CN104745657A - 高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，首先用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制瓜尔胶溶液，然后控制温度及时间进行加热溶胀，冷却后，同时加入β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶三种酶，充分混匀，控制酶解温度及时间进行降解。本发明实现了高浓度下瓜尔胶的快速酶解，并获得了低聚半乳甘露糖酶解液,节约了后续生产低聚半乳甘露糖时干燥、纯化的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，属于生物技术领域。
背景技术
瓜尔胶是由一年生草本豆科作物瓜尔豆的胚乳部分加工而成的一种天然增稠剂和品质改良剂，主要成分为半乳甘露聚糖。瓜尔胶是外观为白色或微黄色的自由流动粉末，能溶于冷水或热水，遇水后形成胶状物质，能迅速增稠。半乳甘露聚糖结构的主链是以β-(1-4) 糖苷键连接在一起的甘露聚糖，支链是以α-(1-6) 糖苷键连接的半乳聚糖。低聚半乳甘露糖是半乳甘露聚糖的不完全降解产物，由2-10个半乳糖和甘露糖分子通过糖苷键聚合而成的低聚糖的总称，半乳糖和甘露糖的摩尔比约为1∶2。低聚半乳甘露糖不能被人体消化吸收，热量低，基本不增加血糖和血脂，但能显著增进人体肠道内以双歧杆菌和乳酸杆菌为代表的有益菌的增殖，具有调节肠道功能、改善便秘、抗氧化和提高免疫力的作用。
当前，利用瓜儿胶为原料，酶切降解制备低聚半乳甘露糖的方法存在如下问题。一是现有方法对瓜尔胶的酶解主要是采用β-甘露聚糖酶，但采用单一酶水解瓜尔胶的效率不高。虽然现有一些技术采用了复合酶降解植物多糖的方法，但由于每种酶分别进行降解，时间较长，酶解效率较低。二是在瓜尔胶酶解过程中，由于瓜尔胶溶液黏度过高，目前普遍采用的酶解瓜尔胶时的浓度为0.3-2%，得到的低聚糖的浓度较低，在进一步制备低聚半乳甘露糖粉剂时需要进行脱水干燥处理，这不仅增加了产物即低聚半乳甘露糖后续脱水、干燥的成本，也严重影响了工业化生产的效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种高浓度瓜尔胶溶液的快速酶解方法，获得低聚半乳甘露糖酶解液。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
首先用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制瓜尔胶粉溶液，然后控制温度及时间进行加热溶胀，冷却后，同时加入β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶三种酶,充分混匀，控制酶解温度及时间进行降解。
以上所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液为0.2mol/mL，pH 值为6.0～6.6。
瓜尔胶溶液浓度为12～15％，加热温度为92～95℃，时间为50～60min；冷却至25-30℃。
瓜尔胶粉与β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶的混和比例为：每克瓜尔胶粉加入β-甘露聚糖酶70～90U，木聚糖酶1000～2000U，内切葡聚糖酶2000～3000U。
加入三种酶后采用温度梯度酶解方式，具体为：
（1）将温度从冷却后的温度升高到35-40℃，酶解1.5-2.5h；
（2）将温度升高到48-53℃，酶解3-4h；升温过程中每3-5分钟升高1-2摄氏度，并且每升高1-2摄氏度保持10分钟；
（3）将温度升高到55℃，酶解2-3h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）和高效液相色谱法(HPLC)测定酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比。MALDI-TOF质谱仪的参数设置：氮激光器波长337 nm，采用延时引出和反射的工作方式，加速电压19.5 kV，反射电压20 kV， 延时引出电压14.5～16.5 kV，延时时间50～200 ns，正离子检测。HPLC参数设置：色谱柱NH2 Column (416mm×250 mm)，柱温30℃，流速1 mL/min, 进样量为20μL，流动相乙腈∶水= 75 ∶25 。
通过检测，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类质量的99.5%～99.9%。
本发明所述的复合酶解方法的有益效果是：
1、加热溶胀步骤避免了因瓜尔胶溶液黏度过高而导致的瓜尔胶溶液与酶混合不均和酶解困难。
2、实现瓜尔胶12％以上高浓度下的酶解，并获得低聚半乳甘露糖酶解液,节约了后续生产低聚半乳甘露糖粉剂时干燥的成本。
3、低聚半乳甘露糖作为供人食用的植物膳食纤维，柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲溶液，无毒副作用，食用安全。
4、实现β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶同时酶解，时间短，省略了每种酶依次降解后的纯化步骤，节约了生产时间和成本，提高了效率。
5、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶的酶解特点各异，互为补充，酶解速度快。酶解液糖类组成成分中，单糖成分为0，保证了低聚半乳甘露糖实现其益生元的有益效果；酶解液中聚合度为2-10的低聚糖的质量百分数是99.5%～99.9%，说明了瓜尔胶的充分降解。
现有技术中都是酶解低浓度的瓜尔胶或其他生物胶，普遍认为高浓度的胶溶液在酶解时的效果不佳，本发明实现瓜尔胶高浓度下的酶解，并获得高浓度的低聚半乳甘露糖酶解液，节约了后续生产低聚半乳甘露糖粉剂时的脱水、干燥的成本。
具体实施方式
实施例1
取瓜尔胶粉12g，用0.2mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100 mL，调pH值为6.0；然后加热溶胀，温度为92℃，时间为50min；冷却至25℃后，同时加入β-甘露聚糖酶840U，木聚糖酶12000U，内切葡聚糖酶24000U，充分混合；
加入三种酶后采用温度梯度酶解方式，具体为：
（1）将温度从冷却后的温度升高到35℃，酶解1.5h；
（2）将温度升高到48℃，酶解3h；升温过程中每3分钟升高1摄氏度，并且每升高1摄氏度保持10分钟；
（3）将温度升高到55℃，酶解2h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表1，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的99.5%。
表1 实施例1中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
| 聚合度 | 单糖 | 二糖 | 三糖 | 四糖 | 五糖 | 六糖 | 七糖 | 八糖 | 九糖 | 十糖 | 十一糖 | 十二糖 |
| 百分比（%） | 0 | 17.5 | 15.1 | 21.6 | 9.9 | 18.3 | 7.8 | 3.4 | 4.3 | 1.6 | 0.4 | 0.1 |
实施例2
取瓜尔胶粉13g，用0.2mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100 mL，调pH值为6.3；然后加热溶胀，温度为93.5℃，时间为55min；冷却至28℃后，同时加入β-甘露聚糖酶1040U，木聚糖酶19500U，内切葡聚糖酶32500U，充分混合。
加入三种酶后采用温度梯度酶解方式，具体为：
（1）将温度从冷却后的温度升高到37℃，酶解2h；
（2）将温度升高到50℃，酶解3.5h；升温过程中每4分钟升高1.5摄氏度，并且每升高1.5摄氏度保持10分钟；
（3）将温度升高到55℃，酶解2.5h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表2，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的99.6%。
表2 实施例2中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
| 聚合度 | 单糖 | 二糖 | 三糖 | 四糖 | 五糖 | 六糖 | 七糖 | 八糖 | 九糖 | 十糖 | 十一糖 | 十二糖 |
| 百分比（%） | 0 | 18.2 | 16.3 | 20.7 | 10.4 | 17.5 | 8.9 | 2.9 | 3.4 | 1.3 | 0.3 | 0.1 |
实施例3
取瓜尔胶粉15g，用0.2mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100 mL，调pH值为6.6；然后加热溶胀，温度为95℃，时间为60min；冷却至30℃后，同时加入β-甘露聚糖酶1350U，木聚糖酶30000U，内切葡聚糖酶45000U，充分混合。
加入三种酶后采用温度梯度酶解方式，具体为：
（1）将温度从冷却后的温度升高到40℃，酶解2.5h；
（2）将温度升高到53℃，酶解4h；升温过程中每5分钟升高2摄氏度，并且每升高2摄氏度保持10分钟；
（3）将温度升高到55℃，酶解3h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表3，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的99.9%。
表3 实施例3中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
| 聚合度 | 单糖 | 二糖 | 三糖 | 四糖 | 五糖 | 六糖 | 七糖 | 八糖 | 九糖 | 十糖 | 十一糖 | 十二糖 |
| 百分比（%） | 0 | 18.5 | 16.6 | 21.9 | 10.8 | 16.9 | 8.5 | 2.3 | 3.2 | 1.2 | 0.1 | 0 |
Claims (7)
1.一种高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，首先用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制瓜尔胶溶液，然后控制温度及时间进行加热溶胀，冷却后，同时加入β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶三种酶，充分混匀，控制酶解温度及时间进行降解。
2.如权利要求1所述的高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mol/mL，pH 值为6.0～6.6。
3.如权利要求1所述的高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，瓜尔胶溶液浓度为12～15％。
4.如权利要求1所述的高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，加热溶胀温度为92～95℃，时间为50～60min。
5.如权利要求1所述的高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，加热溶胀后冷却至25-30℃。
6.如权利要求1所述的高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，瓜尔胶粉与β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶的混和比例为：每克瓜尔胶粉加入β-甘露聚糖酶70～90U，木聚糖酶1000～2000U，内切葡聚糖酶2000～3000U。
7.如权利要求1所述的高浓度瓜尔胶溶液快速制备低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，加入三种酶后采用温度梯度酶解方式，具体为：
（1）将温度从冷却后的温度升高到35-40℃，酶解1.5-2.5h；
（2）将温度升高到48-53℃，酶解3-4h；升温过程中每3-5分钟升高1-2摄氏度，并且每升高1-2摄氏度保持10分钟；
（3）将温度升高到55℃，酶解2-3h。
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