得到无色针状结晶质量分别为15mg，经HPLC检测纯度分别为95％。

2、化合物的结构鉴定

化合物为无色针状结晶λmax＝220，ESI-MS：质谱中存在[M]⁺和[M+2]⁺的成对峰，且峰高比例接近3∶1，推断化合物中存在Cl。其他峰归属为：315.1[M+H]⁺，337.1[M+Na]⁺，651.2[2M+Na]⁺。EI-MS：m/z：147.0(100)为一特殊基团的离子峰，111.0(46.28)[147-HCl]⁺。¹HNMR：H-2(δ＝4.14，d)，H-3(δ＝3.92，d)，H-5(δ＝2.80，d)，H-6(δ＝4.46，d)，H-7(δ＝3.65，m)，H-13a(δ＝5.55)，H-13b(d，δ＝6.12，d)，H-14(δ＝1.31，s)，H-15(δ＝1.53，s)，与参考文献化合物位移相同(Phytochemistry，1985.24(7)：1515-1519)。进一步通过碳谱对化合物进行了结构确证，确定化合物Gel-1为Chloroklotzchin。图1为化合物Chloroklotzchin的1HNMR谱图；图2为化合物Chloroklotzchin的13CNMR谱图；图3为化合物Chloroklotzchin对四种细胞的抑制结果。

实施例2

制备方法：将活性成分、微晶纤维素和玉米淀粉混合，用水均匀润湿后制成软材。湿润后的混合物制粒，过20目筛，80℃烘干，加入硬脂酸镁，混合后再过筛，将混合物压片，每片重105mg，活性成分含量10mg。本品可口服用于治疗肿瘤。

实施例3

活性成分 15g

预胶化淀粉 100g

蔗糖 5g

取活性成分15g，预胶化淀粉100g，蔗糖用乙醇湿法制粒，整粒，装1000个2#胶囊，每粒质量约150mg，其中活性成分含量15mg。其他项目应符合中华人民共和国药典2010年胶囊项下的相应规定。本品口服用于治疗肿瘤。

实施例4

活性成分 3g

丙二醇 160mL

乙醇 40mL

加水至10000mL

取活性成分3g，加入内二醇160mL和乙醇40mL，搅拌使其完全溶解，加注射水稀释至10000mL，过0.22μm的微孔滤膜，灌封，10mL/支，流通蒸汽灭菌3min，检验、包装，得注射液。本品可以用于治疗肿瘤。

实施例5

化合物的细胞毒性活性实验

1、受试样品

1.1化合物

将化合物用DMSO制备成50mg/mL溶液后，再用培养液稀释，加入培养板中，化合物终浓度分别为25，20，15，10，5(μg/mL)，5复孔。

1.2细胞株

MCF-7(人乳腺癌细胞)，

MGC80-3(人胃癌细胞)，

HepG2(人肝癌细胞)，

LO-2(人胚肝细胞)，

均购自中科院上海细胞所。

1.3培养液

DMEM+10％FB S+双抗

2、检测方法：

磺酰罗丹明B(SRB)法：将100μL处于指数生长期的细胞悬液种于96孔培养板，将培养板置于37℃，CO₂含量为5％的培养箱内放置24小时。取培养瓶中细胞，调整细胞密度，100μL/孔接种至96孔板，预培养24h后，弃去培养液，每孔加入含有一定浓度药物的培养液200μL，每种药物设5个复孔，继续在培养箱内培养48h，甩去培养液风干.每孔加冰冷浓度为100g/L的三氯醋酸4℃固定60min后去离子水洗5次，干燥.每孔加4g/L SRB 100μL作用15min后，用10mL/L醋酸轻洗4次，甩干每孔加10mmol Tris base 100μL摇动混匀，在平板振荡器上振荡5min，在酶联免疫检测仪测定A值，用空白对照调零，所用波长为490nm。并按照公式(1-1)计算药物对细胞的体外抑制率。

抑瘤率＝1-用药孔A值/无药细胞对照孔A值(公式1-1)

3、实验结果：

结果显示Chloroklotzchin对MCF-7(人乳腺癌细胞)、MGC80-3(人胃癌细胞)和HepG2(人肝癌细胞)3种细胞株的增殖抑制率较高，且剂量和抑制效果之间呈一定的剂量依赖性。而对正常肝细胞LO-2的抑制活性较小，初步说明Chloroklotzchin对正常细胞的毒副作用较小而能够选择性的杀死癌细胞。因此，化合物Chloroklotzchin可以开发为毒副作用较小的抗癌药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims

1.一种艾叶中倍半萜内酯化合物的提取方法，其特征在于，具体步骤为，

(4)将水洗脱部分浓缩后，上硅胶柱，以石油醚/乙酸乙酯(3∶1～1∶4)进行梯度洗脱，洗脱后得到的各组分化合物利用TLC定性鉴定并合并相同组分；进一步利用乙醇重结晶进行纯化，得到倍半萜内酯化合物，其化学结构式为；

2.一种药物组合物，其特征在于，含有倍半萜内酯化合物的载体。

3.如权利要求2所述的一种药物组合物，其特征在于，药物组合物为片剂、颗粒剂、胶囊或者液体制剂。

4.一种艾叶中倍半萜内酯化合物在抗肿瘤药物中的应用。