CN104099323A - 一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法 - Google Patents
一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104099323A CN104099323A CN201410341823.0A CN201410341823A CN104099323A CN 104099323 A CN104099323 A CN 104099323A CN 201410341823 A CN201410341823 A CN 201410341823A CN 104099323 A CN104099323 A CN 104099323A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- add
- dna
- centrifuge tube
- rumen
- adds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，利用物理、化学和酶等多种方法配合对细胞壁进行裂解，使之能够最大限度释放微生物DNA，特别是对革兰氏阳性菌有很好的裂解效果；另外，本发明所用的化学试剂都是实验室常备的，容易获得且价格低廉。使用本发明得到的高通量测序结果能够比较准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。
Description
技术领域
本发明涉及生物实验技术，尤其是一种用于评价反刍动物瘤胃微生物群落多样性的DNA提取方法。
背景技术
反刍动物瘤胃内存在着丰富的微生物菌群，这些微生物菌群能够通过发酵，将难以消化的纤维素转化为可以被小肠吸收的蛋白质、氨基酸、糖类、酸类和脂类等，为反刍动物提供营养物质。另外，这些微生物对机体的免疫、生长发育等方面也有着巨大的影响。因此，它们的分离和鉴定对于研究瘤胃菌群功能具有重要作用。此外，瘤胃微生物作为一个巨大的基因库，探索其中具有应用价值的基因，可以应用于农牧业，医疗保健，生物化工等方面，从而更好地为人类服务。
传统分离瘤胃微生物的方法主要是通过选择性培养基分离法。由于培养条件的限制，迄今为止，瘤胃中微生物只有小部分能够被培养，绝大多数还不为人所知。近年来，随着分子生物学技术的发展，产生了一些新的微生物研究方法，如：变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)，末端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphisms,T-RFLP)以及高通量测序方法(high throughput sequencing technology)这些方法突破了微生物分离培养的限制，能够用于全面分析自然界的微生物类群及充分挖掘基因资源。然而，对于这些基于核酸技术来分析样本微生物结构的方法，DNA提取的质量好坏，会直接影响到微生物群落结构分析结果。因此，探索简便、高效、低成本的DNA提取方法将是研究瘤胃微生物菌落结构研究所面临的重要难题。
牦牛大多生活在高海拔，低氧，低温，采食恶劣的环境中，由于所处的恶劣让牦牛消化系统更加高效和稳定，保障其生存和繁衍。再加上如今经济全球化，环境污染和生物入侵日渐加重，青藏高原作为地球上不多的未受大规模污染的地方，不论生态环境还是饲养方法都是出于比较原始的状态。牧区由于畜牧医疗技术的相对落后及抗生素等药物的慎用，保证了牦牛瘤胃中的大量微生物是处在原始状态，未受到人为因素影响的。因此，牦牛也是研究瘤胃微生物群落结构的最好的模式动物。另外，与规模舍饲养殖的牛群相比，由于特殊的采食环境，牦牛瘤胃内往往含有大量的腐殖质和泥沙，这些物质会对DNA提取产生影响并增加基因组提取的难度，因此探索一套适合于牦牛瘤胃微生物DNA提取方法具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的提供一种更适合的牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，使之更为准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种用于分析牦牛瘤胃微生物群落多样性提取方法，包括以下步骤：
(1)向0.5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4℃样品洗涤液A，涡旋振荡1min4℃离心机，1000r/min,离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液。所有上清液于4℃，12000r/min离心10min，小心倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥土混合物的沉淀层。
(2)微生物沉淀层里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于58℃恒温摇床孵育1h。
加入100ul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65℃水浴10min。
加入0.1g直径为0.2mm beads，放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交替震荡3min。
加入溶菌酶3mg,颠倒混匀，放置于37℃恒温摇床，孵育1h。
加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置，3min,12000r/min抽提蛋白质。
吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)混匀于冰上静置3min。
12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置5min。
12000r/min离心5min,吸取上清液放置于新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，重悬，室温放置5min。
12000r/min离心10min，加入1ml70％冰乙醇洗涤。
12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解。
加入3ul RNA酶，37℃，静置1h，获得纯度较高的DNA溶液。
用分光光度计对DNA溶液浓度和纯度进行测定，结果表OD260/OD230＝1.93，OD260/OD280＝1.85，均接近标准值(DNA溶液OD260/OD230标准值为2.0，OD260/OD280＝1.8)，DNA量达到0.5ug-2ug(达到了后续相关高通量测序对DNA量要求)；以0.8％琼脂糖凝胶电泳，λDNA作为对照，检测所提取DNA片段完整性，电泳结果发现所提取的DNA具有较好的完整性。
上述步骤中的洗涤液A为PBS缓冲液，可以避免渗透压不同而造成的细胞裂解。
上述步骤中的裂解缓冲液B为TE缓冲液(pH＝7)，可以维持后续反应的最佳理化条件。
上述步骤中的CTAB裂解液浓度为10％。
上述步骤中的蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml。
上述步骤中的NaCl溶液为5mol/L。
本发明是利用物理、化学和酶等多种方法对细胞壁进行裂解，从而能够最大限度释放微生物DNA，特别是对革兰氏阳性菌有很好的裂解效果；另外，本发明所用的化学试剂都是实验室常备的，容易获得且价格低廉。使用本发明得到的高通量测序结果能够比较准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。
附图说明
图1为本发明提取的牦牛瘤胃微生物基因组DNA电泳图谱。
图2为不同DNA提取方法得到的牦牛瘤胃微生物群体结构分布图(在门分类水平上)。图中可以看出不同DNA基因组提取方法所得到的微生物结构存在差异。
图3为不同DNA提取方法得到牦牛瘤胃微生物群体结构Heat-map比对图，为基于样品丰度前50的瘤胃细菌群体的热图。Heat-map中，其用颜色深浅来表示所代表数值大小，通过颜色直观变化，可以反映不同DNA提取方法之间微生物群体结构数据差异.图中可以看出本发明(方法6)提取的瘤胃微生物的基因组能够较真实全面反映瘤胃内部微生物结构。
具体实施方式
以下结合具体实例进一步详细描述本发明的技术方案。
Nacl、Kcl、Na2HPO4、KH2PO4、CTAB、碱性饱和酚、氯仿、异戊醇等试剂均为国产分析纯试剂，蛋白酶K，溶菌酶均为进口生物纯试剂。
实施例1：瘤胃内容物采集
用灭菌手术刀，在刚从宰杀牦牛体内取出的瘤胃背部打开约10CM的平整外翻切口。带一次性灭菌手套，支撑切口，采样者手戴一次性灭菌手套，持已经灭菌50ml离心管，在未打开的情况下，探入瘤胃中开盖，充分搅动样品使瘤胃内容物能够充分混匀，装入离心管。离心管装满后，应当在瘤胃中立即盖严，然后取出，迅速投入干冰当中冻存，迅速带回实验室于-80℃冰箱中保存。
实施例2：微生物菌体获得
为了保证微生物DNA中没有过多的动植物细胞DNA污染，微生物菌体沉淀的获得后续获得高质量微生物DNA的前提。向0.5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4℃样品洗涤液A，涡旋振荡1min4℃离心机，1000r/min，离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A,放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液。所有上清液于4℃，12000r/min离心10min，小心倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥土混合物的沉淀层。
实施例3：微生物基因组提取
微生物菌体团里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于58℃恒温摇床孵育1h。
加入100ul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65℃水浴10min；
加入0.1g直径为0.2mm beads，放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交替震荡3min。
加入溶菌酶3mg,颠倒混匀，放置于37℃恒温摇床，孵育1h。
加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置，3min，12000r/min抽提蛋白质。
吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)混匀于冰上静置3min。
12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置5min.
12000r/min离心5min，吸取上清液放置于新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，重悬，室温放置5min.
12000r/min离心10min，加入1ml70％冰乙醇洗涤
12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解，
加入3ul RNA酶，37℃，静置1h，获得纯度较高的DNA溶液。
实施例3DNA浓度、纯度及完整性检测
采用分度光度计对提取的DNA溶液纯度、浓度进行检查。结果表明：OD260/OD230＝1.93，OD260/OD280＝1.85，均接近标准值(DNA溶OD260/OD230标准值为2.0，OD260/OD280＝1.8)，DNA量达到0.5ug-2ug(达到了后续相关高通量测序对DNA量要求)。以0.8％琼脂糖凝胶电泳，λDNA作为Marker，电压为150V，电泳时间为45min，对提取的DNA片段完整性进行检查，如图1所示,电泳结果发现所提取的DNA具有较好的完整性。
实施例416rDNA PCR扩增及高通量测序分析
对实施例2中提取的DNA进行16S rDNA的PCR扩增并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。16S rDNA通用引物(338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’),PCR产物送至深圳华大基因研究院进行高通量测序及数据分析。基于Illumina MiSeq PE300(Illumina,USA)测序平台，对瘤胃基因组进行16S rRNA高通量测序。Miseq测序得到的raw reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。序列过滤后，将那些具有高度相似性(97％)的序列归为一个OTU(Operational Taxonomic Unit)，同时，RDP(Ribosomal Database Project)数据库被用于物种分类学分析。基于以上分类学信息，ACE丰度指数及Shannon多样性指数被估算出来，具体测序信息见表1，从表1中可以看出本发明提取的DNA具有较高的微生物群体多样性及丰度指数。
表1 本发明提取牦牛瘤胃微生物DNA相关16S rDNA测序信息
实施例5牦牛瘤胃微生物基因组不同提取方法比较
为证明本发明在提取牦牛瘤胃微生物基因组上的优越性，我们将其和其它常规的DNA提取方法进行了比对，其中16s rDNA高通量测序结果作为主要比较参数，不同DNA提取方法具体参数见表2。另外，由于瘤胃样品和粪便样品存在一定的相似性，一些研究者常采用粪便试剂盒去提取瘤胃样品微生物DNA；鉴于此，本发明也将和QIA amp DNA Stool MiniKit进行方法的比对。各方法提取出的DNA进行16S rDNA的PCR扩增并将扩增产物送至深圳华大基因研究院进行高通量测序及数据分析并比较它们的DNA提取效率。由于高通量测序技术对DNA产量、纯度及片段完整性的要求限制，方法2及8不能够成功地进行高通量测序分析。根据微生物菌群分类学分析结果，可以得知不同提取方法得到DNA样品在分类水平上的比对情况(见图2)。另外，基于菌群结构分析生成了不同提取方法间微生物群体结构Heat-map比对图，其用颜色深浅代表菌体相对丰度，通过颜色直观变化，可以反映不同DNA提取方法之间微生物结构群体差异(见图3)。基于Heat-map比对结果，黑色条框(代表较低丰度)越少则反映这种方法效率越高，我们可以判定DNA提取方法的优劣。从图中可以看出本发明(方法6)提取的瘤胃微生物的基因组能够较真实全面反映瘤胃内部微生物结构。因此，本发明被验证是较优的牦牛瘤胃微生物DNA提取方法。
表2 不同牦牛瘤胃微生物DNA提取方法的相关参数
a细胞悬液经5％CTAB(w/v)溶液处理。
b细胞悬液经1％SDS(w/v)溶液处理。
c细胞悬液经0.3mg/ml Proteinase K处理。
d细胞悬液经0.3mg/ml Lysozyme处理。
Claims (3)
1.一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，包括以下步骤：
(1)向0.5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4℃样品洗涤液A，涡旋振荡1min，4℃离心机，1000r/min,离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；所有上清液于4℃，12000r/min离心10min，倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥土混合物的沉淀层；
(2)微生物沉淀层里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于58℃恒温摇床孵育1h；
加入100ul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65℃水浴10min；
加入0.1g直径为0.2mm beads，放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交替震荡3min；
加入溶菌酶3mg,颠倒混匀，放置于37℃恒温摇床，孵育1h；
加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置，3min,12000r/min抽提蛋白质；
吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)混匀于冰上静置3min；
12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置5min；
12000r/min离心5min,吸取上清液放置于新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，重悬，室温放置5min；
12000r/min离心10min，加入1ml70％冰乙醇洗涤；
12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解；
加入3ul RNA酶，37℃，静置1h，获得目标纯度DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，其特征在于,所述洗涤液A为PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，其特征在于,所述裂解缓冲液B为TE缓冲液(pH＝7)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410341823.0A CN104099323A (zh) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | 一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410341823.0A CN104099323A (zh) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | 一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104099323A true CN104099323A (zh) | 2014-10-15 |
Family
ID=51667865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410341823.0A Pending CN104099323A (zh) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | 一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104099323A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560951A (zh) * | 2014-12-03 | 2015-04-29 | 复旦大学泰州健康科学研究院 | 一种宏基因组dna的提取方法及其试剂盒 |
| CN104789675A (zh) * | 2015-04-15 | 2015-07-22 | 江苏师范大学 | 一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法 |
| CN105695451A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-06-22 | 南京大学 | 一种人体胃中微生物总dna的提取方法 |
| CN109735637A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-05-10 | 河南农业大学 | 预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用 |
| CN113643750A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-12 | 浙江大学 | 一种基于母本反刍动物瘤胃菌群结构预测子代生长性状的方法 |
-
2014
- 2014-07-18 CN CN201410341823.0A patent/CN104099323A/zh active Pending
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 刘薇等: "奶牛瘤胃微生物DNA 提取法的研究与优化", 《动物生产》 * |
| 安登第: "牦牛瘤胃微生物基因组文库构建与16S rDNA生物多样性研究", 《中国博士论文全文数据库》 * |
| 张玲等: "双峰驼瘤胃微生物总DNA 的提取与纯化", 《新疆农业科学》 * |
| 徐文华等: "秦川牛瘤胃微生物ＤＮＡ提取方法的比较试验", 《中国牛业科学》 * |
| 李旦等: "瘤胃微生物总DNA 提取方法的比较", 《中国农学通报》 * |
| 淡瑞芳等: "瘤胃微生物总DNA 快速提取法研究", 《家畜生态学报》 * |
| 许发芝等: "一种直接用于PCR 扩增的山羊瘤胃微生物DNA 提取方法的建立", 《中国微生态学杂志》 * |
| 邹彩霞等: "水牛瘤胃微生物总DNA提取方法的研究", 《广西畜牧兽医》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560951A (zh) * | 2014-12-03 | 2015-04-29 | 复旦大学泰州健康科学研究院 | 一种宏基因组dna的提取方法及其试剂盒 |
| CN104789675A (zh) * | 2015-04-15 | 2015-07-22 | 江苏师范大学 | 一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法 |
| CN105695451A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-06-22 | 南京大学 | 一种人体胃中微生物总dna的提取方法 |
| CN105695451B (zh) * | 2016-04-19 | 2019-02-15 | 南京大学 | 一种人体胃中微生物总dna的提取方法 |
| CN109735637A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-05-10 | 河南农业大学 | 预测苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠微生物区系影响的方法及苜蓿黄酮的应用 |
| CN113643750A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-12 | 浙江大学 | 一种基于母本反刍动物瘤胃菌群结构预测子代生长性状的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kakirde et al. | Size does matter: application-driven approaches for soil metagenomics | |
| Fellström et al. | Phenotypical characterisation of intestinal spirochaetes isolated from pigs | |
| Yooseph et al. | A metagenomic framework for the study of airborne microbial communities | |
| CN104099323A (zh) | 一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的dna提取方法 | |
| Chen et al. | Effect of DNA extraction methods on the apparent structure of yak rumen microbial communities as revealed by 16S rDNA sequencing | |
| Ravin et al. | Metagenomics as a tool for the investigation of uncultured microorganisms | |
| Tang et al. | An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods | |
| CN107653243B (zh) | 一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组dna的方法 | |
| US11401561B2 (en) | Primer composition for analyzing intestinal flora and application thereof | |
| CN106947827A (zh) | 一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用 | |
| CN103898108A (zh) | 对河流弧菌o2，o4，o13，o15和o18特异的核苷酸及其应用 | |
| CN106048034A (zh) | 基于pcr‑rlfp‑dhplc技术扫描分析食品中动物源性成份组成 | |
| Guo et al. | Diversification of animal gut microbes and NRPS gene clusters in some carnivores, herbivores and omnivores | |
| CN102181518A (zh) | 用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法 | |
| Heavens et al. | How low can you go? Driving down the DNA input requirements for nanopore sequencing | |
| Chu et al. | Viral diversity and biogeochemical potential revealed in different prawn-culture sediments by virus-enriched metagenome analysis | |
| KR101869832B1 (ko) | 엔테로코커스 종들 중 특정 종 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 해당 균주 분리 및 동정 방법 및 그 조성물 | |
| Alindonosi et al. | Prospects for diatoms identification using metagenomics: a review. | |
| CN102851362B (zh) | 一种基于质谱技术快速鉴定布鲁氏菌的方法及其用途 | |
| CN110452974A (zh) | 一种检测细菌16S rDNA全长的建库测序方法 | |
| Qin et al. | Diversity and potential function of pig gut DNA viruses | |
| Kowalczyk et al. | Practical aspects of genetic identification of hallucinogenic and other poisonous mushrooms for clinical and forensic purposes | |
| CN106801103A (zh) | 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法 | |
| Maeda et al. | Population abundance of potentially pathogenic organisms in intestinal microbiome of jungle crow (Corvus macrorhynchos) shown with 16S rRNA gene-based microbial community analysis | |
| CN103667460A (zh) | 一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141015 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |