CN112841450A - 一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂及其应用，属于动物饲料添加剂领域。本发明通过将豆科种子中提取的半乳甘露聚糖使用内切甘露聚糖酶进行酶解，过滤除去单糖，得到一种半乳甘露聚糖不完全降解产物，将其添加到蛋鸡饲料中饲喂蛋鸡进行试验，发现本发明的半乳甘露聚糖不完全降解产物作为饲料添加剂可以提高动物体内抗氧化酶的活力，降低脂质过氧化物丙二醛的含量。由于本发明得到的半乳甘露聚糖不完全降解产物是从豆科种子中提取，是一种能够提高动物抗氧化能力的绿色饲料添加剂。

Description

一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂及其应用

技术领域

本发明属于动物饲料添加剂技术领域，更具体地说，涉及一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂及其应用。

背景技术

畜禽在正常生理代谢过程中会产生大量自由基，但由于体内存在抗氧化系统，可以保护机体组织和细胞不受过量自由基的损伤，即氧自由基的产生和清除处于一种动态平衡。但随着集约化养殖的不断发展，养殖过程中存在各种各样的应激因素，极易造成畜禽体内抗氧化系统的抗氧化能力下降，从而导致氧自由基超过动物体内所需的合理水平，从而损伤细胞，使得组织器官机能下降，引发疾病，甚至造成畜禽的死亡，带来巨大的经济损失。因此，氧化应激已成为危害集约化养殖的突出问题。

而目前饲料工业应对这类氧化损伤问题的方法有限，现有技术主要是在饲料中添加乙氧基喹啉等化学抗氧化剂，但最新研究发现这类化学抗氧化剂对人体健康存在潜在的风险。因此，寻找安全可靠的天然抗氧化剂具有十分重要的意义。近年来，许多天然多糖及其降解产物因其对动物体抗氧化能力的提高作用而受到越来越多的重视。半乳甘露聚糖作为一种重要的天然多糖，是否也具有提高动物体抗氧化能力的功能，需要充分研究和利用。

半乳甘露聚糖不完全降解产物是指聚合度高于2(分子量342)的天然半乳甘露聚糖降解产物，其中不包括降解产物中的单糖。半乳甘露聚糖不完全降解产物是以富含半乳甘露聚糖的豆科植物种子为原料，如田菁、瓜尔豆、洋槐豆等，采用酸水解法或酶水解法制备。酸水解法反应速度快，但存在控制难、副产物多、分离纯化复杂等问题。生物酶法是通过B-甘露聚糖酶选择性降解半乳甘露聚糖，因其反应条件温和、选择性高、对环境污染负荷小等优点而逐渐成为规模化生产的首选方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料在提高蛋鸡抗氧化功能中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，是以含半乳甘露聚糖的豆科种子为原料，采用化学法或酶法降解得到的半乳甘露聚糖不完全降解产物。

进一步地，所述豆科种子选自田菁种子、瓜尔豆、槐豆和葫芦巴豆中的一种或多种。

进一步地，所述半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量在342-15000Da之间。

进一步地，所述酶解法所用的酶是内切甘露聚糖酶。

进一步地，所述酶法降解得到半乳甘露聚糖不完全降解产物的步骤为：

1)将含半乳甘露聚糖的豆科种子经机械粉碎，加入蒸馏水，抽提离心获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体；

2)称取半乳甘露聚糖粉状固体，加入蒸馏水、内切甘露聚糖酶、柠檬酸缓冲液，充分混合均匀，保持酶水解反应条件至反应结束，离心获得含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清；

3)取含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清，过滤除去其中单糖，得到截留液，经浓缩、干燥得到半乳甘露聚糖不完全降解产物。

进一步地，所述步骤1)具体为：将含半乳甘露聚糖的豆科种子经机械粉碎，按1∶50固液比加入蒸馏水，抽提离心获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。

进一步地，所述步骤2)具体为：称取半乳甘露聚糖粉状固体，加入蒸馏水、内切甘露聚糖酶、柠檬酸缓冲液，充分混合均匀，于半乳甘露聚糖底物浓度2％、酶加量20U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8、50℃下反应24h，酶水解反应结束后，使内切甘露聚糖酶失活，离心获得含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清。

进一步地，所述步骤3)具体为：取含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清，用分子量为200Da的纳滤膜过滤除去其中单糖，得到截留液，截留液经浓缩、干燥得到半乳甘露聚糖不完全降解产物。

一种含有所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂的蛋鸡饲料。

进一步地，所述的含有提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂的蛋鸡饲料中，半乳甘露聚糖不完全降解产物在蛋鸡饲料中的添加量为0.01％-0.05％。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的半乳甘露聚糖不完全降解产物作为饲料添加剂加入蛋鸡日粮中，能够增加蛋鸡体内抗氧化剂含量(谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶和总抗氧化能力)从而提高蛋鸡的抗氧化能力，其次是通过降低蛋鸡的丙二醛含量来提高抗氧化能力。这表明本发明提供的半乳甘露聚糖不完全降解产物是一种有效的能提高动物体抗氧化能力的饲料添加剂。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中，半乳甘露聚糖、半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量分布采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定。色谱条件如下：色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：Waters Ultrahydrogel TM 2000(7.8×300mm)、Waters Ultrahydrogel TM 250(7.8×300mm)和Waters Ultrahydrogel^TM120(7.8×300mm)三柱依次串联，保护柱：WatersUltrahydrogel^TMGuard Column(6×40mm)，检测器：示差检测器，流动相：水，流动相流速：0.60mL/min，柱温：65℃，进样体积：10.0μL，采用聚乙二醇作为标准样品进行分子量测定。

实施例1：半乳甘露聚糖不完全降解产物的制备

半乳甘露聚糖不完全降解产物的制备方法步骤如下：

(1)半乳甘露聚糖定向酶水解

含半乳甘露聚糖的豆科种子(田菁)经机械粉碎至20-100目，按1∶50固液比加入蒸馏水，于50℃抽提24h后，10000转/分离心10min，获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经冷冻干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。

称取上述半乳甘露聚糖20.0g于2L酶反应罐中，加入蒸馏水、内切甘露聚糖酶、1mol/L柠檬酸缓冲液使反应液体积为1000mL，充分混合均匀，于底物浓度2％、酶加量20U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8、50℃条件下反应24h，酶水解反应结束后，将酶水解液置于100℃下处理10min，使内切甘露聚糖酶失活，于10000转/分条件下离心10min，上清即为含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液。

(2)半乳甘露聚糖不完全降解产物的制备

取步骤(1)中的含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清1000mL，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为30％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清和沉淀。上清用分子量为200Da的纳滤膜过滤除去其中单糖，得到截留液。截留液经浓缩、干燥得到半乳甘露聚糖不完全降解产物。

结果表明，半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量范围由GPC测得为342-13500Da。

实施例2：含半乳甘露聚糖不完全降解产物的配合饲料配制

含半乳甘露聚糖不完全降解产物的配合饲料配制方法：

(1)蛋鸡配合饲料，可以是常规的蛋鸡商品饲料，也可以是按照常规配方自行配置的饲料，本实施例以玉米-豆粕型基础饲粮为例进行说明

蛋鸡配合饲料(玉米-豆粕型基础饲粮)组成如下：每100kg配合饲料含：玉米62kg，豆粕25kg，石粉8kg，预混料5kg(购于武汉华牧生物技术有限公司)。将玉米、豆粕、石粉、预混料充分混合均匀后，得到蛋鸡配合饲料。

(2)含半乳甘露聚糖不完全降解产物的蛋鸡饲料配制

分别取半乳甘露聚糖不完全降解产物22g、54g、109g与1kg步骤(1)的蛋鸡配合饲料混合均匀，再加入剩余的99kg蛋鸡配合饲料充分混合，获得分别含半乳甘露聚糖不完全降解产物220g/吨、540g/吨、1090g/吨的蛋鸡饲料。

实施例3：甘露聚糖不完全降解产物的蛋鸡饲料饲喂试验

试验方案：试验选用476日龄生产性能相近健康的海兰褐蛋鸡288只，随机分成I、II、III、IV四组，每组分6个重复，每个重复12只鸡。II、III、IV组为试验组，100kg蛋鸡饲料中分别含半乳甘露聚糖不完全降解产物22g、54g、109g。I组为空白对照组，仅饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，不含半乳甘露聚糖不完全降解产物添加剂。蛋鸡饲养于三层阶梯笼内，在开放式鸡舍内饲养。为最大程度减少温度、光线及其它非人为因素对结果的影响，各组鸡在南北两列鸡笼均有分布。乳头式饮水器自由饮水，每天16小时光照。每天喂料两次(上午6:00，下午3:00)，定时拨匀料槽中的饲料，使蛋鸡充分采食。根据上一天采食情况适当调整当天喂料量，保证当天晚上料槽中基本无剩料。预试两周后，进行正式试验，试验期为8周。

试验期结束后从每个重复中随机选择一只鸡，共24只鸡。使用消毒的针头和注射器从鸡翼静脉中采集血液样本，将样品在4℃下以3,000转/分离心15分钟分离血清，将获得的血清收集在新试管中，并保存在-20℃。然后将母鸡通过颈脱位安乐死，迅速将整个胃肠道移出并放置在冷冻的不锈钢托盘上，分开空肠(从胰腺环末端到Meckel憩室)和回肠(从Meckel憩室到回盲肠交界处)，无肠系膜，纵向打开空肠和回肠，并用冷的磷酸盐缓冲液冲洗，使用无菌玻璃显微镜载玻片小心刮擦空肠和回肠粘膜，用冻存管收集放置在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃以便进一步分析。

使用均质器，用冷的0.86％氯化钠溶液将约0.3g空肠或回肠粘膜均质化(1：9，wt/vol)，并在4℃下3,000转/分离心15分钟，将上清液保存在-20℃下以待后续分析。总蛋白浓度以牛血清白蛋白作为标准蛋白，根据Bradford法测定。超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力在血清、空肠和回肠中的水平使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定，试剂盒由南京建城生物工程研究所提供。

蛋鸡日粮中添加半乳甘露聚糖不完全降解产物对蛋鸡抗氧化指标的影响如表1所示，结果表明，在蛋鸡的基础饮食中补充半乳甘露聚糖不完全降解产物会提高超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力的水平。在评估任何动物的抗氧化能力时，总抗氧化能力，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性都是评估抗氧化能力的重要指标。其中，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶被认为是细胞中第一水平抗氧化防御的主要元素，因为它们形成了抵抗氧化损伤的主要保护系统。此外，总抗氧化能力还是酶和非酶抗氧化剂总体水平的有用代表。在本发明中，增加抗氧化剂水平的作用在四个组织或器官(血清，肝脏，空肠和回肠)中有所不同，在回肠中更为明显。同时，表1结果也表明在蛋鸡的基础饮食中补充半乳甘露聚糖不完全降解产物可以降低丙二醛含量。丙二醛含量可以反映脂质过氧化的程度，并间接反映细胞损伤的程度。由上可知，半乳甘露聚糖不完全降解产物主要通过增加抗氧化剂含量(谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶和总抗氧化能力)来提高抗氧化能力，其次是通过降低丙二醛含量来提高抗氧化能力。这表明本发明提供的半乳甘露聚糖不完全降解产物是一种有效的能提高动物体抗氧化能力的饲料添加剂。

表1半乳甘露聚糖不完全降解产物对蛋鸡抗氧化指标的影响

Claims (10)

1.一种提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，是以含半乳甘露聚糖的豆科种子为原料，采用化学法或酶法降解得到的半乳甘露聚糖不完全降解产物。

2.根据权利要求1所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述豆科种子选自田菁种子、瓜尔豆、槐豆和葫芦巴豆中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量在342-15000Da之间。

4.根据权利要求1所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述酶解法中的酶是内切甘露聚糖酶。

5.根据权利要求1所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述酶法降解得到半乳甘露聚糖不完全降解产物的步骤为：

1)将含半乳甘露聚糖的豆科种子经机械粉碎，加入蒸馏水，抽提离心获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体；

2)称取半乳甘露聚糖粉状固体，加入蒸馏水、内切甘露聚糖酶、柠檬酸缓冲液，充分混合均匀，保持酶水解反应条件至反应结束，离心获得含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清；

3)取含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清，过滤除去其中单糖，得到截留液，经浓缩、干燥得到半乳甘露聚糖不完全降解产物。

6.根据权利要求5所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述步骤1)具体为：将含半乳甘露聚糖的豆科种子经机械粉碎，按1∶50固液比加入蒸馏水，抽提离心获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物经干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。

7.根据权利要求5所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述步骤2)具体为：称取半乳甘露聚糖粉状固体，加入蒸馏水、内切甘露聚糖酶、柠檬酸缓冲液，充分混合均匀，于半乳甘露聚糖底物浓度2％、酶加量20U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8、50℃下反应24h，酶水解反应结束后，使内切甘露聚糖酶失活，离心获得含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清。

8.根据权利要求5所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂，其特征在于，所述步骤3)具体为：取含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶解液上清，用分子量为200Da的纳滤膜过滤除去其中单糖，得到截留液，截留液经浓缩、干燥得到半乳甘露聚糖不完全降解产物。

9.一种含有权利要求1所述的提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂的蛋鸡饲料。

10.根据权利要求9所述的含有提高抗氧化功能的蛋鸡饲料添加剂的蛋鸡饲料，其特征在于：半乳甘露聚糖不完全降解产物在蛋鸡饲料中的添加量为0.01％-0.05％。