CN104755934B - 基于her2‑her2二聚体的检测的治疗诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及离体方法，所述方法用于确定癌症患者对基于给予HER2蛋白特异性抗体的治疗处理作出回应的敏感度，该方法包括使用FRET技术对来自所述患者的组织样品中的HER2‑HER2二聚体进行定量。本发明还涉及用于实施该方法的试剂盒。

Description

基于HER2-HER2二聚体的检测的治疗诊断方法
技术领域
本发明涉及基于通过TR-FRET方法(即，通过对两个相容的荧光分子彼此接近时发射的荧光进行实时测量)对由两个HER2蛋白(以下称为“Her2-Her2”)构成的同源二聚体进行检测的治疗诊断方法。该方法旨在确定癌症患者是否易于对基于给予曲妥珠单抗型的HER2蛋白特异性抗体的治疗处理作出回应。特别是，本发明涉及用来自如下患者的组织样品实施该方法：通过免疫组织化学确定的HER2表达结果证实为阴性的患者(HerceptestTM-阴性患者)。
背景技术
HER2受体(“人表皮生长因子受体2”的首字母缩写)是185kDa的跨膜糖蛋白，属于HER受体酪氨酸激酶家族。在1987年，Slamon等发现HER2基因的扩增影响约1/3的乳腺癌患者，并与差的生命预后相关(Slamon DJ，Clark GM，Wong SG，Levin WJ，Ullrich A等(1987)，Science，235：177-182)。随后的体外和体内研究使得能够对该分子异常的生物结果进行表征，并显示出HER2是促进肿瘤生长、血管生成和肿瘤转移发展的致癌基因。由此提出了抑制HER2可能是治疗过表达该蛋白的肿瘤的有效治疗策略的假说。这使得产生人化重组抗-HER2单克隆抗体曲妥珠单抗，表明曲妥珠单抗在过表达HER2蛋白的乳腺肿瘤患者(在转移性背景或辅助性背景下)中的临床效力。
同时，已产生用于评价HER2蛋白表达的治疗诊断测试，从而识别可能受益于抗-HER2治疗抗体曲妥珠单抗治疗的患者。在常规的临床实践中，对HER2表达进行的定量已成为选择适于该治疗的患者所必须的。HER2测试通常通过用免疫组织化学(IHC，例如由Dako公司以“HerceptestTM”名称销售的测试)染色(免疫组织化学染色使得能够检测HER2蛋白的过表达)或通过FISH(“荧光原位杂交”的首字母缩写)进行，以用于检测HER2基因的扩增。IHC方法为半定量，使得能够以IHC 0(阴性)至IHC 3+(强阳性)的等级对患者进行分类。该分类基于恶性染色细胞的百分比以及这些细胞的膜的染色程度。如果患者被分类为0、1+或2+/FISH-，认为是HerceptestTM阴性，仅结果为3+或2+/FISH+的患者适于用曲妥珠单抗进行治疗。
已知HER2蛋白的活性涉及其二聚化，特别是涉及HER2-HER2同源二聚体的形成。因此，作者关注的是用曲妥珠单抗治疗HerceptestTM-阳性患者中存在的HER2-HER2二聚体。例如，在回顾性研究中所示出的，与其它患者相比，当用曲妥珠单抗进行治疗时，具有高水平的Her2-Her2二聚体的患者表现出更久的整体生存力以及更长的病程(Gosh Cancer Res，2011，Desmet等，Diagn Mol patho 2009)。
特别是，专利申请WO 2009/086197涉及旨在确定患者是否适于用抗-HER2抗体进行治疗、或预期此类治疗的效力的方法，该方法基于HER2或HER2-HER2同源二聚体的定量。该方法仅意图在IHC的表达测试或FISH的扩增测试为阳性的患者上实施。
用于检测HER2二聚体的传统方法基于化学免疫沉淀技术和交联技术，二者具有低的通量，且由于需要大量的蛋白，不适合于在临床条件中应用。
已提出其它方法，特别是Monogram Biosciences公司开发了VeraTagTM测试(Desmedt C等，2009，Diagn Mol Pathol，18：22-29，WO 2009/086197)，用于对FFPE组织样品中的HER蛋白和蛋白二聚体进行定量。该技术(也称为“eTag”)基于使用对待检测的分子具有特异性的两种抗体，一种抗体经由氧化敏感的键偶联至荧光电泳标志物，而另一抗体缀合至能够产生单态氧的实体。当两种抗体彼此接近时，通过照射样品产生的单态氧将引起电泳标志物的释放。随后，通过电泳分离所释放的标志物。这一相对费力的技术需要临床分析实验室将其样品送至Monogram公司进行分析。
以DuolinkTM名称销售的测定法使用偶联至寡核苷酸的抗体，从而能够检测Her2-Her2二聚体。当抗体分开小于40nm时，复杂的连续的杂交和扩增步骤的复杂的连续性通过荧光显微术的原位观测而使二聚体可视化。
特别是，Gaborit等(J Biol Chem.，2011年4月1日，286(13)：11337-45)描述了使用TR-FRET方法(即，通过对当各自键合至抗-HER2抗体的两个相容的荧光分子彼此接近时发射的荧光进行的实时测量)对完整细胞表面上的Her2-Her2二聚体进行的检测。该方法并不适合在临床条件下在组织上使用。
尽管对乳腺癌患者的治疗处理已有进展，然而，被判定为不适于曲妥珠单抗类型治疗的患者(例如HerceptestTM或FISH测试为阴性的患者)以及激素化疗治疗失败的患者仍不幸地处于治疗的绝境。本发明使得能够对这些患者提供新的替代治疗。
附图说明
图1表示作为患者罹患乳腺肿瘤时间的函数的整体生存概率，所述患者为HerceptestTM-阴性且ER-阳性。
图2表示作为患者罹患乳腺肿瘤时间的函数的无病生存概率，所述患者为HerceptestTM-阴性且ER-阳性。
发明内容
本发明人发现，用于对来自患者的组织样品中的HER2-HER2同源二聚体进行检测和定量的TR-FRET方法使得能够示出适于用曲妥珠单抗型的Her2-特异性抗体进行治疗的新患者，所述患者通过免疫组织化学确定的HER2表达结果证实为阴性(“IHC阴性”，特别是HerceptestTM-阴性患者)。
在第一方面，本发明涉及(离体)方法，所述方法用于确定癌症患者对基于给予HER2蛋白特异性抗体的治疗处理作出回应的敏感度(susceptibility)，所述方法包括对来自所述患者的组织样品中的HER2-HER2二聚体进行定量：
-通过对由FRET伴侣对与样品接触而发射的荧光的时间分辨测量来实施所述定量，该FRET伴侣对的第一成员直接或间接地键合至第一配体，该第一配体能够结合至HER2蛋白的结构域；该FRET伴侣对的第二成员直接或间接地键合至第二配体，该第二配体能够与该第一配体一样结合至HER2蛋白的相同结构域；以及
-该患者为：通过免疫组织化学确定的HER2表达结果证实为阴性的患者，特别是HerceptestTM-阴性的患者。
术语“FRET伴侣对”意指由能量供体荧光化合物(下文称为“供体荧光化合物”)和能量受体化合物(下文称为“受体化合物”)所组成的对；当它们彼此接近并且在供体荧光化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发射FRET(表述“Resonance EnergyTransfer”的首字母缩写)信号。
术语“FRET信号”是指代表供体荧光化合物及受体化合物之间的FRET的任何可测量信号。因此，FRET信号可为供体荧光化合物或受体化合物(当受体化合物为荧光化合物时)的发光强度或发光寿命的变化。当时间分辨测量FRET信号时(一般为使用稀土元素螯合物或穴状化合物的情况)，使用术语TR-FRET(“时间分辨(time-resolved)”FRET的首字母缩写)。
术语“组织样品”优选是指取自患者的固态组织样品，并优选为肿瘤组织提取物。该组织样品优选以厚度为10μm-50μm的切片形式使用。按照本领域技术人员已知的传统技术制备这些切片。特别是，传统技术可由如下组成：通过用甲醛处理来固定样品，在石蜡中包埋该样品(特别是包埋为随后能够在切片机上进行切割的块状(blocks)形式，优选具有约10μm-30μm的厚度)。用二甲苯对这些切片进行处理以移除石蜡、用乙醇并随后用水漂洗该切片、以及使用HIER(“热诱导的表位修复(heat induced epitope recovery)”的首字母缩写)技术的表位再生均为本领域技术人员已知的技术。
或者，还可将本发明所述的方法在冰冻切片上实施，所述冰冻切片同样按照传统技术制备，优选厚度为20μm-50μm。
术语“定量”意指获得如下信号，该信号的值取决于样品中存在的HER2-HER2二聚体的量。值得注意的是，根据本发明，能够但不必须将代表HER2二聚体的量的值与在参比患者中观测到的阈值(在高于所述阈值时，所测试的患者适于用抗-HER2抗体进行治疗)进行比较。然而相当出乎预料的是，确定了HER2二聚体的单独存在与阴性预后相关，并由此使得这些患者适于用抗-HER2抗体进行治疗。由于检测出HER2二聚体，或由于所检测的二聚体的量高于参比患者中确定的阈值，本发明所述的方法使得医院工作人员能够非常容易地获得患者适于该类型治疗的结论，因此在任意情况下，本发明所述的方法对医院工作人员而言非常实用。
当用来自曾经是激素化疗对象的患者(患者被称为“ER+”，雌性激素受体表达阳性)的组织样品实施本发明所述的方法时，特别是当该激素化疗方法并未引起患者病症的任何改善时，即使通过免疫组织化学(HerceptestTM)确定的HER2表达结果被证实为阴性(即，来自此类患者的样品在此测试中被分类为具有0、1+或2+/FISH-的得分)，由于能够为患者提供新的治疗替代方案，本发明所述的方法特别有利。
在一个优选的实施方式中，第一配体和第二配体为对位于HER2蛋白的胞外部分或胞内部分的相同表位具有特异性的抗体或适体，在特别有利的实施方式中，所述配体相同。优选针对位于HER2的胞外部分的表位的抗体或适体。应在广义上理解术语“抗体”，该术语“抗体”包括免疫球蛋白家族的任何蛋白、或包含免疫球蛋白结构域以及用于特异性结合至感兴趣蛋白的位点。因此，抗体可为Fab片段、Fab′片段、单链抗体、或免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域。本领域技术人员能够利用传统技术生产HER2蛋白的特异性抗体。抗-HER2抗体还可商购。
此外，期望第一配体和第二配体在孵育介质中的终浓度最理想地为大于或等于10nM、优选10nM-150nM、更优选20nM-80nM、特别优选30nM-60nM。术语“终浓度”意指一旦将所有试剂引入到孵育介质中，这些化合物在孵育介质中的浓度。这些浓度范围显著高于TR-FRET型测定法中正常使用的浓度，其中，荧光配体的终浓度为约1纳摩尔(即，小于10nM)。
HER2-HER2二聚体的定量优选包含如下步骤：
(i)使组织样品与键合至HER2配体的FRET伴侣对接触；
(ii)清洗组织样品；
(iii)对由测量介质发射的FRET信号进行测量。
有利的是，相对于测量介质中存在的生物材料的量，将FRET信号归一化。由此，在一个具体实施方式中，本发明所述的方法包括用标记试剂对组织样品进行孵育，该标记试剂发射与样品中存在的生物材料的量成比例的信号。优选，该标记试剂为荧光-DNA标记试剂(例如Hoechst 33342)，将该标记试剂在清洗步骤前加入到样品中，并相对于这一标记试剂的荧光所对应的信号，将FRET信号归一化。
还可使用其它类型的标记试剂来实施归一化，特别是：
-作为线粒体标志物的荧光化合物，例如Mitotracker Orange、MitotrackerGreen或罗丹明123。这些化合物可商购，并且还已知用这些化合物标记细胞的方案。以类似于标记试剂为插入试剂时的方案，根据本发明所述使用这些化合物；
-荧光化合物，例如丹磺酰氯或NBD(硝基苯并噁二唑)：这些化合物也可商购，结合至特别是蛋白的胺基官能团。Y.Uratani等描述了用丹磺酰氯标记细胞的方案(Journal ofBacteriology，1982，第523-528页)。一旦细胞被标记，能够以类似于标记试剂为插入试剂时的方案实施本发明；
-在脂质膜上积累的荧光化合物，例如菲律宾菌素(Filipin)：该化合物可商购，并且已知其用于标记细胞的用途。以类似于标记试剂为插入试剂时的方案，根据本发明所述使用该化合物。
最后，在对HER2二聚体进行定量的方法中，优选包括在将荧光化合物引入测量介质之前和之后，旨在以细胞裂解物的形式对该样品进行均质化的步骤。这一步骤优选在将荧光化合物(第一配体、第二配体以及任选的标记试剂)引入至孵育介质中之后、并在对FRET信号进行测量之前实施。此类处理可为机械处理，并可选自：应用超声(声波处理)、冷冻/解冻循环、使用机械研磨机、任选与低渗性裂解缓冲液或含有去污剂的裂解缓冲液(如RIPA缓冲液)共用。
优选且为了确保TR-FRET定量方法的灵敏度，供体化合物为稀土元素螯合物或稀土元素穴状化合物，特别是铕螯合物、铕穴状化合物、铽螯合物或铽穴状化合物，受体化合物选自：别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素(cyanines)、方酸菁(squaraines)、香豆素、原黄素(proflavins)、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物、已知名称为“Atto”的荧光团、已知名称为“DY”的荧光团、已知名称为“Alexa”的化合物和硝基苯并噁二唑。
在第二方面，本发明涉及实施上述方法的试剂盒，所述试剂盒包含第一配体和第二配体，这些配体中的每一个均能够特异性地结合至HER2蛋白的相同结构域，并且这些配体分别用供体化合物和受体化合物直接标记或适于用供体化合物和受体化合物间接标记，所述供体化合物和所述受体化合物形成FRET伴侣对。优选的是，这些配体中的至少一个用FRET伴侣中的一个进行共价(直接)标记，并且优选两个配体各自用FRET伴侣中的一个进行共价标记。
供体化合物优选为稀土元素螯合物或稀土元素穴状化合物，特别是铕螯合物、铕穴状化合物、铽螯合物或铽穴状化合物，受体化合物优选选自：别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物、已知名称为“Atto”的荧光团、已知名称为“DY”的荧光团、已知名称为“Alexa”的化合物和硝基苯并噁二唑。
用能量供体化合物或受体化合物标记配体或抗体
可用荧光团直接(共价)或间接标记配体。优选直接标记。
通过传统缀合技术(需要反应基团)，用荧光供体化合物或受体化合物直接标记配体或抗体。荧光供体化合物或受体化合物通常以“官能化”的形式出售，即，荧光供体化合物或受体化合物具有能够与待标记化合物(在这一情况下为配体)上存在的官能团发生反应的反应基团。
一般情况下，供体荧光化合物或受体荧光化合物上存在的反应基团是亲电基团或亲核基团；所述基团分别在合适的亲核基团或亲电基团存在下能形成共价键。以示例性的方式，以下列出了亲电基团/亲核基团对以及当将亲电基团/亲核基团放在一起时所形成的共价键类型：
亲电基团 亲核基团 键类型
丙烯酰胺 硫醇 硫醚
酰卤 胺/苯胺 氨甲酰
醛 胺/苯胺 亚胺
醛或酮 肼 腙
醛或酮 羟胺 肟
烷基磺酸根 硫醇 硫醚
酸酐 胺/苯胺 氨甲酰
芳基卤 硫醇 苯硫酚
芳基卤 胺 芳基胺
氮丙啶 硫醇 硫醚
碳二亚胺 羧酸 N-酰基脲或酸酐
活化酯* 胺/苯胺 氨甲酰
卤代乙酰胺 硫醇 硫醚
卤代三嗪 胺/苯胺 氨基三嗪
酰亚胺酯 胺/苯胺 脒
异氰酸根 胺/苯胺 脲
异硫氰酸根 胺/苯胺 硫脲
马来酰亚胺 硫醇 硫醚
磺酸酯 胺/苯胺 烷基胺
磺酰卤 胺/苯胺 磺胺
*：术语“活化酯”意指具有式COY的基团，其中Y为：
·离去基团，所述离去基团选自：琥珀酰亚胺氧基基团(-OC4H4NO2)和磺基琥珀酰亚胺氧基基团(-OC4H3NO2-SO3H)；
·未取代或取代的芳基氧基基团，所述芳基氧基基团用至少一个亲电取代基(如硝基、氟代、氯代、氰基或三氟甲基)取代，从而形成活化的芳基酯；
·由碳二亚胺基团活化的羧酸，形成酸酐-OCORa或-OCNRaNHRb，其中Ra和Rb相同或不同，并选自C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基、C1-C6烷氧基和环己基；
·3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基。
可商购的供体荧光化合物和受体荧光化合物通常包含马来酰亚胺官能团或活化酯(多数通常用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团活化)，分别与硫醇基团和胺基基团反应，并因此可用于标记抗体。所标记的抗体通过终摩尔比(FMR)表征(FMR表示接枝至配体的标记分子的平均数量)。
当配体是天然蛋白时，优选使用蛋白中天然存在的官能团中的一种：末端的氨基基团、末端的羧基基团、天冬氨酸的羧基及谷氨酸的羧基、赖氨酸的胺基、精氨酸的胍基、半胱氨酸的硫醇基、酪氨酸的酚基、色氨酸的吲哚环、甲硫氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。
若配体在天然状态下不包含官能团，可引入此类官能团。特别是，引入官能团的方法在C.Kessler，Nonisotopic probing，Blotting and Sequencing，第二版；L.J.Kricka(1995)著，Academic press Ltd.，London，p.66-72中加以描述。
另一种用荧光化合物标记配体的方法在于将反应基团(例如NHS基或马来酰亚胺基团)引入配体中，并在具有官能团的荧光团存在下放置该反应基团，该具有官能团的荧光团将与反应基团反应从而形成共价键。
证实经标记的配体对其受体保持足够的亲和力很重要；这可简单地通过传统结合实验进行控制，从而能够对经标记的配体对于受体的亲和常数进行计算。
还可用荧光化合物间接标记配体，例如通过向孵育介质中引入“第二”抗体，该第二抗体自身共价键合至荧光化合物，该抗体特异性识别配体或者这一配体上存在的半抗原(例如二硝基苯基基团、地高辛配基(digoxigenin)基团、或FLAG、c-myc或6-HIS标签)。当配体是抗体时，第二抗体可为抗该种类抗体。
另一非常经典的间接标记手段在于：将生物素连接至待标记的配体，然后在标记有荧光团的链霉亲和素存在的情况下孵育这一生物素化的配体。用生物素标记配体为本领域技术人员的公知常识中的部分，并且Cisbio Bioassays公司销售例如商品名为“d2”的荧光团标记的链霉亲和素(ref.610SADLA)。
FRET伴侣对
FRET伴侣对优选由能量供体荧光化合物和能量受体荧光化合物组成。
将FRET定义为由能量供体和能量受体之间的偶极-偶极相互作用导致的非辐射性能量转移。这一物理现象要求这些分子间具有能量相容性(compatibility)。这意味着供体的发射光谱必须至少部分地与受体的吸收光谱重叠。根据理论，FRET是依赖于受体和供体分子二者的间隔距离的过程：当这些分子彼此接近时，将发射FRET信号。
本领域技术人员能够在能力范围内对用于获得FRET信号的成对供体/受体荧光团进行选择。特别是，在由Joseph R.Lakowicz编写的书籍(Principles of fluorescencespectroscopy，第二版，Kluwer academic/plenum publishers，NY(1999))中描述了可用于研究FRET现象的供体-受体对，本领域技术人员可加以参考。
由于长寿命(>0.1ms，优选0.5ms-6ms)的能量供体荧光化合物、尤其是稀土元素螯合物或穴状化合物使得能够实施时间分辨测量，即在消除由测量介质发射的自发荧光现象时测量TR-FRET信号，因此是优选的。由于该原因，通常优选上述能量供体荧光化合物来实施本发明所述的方法。
镝(Dy3+)、钐(Sm3+)、钕(Nd3+)、镱(Yb3+)或铒(Er3+)的配合物(complexes)是同样适合于本发明目的的稀土元素配合物，然而特别优选铕(Eu3+)螯合物和铕(Eu3+)穴状化合物以及铽(Tb3+)螯合物和铽(Tb3+)穴状化合物。
已描述了大量的稀土元素配合物，并且目前由PerkinElmer、Invitrogen和CisbioBioassays公司销售多种稀土元素配合物。
适合于本发明目的的稀土元素螯合物或稀土元素穴状化合物的实例为：
·包含一个或多个吡啶单元的镧系元素穴状化合物。此类稀土元素穴状化合物记载于例如专利EP 0 180 492、EP 0 321 353和EP 0 601 113以及国际申请WO 01/96 877中。铽(Tb3+)穴状化合物和铕(Eu3+)穴状化合物特别适合于本发明的目的。镧系元素穴状化合物由Cisbio Bioassays公司销售。作为非限定性实例，可提及具有下式的铕穴状化合物(可通过反应基团偶联至待标记的化合物，在此情况下，反应基团例如为NH2基团)：
·特别是专利US 4 761 481、US 5 032 677、US 5 055 578、US 5 106 957、US 5116 989、US 4 761 481、US 4 801 722、US 4 794 191、US 4 637 988、US 4 670 572、US 4837 169和US 4 859 777描述的镧系元素螯合物。专利EP 0 403 593、US 5 324 825、US 5202 423和US 5 316 909中描述了由九齿(nonadentate)配体(如三联吡啶)形成的螯合物。镧系元素螯合物由PerkinElmer公司销售。
·还可使用由螯合剂(如四氮杂环十二烷)形成的镧系元素配合物，所述配合物用含有芳香环的生色团取代(如Poole R.等在Biomol.Chem，2005，3，1013-1024“Synthesisand characterization of highly emissive and kinetically stable lanthanidecomplexes suitable for usage in cellulo”中描述的配合物)。还可使用申请WO 2009/10580中描述的配合物。
·还可使用专利EP 1 154 991和EP 1 154 990中描述的镧系元素穴状化合物。
·铽穴状化合物具有下式(可通过反应基团偶联至待标记的化合物，在此情况下，反应基团例如为NH2基团)：
并且，该铽穴状化合物的合成在国际申请WO 2008/063721中加以描述(化合物6a，第89页)。
·来自Lumiphore公司的铽穴状化合物Lumi4-Tb，由Cisbio Bioassays出售。
·来自Research Organics公司的具有下式的量子染料(quantum dye)(可通过反应基团偶联至待标记的化合物，在此情况下，反应基团为NCS)：
·钌螯合物，特别是由钌离子及多个二吡啶组成的配合物，如三(2,2'-二吡啶)钌(II)。
·由Life Technologies公司销售的具有下式的铽螯合物DTPA-cs124 Tb(可通过反应基团R偶联至待标记的化合物)，并且，该铽螯合物的合成在美国专利US 5 622 821中加以描述：
·具有下式的铽螯合物，由Latva等(Journal of Luminescence，1997,75：149-169)加以描述：
特别有利的是，供体荧光化合物选自：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物以及量子染料；特别优选铕螯合物、铕穴状化合物、铽螯合物和铽穴状化合物。
镝(Dy3+)、钐(Sm3+)、钕(Nd3+)、镱(Yb3+)或铒(Er3+)的配合物也为适合于本发明目的的稀土元素配合物。
受体荧光化合物可选自下组：别藻蓝蛋白，尤其是已知商品名为XL665的别藻蓝蛋白；发光有机分子，例如罗丹明、花青素(例如Cy5)、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物(以名称“Bodipy”出售)、已知名称为“Atto”的荧光团、已知名称为“DY”的荧光团、已知名称为“Alexa”的化合物和硝基苯并噁二唑。有利的是，受体荧光化合物选自：别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。
表述“花青素”和“罗丹明”应分别理解为“花青素衍生物”和“罗丹明衍生物”。本领域技术人员已知多种可商购的此类荧光团。
“Alexa”化合物由Invitrogen公司出售；“Atto”化合物由Atto-tec公司出售；“DY”化合物由Dyomics公司出售；“Cy”化合物由Amersham Biosciences公司出售；其它化合物由多个化学试剂供应商(如Sigma Aldrich或Acros公司)出售。
为了本发明的目的，优选将花青素衍生物或荧光素作为受体荧光化合物。
实施例
实施例1
在本实施例中，将本发明所述的方法用于对来自患者(特别是乳房肿瘤患者)的肿瘤样品中存在的HER2-HER2二聚体进行定量。
分别将Tb荧光团和d2荧光团(Cisbio bioassays)用作FRET伴侣的供体和受体。用标记有Tb或d2的单一抗体(曲妥珠单抗，Roche Pharma AG)实施对HER2-HER2同源二聚体的定量。
将50μm肿瘤冷冻切片在含有两种荧光缀合物(各自为50nM)的180μl TR-FRET缓冲液(1×PBS/10％BSA+蛋白酶抑制剂混合物，Roche，ref.1836153)中孵育过夜。随后通过加入20μl 0.1mg/ml的Hoechst 33342(Invitrogen)溶液并在环境温度下孵育10min，对DNA进行染色。在清洗和离心后，将样品重悬在TR-FRET缓冲液中，接受声波处理并转移至微板中。
使用荧光计(BMG Labtech)，在337nm下激发后，以时间分辨模式(延迟60μs，窗口400μs)分别在620nm和665nm处测量Tb和d2的荧光信号。以荧光模式在460nm处测量Hoechst 33342的信号。根据下式对这些信号进行背景噪声的校正：
F校正＝F样品-F背景噪声，
其中，F背景噪声的值通过测量单独的TR-FRET缓冲液的荧光获得。
此外，对于各测定，在测量样品的同时，针对从含有50nM抗体--Tb和50nM抗体-d2的混合物的储液起始通过2倍级联稀释(从而获得系列浓度)获得的溶液测量荧光信号，并针对各抗体浓度比较在665nm处获得的信号与在620nm处测得的信号。基于由样品在620nm处发射的信号，将所得到的曲线用于计算-Tb荧光在665nm处的贡献(F665Tb)。以如下方式表示TR-FRET信号：
ΔF665＝F665样品-F665Tb
将在460nm处测量的DNA-Hoechst 33342络合物的信号(Exc 350nm/Em 460nm：F460)对TR-FRET信号进行归一化，从而将各孵育介质中存在的生物材料量的变化考虑在内，并归一化至平均值为100 000荧光单位(FU)：
TR-FRET归一化＝(ΔF665×100 000)/(F460)。
归一化的TR-FRET信号以FU表示。
结果：HER2-HER2二聚体的定量
获得18个乳房肿瘤样品。在这18个样品的12个中检测出HER2-HER2同源二聚体(66.7％)。除了5个样品显示出高水平的HER2-HER2二聚体(12 000-32 400FU)外，在这些样品的大部分中，二聚体表达水平为低度至中度(200-2700FU)。完全出乎预料的是，不仅在HerceptestTM-阳性肿瘤样品中，而且在约半数的HerceptestTM-阴性肿瘤(HerceptestTM为0、1+或2+)中也观察到HER2-HER2同源二聚体，虽然在这些HerceptestTM-阴性肿瘤情况中观察到的信号比起在HerceptestTM-阳性肿瘤样品中测量的约低50倍。
对于各样品，计算在三次独立实验中的HER2-HER2二聚体定量的变异系数，对三次测试而言，获得小于25％的平均值。
首次发现，可靠的HER2二聚体定量方法使得甚至能够在HerceptestTM-阴性患者中定量HER2-HER2二聚体。该方法不具有免疫组织化学染色和FISH技术的缺陷，并且与Monogram公司专利申请WO 2009/086197中描述的技术不同，该方法可在医院中实施。
实施例2
使用实施例1中描述的方法，对来自100名乳腺癌患者的冰冻肿瘤样品进行HER2-HER2二聚体定量。归一化的荧光信号测量使得能够定量测量HER2-HER2二聚体。对各患者而言，评价患者的无病生存率(“DFS”)和整体生存率(“OS”)。
结果：在100名患者中，82名患者为IHC-HER2-阴性(HerceptestTM-阴性)，包括60名ER-阳性并用激素疗法治疗的患者。能够使用来自这60名患者中的55名患者的样品。利用Cox比例风险分析显示出，在IHC-HER2-阴性且ER-阳性受试者中，HER2-HER2二聚体的存在与降低的整体生存率(p＝0.00237；参见图1)和降低的无病生存率(p＝0.00011；参见图2)均显著相关。
借助于本发明所述的方法对HER2表达和HER2-HER2二聚体的定量测量使得能够预测患有乳腺癌的IHC-HER2-阴性且ER-阳性受试者中的疾病后果。因此，该生物标志物具有如下用途：识别出激素治疗并不足够有效而可能得益于HerceptinTM型的抗-HER疗法的辅助治疗的患者。因此，本发明的一个主要价值在于，由此能够改善对如下患者的选择，所述患者倾向于能够对此类治疗作出回应。

Claims (16)

1.第一配体和第二配体在制备用于通过离体方法确定癌症患者对基于给予HER2蛋白特异性抗体的治疗处理作出回应的敏感度的试剂盒中的用途，其中，所述第一配体和第二配体各自能够结合至所述HER2蛋白的相同结构域，所述试剂盒用于对来自所述患者的组织样品中的HER2-HER2二聚体进行定量，其特征在于，
-通过对由FRET伴侣对与所述样品接触而发射的荧光的时间分辨测量来实施所述定量，所述FRET伴侣对的第一成员直接或间接地键合至所述第一配体，所述第一配体能够结合至所述HER2蛋白的结构域；所述FRET伴侣对的第二成员直接或间接地键合至所述第二配体，所述第二配体能够与所述第一配体一样结合至所述HER2蛋白的相同结构域；以及，
-所述患者为：通过免疫组织化学确定的HER2表达结果证实为阴性的患者。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述患者曾经是激素化疗的对象。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述第一配体和所述第二配体为对位于HER2的胞外或胞内部分的相同表位具有特异性的抗体。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述第一配体和所述第二配体相同。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，将所述第一配体和所述第二配体引入孵育介质中，其中，所述第一配体和所述第二配体各自具有大于或等于10nM的终浓度。
6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述HER2-HER2二聚体的定量包括如下步骤：
(i)使所述组织样品与键合至HER2配体的所述FRET伴侣对接触；
(ii)清洗所述组织样品；
(iii)对由测量介质发射的FRET信号进行测量。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述HER2-HER2二聚体的定量包括用标记试剂孵育所述组织样品的步骤，所述标记试剂发射与所述样品中存在的生物材料的量成比例的信号；这一步骤早于所述清洗步骤；以及相对于这一标记试剂所对应的信号，将FRET信号归一化。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述标记试剂为荧光DNA-标记试剂；以及相对于这一标记试剂的荧光所对应的信号，将FRET信号归一化。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述HER2-HER2二聚体的定量进一步包括以细胞裂解物的形式对所述组织样品进行均质化的步骤。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，对所述组织样品进行均质化的步骤在引入所述第一配体和所述第二配体之后、并在对所述FRET信号进行测量之前实施。
11.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，供体化合物为稀土元素螯合物或稀土元素穴状化合物。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述FRET伴侣对的一个成员为供体化合物，所述供体化合物选自铕螯合物、铕穴状化合物、铽螯合物以及铽穴状化合物。
13.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述FRET伴侣对的一个成员为受体化合物，所述受体化合物选自：别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物、已知名称为“Atto”的荧光团、已知名称为“DY”的荧光团、已知名称为“Alexa”的化合物和硝基苯并噁二唑。
14.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述FRET伴侣对中的至少一个共价键合至所述第一配体或所述第二配体。
15.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述FRET伴侣对共价键合至所述第一配体和所述第二配体。
16.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述患者为HerceptestTM-阴性患者。
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