CN109735637A - 预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苜蓿黄酮的应用领域，特别是指预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用。向猪场购买饲喂不同浓度苜蓿黄酮的断奶仔猪结肠；收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；以提取结肠微生物的DNA为模板，采用细菌16S通用引物，进行荧光定量PCR检测；分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；根据Miseq文库进行Miseq测序，并对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。苜蓿黄酮对结肠菌群组成具有一定影响作用，且添加0.2%苜蓿黄酮对其影响效果较明显。

Description

预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿 黄酮的应用

技术领域

本发明涉及苜蓿黄酮的应用领域，特别是指预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及提高苜蓿黄酮的应用价值。

背景技术

饲料中的营养物质不能直接吸收到仔猪体内，必须在消化道中消化才能将大分子有机物质分解成简单的，可溶的，被吸收的小分子。由于消化系统发育不完善，断奶应激而导致断奶仔猪肠损伤引起后续腹泻，最终的结果是采食量减少，消化能力不足，不仅仔猪的健康受到损害，而且还显着降低了仔猪的生长性能，这是对现代化全进全出隔离断奶饲养系统的严峻挑战，也是制约养猪业发展的重要因素。由于缺乏消化酶，仔猪的肠道微生物群落尚未建全，免疫能力差，体温调节能力差，这些决定了饲料营养需求的增加，仔猪的营养状况在后期生长中起关键的影响。以下介绍哺乳仔猪消化生理特点：1）仔猪出生24 h内，由于蛋白质和血清蛋白质成分相似，仔猪可以直接吸收初乳，直接吸收到血液中而不转化，从而使仔猪血清Y-球蛋白水平迅速提高，免疫力迅速提高。肠上皮细胞的渗透性随着肠道的发育而变化，并在36-72小时后显著降低；2）仔猪出生后，消化器官小、不发达，在哺乳期增长迅速，随后增长减缓，到8-9月才接近成年水平；3）仔猪出生后，胃中只有凝乳酶，唾液酶和少量的胃蛋白酶；胃底腺发育不良，缺乏游离盐酸，胃蛋白酶无活性，不能消化蛋白质，只有胰腺和肠腺发育较完全，胰蛋白酶，肠淀粉酶和乳糖酶活性较高，胃液分泌不足，仔猪胃和神经系统尚未建立，缺乏条件反射式的胃液分泌，随着年龄的增长和食物的刺激胃壁，盐酸分泌增加，使2.5-3个月龄的酸浓度接近正常猪；4）食物通过消化道的时间很短，15日龄大约1.5小时，30日龄大约3-5小时，60日龄大约16-19小时，成年大约30小时；5）成年猪的大肠中有大量的微生物，种类和数量相对固定; 出生在仔猪中的消化道是无菌的，随着吃奶过程，微生物开始出现，并随着生长而增加，直至形成正常的微生物群落。正常微生物抑制病原微生物的繁殖，同时刺激机体的免疫功能，减少消化系统疾病的发生。未断奶仔猪的正常菌群未形成，易发生肠道疾病，消化吸收功能的紊乱与肠道疾病的发生均与肠道微生物区系有关。

黄酮类化合物作为一种天然抗氧化剂受到广大学者关注，关于黄酮类化合物抗氧化作用及相关生理生化机制研究也越来越深入。苜蓿黄酮在母猪饲料中作为饲料添加剂应用，但在仔猪方面未见应用。有研究表明，苜蓿黄酮还有抗癌、抗氧化、促进脂质代谢等多种药理作用。苜蓿黄酮在牛羊方面关于免疫、抗氧化的研究很多。但目前，苜蓿黄酮在断奶仔猪免疫及抗氧化性能的研究能应用到仔猪饲料中未见报道。因此，本试验目的是探讨苜蓿黄酮对断奶仔猪生长性能、养分消化率、血清免疫及抗氧化性能、肝脏抗氧化性能影响，为断奶仔猪在免疫及抗氧化方面的分子作用机理机制及苜蓿黄酮能在养猪场中断奶仔猪饲料方面的应用奠定理论基础。随着研究的深入，对苜蓿中生物活性物质研究越来越多，包括苜蓿皂苷、苜蓿黄酮、苜蓿多糖，其中苜蓿黄酮的研究很多，但是苜蓿黄酮在动物上的研究还比较少，特别是猪这一方面，而且作用机理机制在许多方面还不清楚。研究发现，苜蓿黄酮可以改变奶牛瘤胃细菌的群落结构和组成。通过体外培养法，厌氧条件下培养液中大豆异黄酮浓度为100 mg/L，对山羊瘤胃代谢影响最显著。研究表明，苜蓿黄酮可以稳定瘤胃绵羊发酵功能，且受添加量影响。苜蓿黄酮对仔猪的生长性能的影响未见报道，苜蓿黄酮和大豆黄酮都属于黄酮类化合物。程忠刚等研究发现，添加大豆黄酮对断奶仔猪生长性能中的平均日增重和料肉比差异不显著。

近几十年来，养猪业由于抗生素的滥用，使猪肠道细菌产生了耐药性和药物残留。因此，寻找一种抗生素替代品无药物残留、无耐药性、无副作用的绿色添加剂成为近年来人们关注的热点，其中植物提取物是研究的热点之一。黄酮类化合物由于独特的γ-吡喃苯环结构，因此具有以下多种药理作用，如抗癌，抗氧化，抗菌，促进脂类代谢和类雌激素样作用等，因其促进动物健康和提高生产性能而广受关注。苜蓿黄酮在未来，很有可能作为一种绿色饲料添加剂、保健剂用于仔猪饲料中，使养猪业减少抗生素等药物的应用，提高仔猪机体免疫力。

研究肠道微生态的方法很多，高通量测序技术可以全面的反应肠道微生态的丰度及多样性的优点而被广泛应用于研究猪肠道微生物。目前，苜蓿黄酮对猪肠道方面的影响研究未见报道。因此，本试验通过16r DNA高通量测序的方法研究苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系的影响。探讨苜蓿黄酮是如何改变结肠微生物区系来影响仔猪肠道营养及消化代谢的，为苜蓿黄酮在仔猪中的应用提供一些参考价值。

发明内容

本发明提出预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及提高苜蓿黄酮的应用潜力与价值，研究现有技术中苜蓿黄酮对结肠菌群多样性影响的理论问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，步骤如下：

（1）向猪场购买分别以梯度浓度的苜蓿黄酮日粮喂养的断奶仔猪的结肠；

（2）收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；

（3）以提取结肠微生物的DNA为模板，以细菌16S通用引物为引物，进行荧光定量PCR检测；

（4）分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；

（5）根据Miseq文库进行Miseq测序；

（6）对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。

所述苜蓿黄酮日粮是指向基础日粮中添加基础日粮质量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。

所述16S通用引物为338F序列如5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3´所示、806R序列如5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3´所示。

所述双端序列数据进行分析的步骤为：根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据；通过i-Sanger云分析平台对优化数据进行生物信息学分析，根据序列相似度为97%的原则，将序列分为多个操作分类单元；通过云平台进行细菌群落丰富度和多样性分析，物种组成分析，样本比较分析，物种差异分析及进化分析。

苜蓿黄酮作为断奶仔猪日粮添加剂的应用，步骤为：向基础日粮中加入其质量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。

苜蓿黄酮作为调节结肠菌群的应用，苜蓿黄酮作为提高梭菌属、粪球菌属、真细菌属、NC2004属、Anaerotruncus属细菌的相对丰度和降低NK3B31属、Alloprevotella属、Blautia属、拟杆菌属相对丰度的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）随着苜蓿黄酮添加量的增加，厚壁菌门相对丰度呈曲线升高趋势(P＞0.05)，拟杆 菌门相对丰度呈曲线下降趋势(P＞0.05)。在属水平上，UCG-014、Erysipelotrichaceae和胃球菌属相对丰富度各组间差异显著（0.01＜P＜0.05），Anaerotruncus 相对丰度各组间差异极显著（P＜0.01）。梭菌属相对丰度中，Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组都高于对照组（P＜0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，乳酸菌属相对丰度呈先下降再上升再下降的趋势而Ⅳ组与对照组相比有下降趋势（P＞0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，链球菌属相对丰度呈线性升高趋势，在0.2%苜蓿黄酮组升高效果较好（P＞0.05）；粪球菌属相对丰度呈线性升高趋势，在0.2%苜蓿黄酮组升高效果显著（P＜0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，NK3B31、S24-7、Alloprevotella、Blautia、拟杆菌属、氏菌属相对丰度呈曲线下降趋势（P＞0.05）；真细菌属和Anaerotruncus相对丰度中Ⅱ组显著高于对照组（P＜0.05）；NC2004相对丰度中Ⅲ组显著高于对照组（P＜0.05）；UCG-014和Erysipelotrichaceae相对丰度呈先升高再降低再升高的趋势（P＞0.05）；胃球菌属相对丰度呈先升高再降低的趋势（P＞0.05）。乳酸菌属、S24-7、链球菌属、普氏菌属、Alloprevotella、Blautia、拟杆菌属、氏菌属和UCG-014相对丰度低于对照组的趋势（P＞0.05）。梭菌属和Anaerotruncus相对丰度显著高于对照组（P＜0.05）。以上结果说明，苜蓿黄酮对结肠菌群组成具有一定影响作用，且添加0.2%苜蓿黄酮对其影响效果较明显。

（2）本发明首次建立了苜蓿黄酮用于断奶仔猪后微生物区系变化的一种有效检测方法；该方法将快速、高通量的现代生物技术应用于微生物的分离鉴定；饲粮中添加苜蓿黄酮可以显著影响结肠细菌丰富度且0.1%苜蓿黄酮组影响较大，在门水平上，随着苜蓿黄酮添加量的增加，优势菌门中，厚壁菌门相对丰度有提高的趋势而拟杆菌门有降低的趋势。在属水平上，苜蓿黄酮可以显著提高梭菌属、粪球菌属、真细菌属、NC2004属、Anaerotruncus属细菌的相对丰度而有降低NK3B31属、Alloprevotella属、Blautia属、拟杆菌属的相对丰度的趋势；。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于97%相似性的原则进行OTU分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1. 试验材料

苜蓿黄酮由陕西绿清生物工程有限公司提供，为黄色粉末，其中总黄酮含量为50%。

2. 试验主要试剂

医用生理盐水、酒精、蒸馏水、10%酒石酸水溶液、液氮、检测免疫及抗氧化试剂盒（南京建成生物工程研究所）

试验主要仪器

Eppendorf Research*plus 200µL单道移液器、Eppendorf Research*plus 1000µL单道移液器、Eppendorf Research*plus 40µL单道移液器、Eppendorf Research*plus 5000µL单道移液器、Unico7200分光光度计、100℃水浴锅（北京市医疗设备厂）、CHA-S恒温气浴箱（常州国华）、混匀器SK-1（常州国华）、FS-2可调高速匀浆机（常州国华）、低温可调离心机（北京离心机厂）

3. 试验设计

试验采用单因素完全随机化设计，按照胎次、体重相近的原则，选取35日龄“杜长大”三元杂交断奶仔猪120头，公母各半。试验随机分成5组，每组3个重复，每个重复8头猪。对照组: 饲喂基础日粮；0.1%苜蓿黄酮组（Ⅰ组）：饲喂基础饲粮+1 g/kg苜蓿黄酮；0.2%苜蓿黄酮组（Ⅱ组）：饲喂基础饲粮+2 g/kg苜蓿黄酮；0.4%苜蓿黄酮组（Ⅲ组）：饲喂基础饲粮+ 4 g/kg 苜蓿黄酮。

4. 试验饲养管理与饲粮

试验在许昌市许昌县苏桥镇许昌缘自然农业发展有限公司进行，试验期间所有仔猪都是自由采食、自由饮水，并且按照猪场的常规管理程序驱虫、消毒、免疫防疫，预试验3 d，正式试验32 d。

试验期间的断奶仔猪以及基础饲粮都由郑州市大北农饲料科技有限公司提供。饲料原料包括：玉米、发酵豆粕、膨化豆粕、大豆浓缩蛋白、乳清粉、鱼粉、豆油、氯化锌、石粉、氨基酸、氨基酸盐及其类似物、矿物质元素及其螯合物、乳猪0.5%复合预混合饲料（大北农集团）。

5. 样品的采集

收集正式试验32 d的仔猪的结肠内容物，每组每个重复随机选取一个，将内容物挤到5ml冻存管里面，立刻放入液氮罐，带实验室-70℃冰箱保存。

6. 结肠微生物

6.1 DNA提取

先进行结肠微生物DNA的提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA，NanoDrop2000方法进行DNA浓度及纯度的检测。

6.2 PCR扩增

引物由上海美吉生物医药科技有限公司提供并合成，引物序列如表1。为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件，1) 尽可能使用低循环数扩增；2) 保证每个样本扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样本进行预实验，确保在最低循环数中使绝大多数样本能够扩增出浓度合适的产物。在预实验完成后，PCR （ABI GeneAmp® 9700型）正式试验采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20µL反应体系：FastPfu Buffer(5×)，4 µL；2.5mM dNTPs，2 µL；Forward Primer（5 µM），0.8µL；ReversePrimer (5 µM），0.8µL；FastPfu Polymerase，0.4 µL；BSA， 0.2 µL；Template DNA，10 ng；补ddH₂O至，20µL。PCR扩增反应程序：95℃预变性3 minutes；95℃变性30 seconds，58℃退火30 seconds，72℃延伸45 seconds，进行循环，72℃延伸10minutes，10℃保存。每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱； 2%琼脂糖电泳检测。

6.3 荧光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor™ -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

6.4 Miseq文库的构建

通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

6.5 Miseq测序

1) DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；2) 以DNA片段为模板，芯片上固定的碱基序列为引物进行PCR合成，在芯片上合成目标待测DNA片段；3) 变性、退火后，芯片上DNA片段的另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥（bridge）”；4)PCR扩增，产生DNA簇；5) DNA扩增子线性化成为单链。6) 加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；7) 用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；8) 将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；9) 统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

表1 细菌16S通用引物序列

6.6 数据分析

MiSeq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。通过i-Sanger云分析平台对优化数据进行生物信息学分析，根据序列相似度为97%的原则，将序列分为多个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。通过（http://www.i-sanger.com/）云平台进行细菌群落丰富度和多样性分析，物种组成分析，样本比较分析，物种差异分析及进化分析。

6.7 统计分析

数据采用Excel 进行整理，结果采用（http://www.i-sanger.com/）云平台物种差异分析中的单因素方差分析进行差异显著性检验，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

7. 结果与分析

7.1 苜蓿黄酮对结肠细菌丰富度和多样性的影响

试验经i-Sanger云平台优化后得到595701条优化序列，优化碱基数目为260613951，平均序列长度为437 nt。试验Ⅲ组优化序列相对较高，随着苜蓿黄酮添加量升高，优化序列呈先升高后降低再升高趋势，但都比对照组高；Ⅳ组与对照组相比，低于对照组（表2）。各样品的稀释曲线趋于平缓，随着测序深度的增加，OTU水平的sobs指数将不再增加，说明测序数量比较合理。基于97%相似性的原则进行OTU分析（图1）,5个组共产生484个OTU，各组分别产生OTU数量为418（对照组）、463（Ⅰ组）、379（Ⅱ组）、446（Ⅲ组）、406（Ⅳ组），其中共享327个OTU，占总OTU数量的67.56%。从表2中可知，sobs指数中各组之间OTU实际观测值无显著差异（P＞0.05）；ACE指数中Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组与对照组相比都有上升的趋势且随着苜蓿黄酮量的提高，这三个指数都是先升高再降低又升高的趋势，ACE指数Ⅰ组显著高于对照组（P＜0.05）；chao指数Ⅰ组显著高于对照组（P＜0.05）,Ⅰ组显著高于Ⅳ组（P＜0.05），说明苜蓿黄酮显著影响结肠细菌丰富度且0.1%苜蓿黄酮组影响较大。各组中的香浓指数和辛普森指数都无显著差异（P＞0.05），说明苜蓿黄酮对结肠细菌的多样性无显著影响。

表2 苜蓿黄酮对结肠细菌丰富度和多样性的影响

注：sobs、chao和ACE指数表示细菌丰富度，香浓和辛普森指数表示细菌多样性。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）,相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）。下同。

表3 苜蓿黄酮对结肠细菌组成和结构的影响（门水平）

表4 苜蓿黄酮对结肠细菌组成和结构的影响（属水平）

7.2苜蓿黄酮对结肠细菌组成和结构的影响

在门水平上（表3），随着苜蓿黄酮添加量的增加，厚壁菌门相对丰度呈曲线升高趋势(P ＞0.05)，拟杆菌门相对丰度呈曲线下降趋势(P＞0.05)。在属水平上（表4），UCG-014、Erysipelotrichaceae和胃球菌属相对丰富度各组间差异显著（0.01＜P＜0.05），Anaerotruncus相对丰度各组间差异极显著（P＜0.01）。梭菌属相对丰度中，Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组都高于对照组（P＜0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，乳酸菌属相对丰度呈先下降再上升再下降的趋势而Ⅳ组与对照组相比有下降趋势（P＞0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，链球菌属相对丰度呈线性升高趋势，在0.2%苜蓿黄酮组升高效果较好（P＞0.05）；粪球菌属相对丰度呈线性升高趋势，在0.2%苜蓿黄酮组升高效果显著（P＜0.05）。随着苜蓿黄酮添加量的增加，NK3B31、S24-7、Alloprevotella、Blautia、拟杆菌属、氏菌属相对丰度呈曲线下降趋势（P＞0.05）；真细菌属和Anaerotruncus相对丰度中Ⅱ组显著高于对照组（P＜0.05）；NC2004相对丰度中Ⅲ组显著高于对照组（P＜0.05）；UCG-014和Erysipelotrichaceae相对丰度呈先升高再降低再升高的趋势（P＞0.05）；胃球菌属相对丰度呈先升高再降低的趋势（P＞0.05）。乳酸菌属、S24-7、链球菌属、普氏菌属、Alloprevotella、Blautia、拟杆菌属、氏菌属和UCG-014相对丰度低于对照组的趋势（P＞0.05）。梭菌属和Anaerotruncus相对丰度显著高于对照组（P＜0.05）。以上结果说明，苜蓿黄酮对结肠菌群组成具有一定影响作用，且添加0.2%苜蓿黄酮对其影响效果较明显。

8 讨论

动物肠道内微生物的数量庞大，种类多，是构成动物必要的稳定的微生态系统，对病原菌的入侵有屏障作用，对营养物质的吸收有促进作用。断奶仔猪微生态系统容易受生理、环境、营养等应激的影响而发生变化，导致疾病发生。高通量测序技术可以快速高效的了解微生物群落结构和种类，更全面的了解苜蓿黄酮对结肠微生物区系的影响。

Sobs指数是用来估算OTU实际观测值，观测值升高后趋于水平说明测序数量比较合理。Chao指数是用来估计样本中OTU数目的指数，chao指数越大，说明物种丰富度越大。ACE指数也是用来估计OTU数目的指数。Shannon和Simpson指数是用来估算微生物多样性指数的。Shannon指数越大，说明微生物多样性越高；Simpson指数越大，说明微生物多样性越低。实验中，各组之间的Shannon和Simpson指数趋于平衡，说明苜蓿黄酮对结肠微生物多样性无显著影响。试验结果表明，各试验组中仔猪结肠内厚壁菌门和拟杆菌门是优势菌门，这两菌门占总菌门的95%以上。研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门是仔猪粪便中的含量最高的菌门，这一结果与该试验的结果相符。陈强等研究表明，断奶仔猪肠道中厚壁菌门和拟杆菌门可对肠道中代谢碳水化合物发酵发挥作用。所以，厚壁菌门和拟杆菌门在断奶仔猪结肠肠道中起着至关重要的作用。

在属水平中，乳酸菌属属于优势菌属，是一种有益菌属，能治疗奶牛生殖道疾病的抗生素替代物之一。从试验数据来看，添加苜蓿黄酮对仔猪结肠微生物中的乳酸菌属有增加的趋势。随着苜蓿黄酮添加量的增加，梭菌属的相对丰度有显著增加，0.2%苜蓿黄酮组相对丰度增加不显著，说明0.2%苜蓿黄酮很有可能抑制梭菌属的作用。凌代文等研究发现梭菌属可以发酵多种碳水化合物。苜蓿黄酮梯度组中Blautia相对丰度与对照组相比显著降低，说明苜蓿黄酮对Blautia属有可能起到抑制作用。占今舜等研究表明苜蓿黄酮对Blautia属很可能产生抑制作用，这与本试验的结果一致。NK3B31和Prevotella 9都属于普氏菌属，这两菌属的相对丰度中，苜蓿黄酮梯度组相比于对照组都有降低的趋势。孔祥杰等研究表明，普氏菌属有降解半纤维素的作用。占今舜等^[136]研究表明，苜蓿黄酮可能有提高普氏菌属数量的作用，这与本试验的结果相反。从本试验结果来看，苜蓿黄酮都很有可能提高胃球菌属的相对丰度，添加0.4%苜蓿黄酮对胃球菌属很有可能起到抑制作用。孔祥杰等研究发现，胃球菌属可以利用日粮纤维物质提供的能量来维持自身生长繁殖需要。王鹏等研究发现，胃球菌属和普氏菌属都具有分解纤维类物质的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）向猪场购买饲喂不同浓度苜蓿黄酮的断奶仔猪结肠；

（2）收集进食不同苜蓿黄酮结肠的内容物，并提取结肠内容物中微生物的DNA；

（3）以提取结肠微生物的DNA为模板，采用细菌16S通用引物，进行荧光定量PCR检测；

（4）分别收集荧光定量PCR产物，用氢氧化钠溶液变性，产生单链DNA片段，构建Miseq文库；

（5）根据Miseq文库进行Miseq测序；

（6）对Miseq测序得到的双端序列数据进行分析。

2.根据权利要求1所述的预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于：所述苜蓿黄酮日粮是指向基础日粮中添加基础日粮质量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。

3.根据权利要求1所述的预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于：所述16S通用引物为338F序列如5´-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3´所示、806R序列如5´-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3´所示。

4. 根据权利要求1所述的预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法，其特征在于，所述双端序列数据进行分析的步骤为：根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据；通过i-Sanger云分析平台对优化数据进行生物信息学分析，根据序列相似度为97%的原则，将序列分为多个操作分类单元；通过云平台进行细菌群落丰富度和多样性分析，物种组成分析，样本比较分析，物种差异分析及进化分析。

5.苜蓿黄酮作为断奶仔猪日粮添加剂的应用，其用法是：向基础日粮中加入其干物质含量0.1-5%wt的苜蓿黄酮。

6.苜蓿黄酮作为调节结肠菌群的应用，其特征在于：苜蓿黄酮作为提高梭菌属、粪球菌属、真细菌属、NC2004属、Anaerotruncus属细菌的相对丰度和降低NK3B31属、Alloprevotella属、Blautia属、拟杆菌属相对丰度的应用。