CN109811022A - 一种半乳甘露寡糖的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半乳甘露寡糖的制备方法及其应用。所述方法包括：(1)对瓜尔豆胶、田菁胶、刺槐豆胶、胡芦巴胶、塔拉胶等半乳甘露聚糖进行分段复合酶解，其特征是所述酶为酸性甘露聚糖酶和纤维素酶的复合酶；(2)利用分段超滤分级，获得降解后半乳甘露寡糖是二糖、三糖、四糖、五糖的混合物；制备过程简易，且环境友好。半乳甘露寡糖产物转化率高，易分离。制备的半乳甘露寡糖可作为益生元应用于食品及动物饲料中，促进产丁酸益生菌的增殖，改善肠道环境。
Description
技术领域
本发明涉及寡糖制备技术领域，更具体的说是涉及制备一种定向制备具体分子量半乳甘露寡糖。
背景技术
丁酸是肠黏膜上皮细胞的主要能量来源，可促进肠黏膜修复及功能损伤修复，并且能抑制炎症细胞因子产生,从而起抗炎作用。丁酸还具有抗肿瘤作用,可减少肠道肿瘤坏死因子生成,诱导肿瘤细胞分化和凋亡。动物肠道内的丁酸主要来自肠道菌群利用碳水化合物发酵产生。肠道丁酸含量的高低一方面取决于盲肠和结肠丁酸产生菌的种类和数量，一方面是能够在肠道后端发酵的碳水化合物数量及种类。肠道丁酸产生菌是丁酸产生的主要来源，近年来大量研究阐述了产丁酸菌作为益生菌对动物体的益生作用，如丁酸梭菌可改善仔猪肠道环境，预防腹泻；丁酸梭菌对高脂膳食诱导的肥胖有显著的保护作用，能够改善肥胖导致的结肠炎症状态。因此，开发能够被肠道产丁酸菌利用且促进产丁酸菌增殖的碳水化合物，可作为新的益生元应用于食品、动物饲料领域，有效促进丁酸菌及丁酸在人和动物体内的益生效果。
半乳甘露聚糖是在由β-(1,4)-D-甘露糖构成的主链上，半乳糖通过α-1,6-糖苷键连接形成侧链组成的杂多糖，由于植物品种不同，半乳糖与甘露糖比例也不同。如瓜尔豆胶、田菁胶半乳甘露聚糖中半乳糖与甘露糖的约为1：2，刺槐豆胶约为1：4。半乳甘露聚糖具有粘度高、水溶性好、稳定的特点，因此常作为增稠剂使用。另外，也作为膳食纤维补充剂添加在食品及饲料中。近年来，越来越多的研究聚焦在具有益生效果的低分子寡糖上。因寡糖分子量低，容易被菌群发酵利用，多作为益生元应用于食品及饲料领域。目前促进产丁酸益生菌增殖的半乳甘露寡糖报道很少，专利空缺，因此开发一种具有促进肠道丁酸产生菌增殖的寡糖产品具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供一种半乳甘露寡糖的制备方法及其应用。在本方法中，利用酶解作用机理不同，通过分段复配酶解制备半乳甘露寡糖，适用于多种半乳甘露聚糖酶解。其制备步骤简单，环境友好，设备简易，获得半乳甘露寡糖聚合度为2-5，纯度95％以上，得率50-75％。寡糖产品能够被肠道菌群快速发酵代谢，降低肠道环境pH值，促进丁酸产生菌的增殖及提高丁酸产量，促进双歧杆菌增殖，抑制有害菌如脱硫弧菌的增殖。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种半乳甘露寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)：将半乳甘露聚糖与酸性甘露聚糖酶混合，水解；
(2)：将步骤(1)中得到的酶解液沸水浴灭活，冷却至室温离心，上清通过超滤获得目标产物200-1000Da寡糖糖液及大于1000Da糖液；
(3)将步骤(2)中得到的大于1000Da糖液加入纤维素酶，水解结束后沸水水浴灭活，冷却至室温；
(4)将步骤(3)中得到的纤维素酶的酶解液超滤得到200-1000Da半乳甘露寡糖糖液，合并两次200-1000Da糖液，干燥后即半乳甘露寡糖糖粉。
所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，所述步骤(1)中使用原料为包括瓜尔豆胶、田菁胶、刺槐豆胶、胡芦巴胶、塔拉胶在内的半乳甘露聚糖，半乳甘露聚糖与酸性甘露聚糖酶的比例为：每克半乳甘露聚糖加入酸性甘露聚糖酶500-2500U，温度35-60℃，pH 2.5-6.0，反应时间1-12h，半乳甘露聚糖底物浓度2％-20％。
所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，所述步骤(2)中超滤使用卷式超滤膜，截留分子量为200-1000Da。
所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，所述步骤(3)中半乳甘露聚糖与纤维素酶的比例为：每克半乳甘露聚糖加入纤维素酶300-2500U，温度35-60℃，pH 2.5-7.5，反应时间1-12h。
所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，所述步骤(4)中获得半乳甘露寡糖聚合度为2-5，纯度95％以上，得率50-75％。
根据任一所述方法制备的半乳甘露寡糖的应用，促进产丁酸菌增殖，提高丁酸产量，促进双歧杆菌增殖，抑制有害菌。
取新鲜的母猪粪便进行体外模拟肠道菌群发酵，母猪健康且3个月内未受抗生素干预。粪便以0.5％-3％接种量接入以半乳甘露寡糖为底物的发酵培养基中，发酵初始pH7-8.5，且模拟完全厌氧肠道环境下发酵。半乳甘露寡糖基本在24h内被菌群完全代谢，培养基pH降低2-3，丁酸产量提高了15-30mmol/L。16S rRNA菌群多样性分析结果证明半乳甘露寡糖促进了产丁酸菌增殖，促进了双歧杆菌增殖，抑制了有害菌如脱硫弧菌增殖。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开了一种适用于大部分半乳甘露聚糖的分段酶解制备特定分子量寡糖的方法，其底物适用范围更广，寡糖得率高，操作简易，环境友好。制备的特定分子量的半乳甘露寡糖产物结构丰富，通过体外模拟肠道发酵实验证实其能够促进肠道产丁酸菌增殖，促进丁酸产生，促进双歧杆菌增殖，抑制有害菌如脱硫弧菌增殖。半乳甘露寡糖产品，可作为益生元用于食品及饲料中改善人与动物的肠道健康。
附图说明
图1为实施例4半乳甘露寡糖TLC图；
图2为实施例4半乳甘露寡糖GPC图；
图3为实施例4半乳甘露寡糖液质产物分布图；
图4为实施例4半乳甘露寡糖质谱分析图。A为五糖质谱分析结果，B为四糖质谱分析结果，C为三糖质谱分析结果，D为二糖质谱分析结果；
图5为实施例4半乳甘露寡糖被肠道菌群代谢利用TLC图；
图6为实施例4半乳甘露寡糖发酵代谢降低肠道环境pH；
图7为实施例4半乳甘露寡糖发酵促进丁酸产生；
图8为实施例4半乳甘露寡糖促进丁酸梭菌、双歧杆菌增殖，抑制有害菌脱硫弧菌增殖的益生效果。A为12h发酵液半乳甘露寡糖组与空白组肠道菌群的差异；B为24h发酵液半乳甘露寡糖组与空白组肠道菌群的差异；
图9为本发明工艺流程图；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
于250mL pH 5.0的蒸馏水中，按照与半乳甘露聚糖的比例2000U/g溶解酸性甘露聚糖酶，随后分别加入25g刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、胡芦巴胶、塔拉胶，置于45℃下水解8h。酶解反应结束后，反应液沸水浴灭活10min，得到酶解液。所得酶解液于4000rpm离心20min后，沉淀烘干称重，收集上清液。使用截留分子量分别为1000Da及200Da的中空纤维膜对上清液进行截留，得到分子量范围在1000-200Da的寡糖液，冻干即得寡糖干粉，称重。酶解沉淀得率及寡糖得率见表1。结果显示，酸性甘露聚糖酶单独酶解时，酶解效果较差，寡糖得率较低，仅有16.5％-23.4％。
表1为实施例1酸性甘露聚糖酶酶解半乳甘露聚糖的寡糖得率
实施例2
于250mL pH 5.0的蒸馏水中，按照与半乳甘露聚糖的比例2000U/g溶解纤维素酶，随后分别加入25g刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、胡芦巴胶、塔拉胶，置于45℃下水解8h。酶解反应结束后，反应液沸水浴灭活10min，得到酶解液。所得酶解液于4000rpm离心20min后，沉淀烘干称重，收集上清液。使用截留分子量分别为1000Da及200Da的中空纤维膜对上清液进行截留，得到分子量范围在1000-200Da的寡糖液，冻干即得寡糖干粉，称重。寡糖得率见表2。结果显示，纤维素酶单独酶解时，酶解不彻底，寡糖得率低于酸性甘露聚糖酶酶解结果，仅有11.1％-14.5％。
表2为实施例2纤维素酶酶解半乳甘露聚糖的寡糖得率
实施例3
于250mL pH 5.0的蒸馏水中，按照与半乳甘露聚糖比例1000U/g分别溶解酸性甘露聚糖酶及纤维素酶，随后分别加入25g刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、胡芦巴胶、塔拉胶，置于45℃下水解8h。反应结束后，反应液沸水浴灭活10min，得到酶解液。所得酶解液于4000rpm离心20min后，沉淀烘干称重，收集上清液。使用截留分子量分别为1000Da及200Da的中空纤维膜对上清液进行截留，得到分子量范围在1000-200Da的寡糖液，冻干即得寡糖干粉，称重。寡糖得率见表3。结果显示，酸性甘露聚糖酶与纤维素酶复配同时进行酶解，寡糖得率提高，但是寡糖得率提高幅度不大，仅升高至21.7％-27.6％。
表3为实施例3双酶同时酶解半乳甘露聚糖的寡糖得率
实施例4
(一)分段酶解制备半乳甘露寡糖
50mL为5.0的蒸馏水中，按照与半乳甘露聚糖比例1000U/g溶解酸性甘露聚糖酶，随后分别加入25g刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、胡芦巴胶、塔拉胶，置于45℃下水解4h。酶解结束后，水浴煮沸10min灭酶活，晾凉后，所得酶解液于4000rpm离心20min后，收集上清液。使用截留分子量分别为1000Da及200Da的中空纤维膜对上清液进行截留，得到分子量范围在1000-200Da的寡糖液及大于1000Da糖液。随即按照与原始底物半乳甘露聚糖的比例为1000U/g向大于1000Da糖液加入纤维素酶，继续置于45℃下水解4h。酶解反应结束后，反应液沸水浴灭活10min，晾凉后，再次使用截留分子量分别为1000Da及200Da的中空纤维膜对酶解液进行截留，得到分子量范围在1000-200Da的寡糖液，合并两次寡糖液，冻干即得寡糖干粉，称重。寡糖得率见表4。结果显示，利用分段酶解法，寡糖得率升高至53.1％-70.1％。说明纤维素酶可有效降解酸性甘露聚糖酶的酶解片段，同时分段收集寡糖可防止纤维素酶将寡糖继续降解成单糖，从而提高小分子寡糖得率。
表4为实施例4双酶分段酶解半乳甘露聚糖的寡糖得率
(二)不同半乳酸性甘露聚糖酶解得到的寡糖产物薄层图
通过薄层图观察不同半乳酸性甘露聚糖酶解制备的寡糖产物组成，结果表明本发明公开的方法，制备寡糖产物组成丰富，且适用于不同半乳甘露聚糖。
(三)半乳甘露寡糖分子量分布测定
本方法得到的半乳甘露寡糖冻干样品蒸馏水复溶至浓度5mg/mL，利用高效液相色谱测定其分子量分布，液相结果分子量分布图见图2，寡糖GPC分子量分布百分比见表5。可见产物中寡糖相对含量可在95％以上。具体操作条件如下:
液相仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；示差折光检测器
液相柱型号：TSK-oligo
液相条件：0.2mol/L NaNO3溶液、0.01mol/L NaH2PO4溶液为流动相；柱温30℃；流速0.5mL/min；进样量:5μL；示差温度35℃。
表5为实施例4半乳甘露寡糖GPC分子量分布
| 分子量范围(Da) | 保留时间(min) | 峰面积比值％ | |
| 1 | >1000 | <33.387 | 1.31％ |
| 2 | <1000 | >33.387 | 98.69％ |
(四)半乳甘露寡糖产物组成分析
半乳甘露寡糖冻干样品蒸馏水复溶至浓度5mg/mL，利用液质联用测定其产物组成，液相结果见图3，质谱结果见图4。结果表明，产物主要由2-5聚合度寡糖组成。具体操作条件如下:
液相仪器：Agilent Ultivo三重四极杆液质联用系统；示差折光检测器
液相柱型号：日本Shodex SB802
液相条件：0.2mol/L NaNO3溶液、0.01mol/L NaH2PO4溶液；柱温35℃；流速0.35mL/min；进样量:5μL；示差温度35℃
(五)半乳甘露寡糖益生效果
为了探究半乳甘露寡糖对肠道菌群的益生作用，实验过程模拟大肠厌氧发酵环境，利用来源于不同母猪的新鲜粪便进行体外模拟发酵，探究肠道菌群对寡糖的代谢情况及代谢产物改善肠道环境的益生作用。
YCFA发酵培养基使用N2进行除氧，并分装至厌氧小瓶。发酵初始pH 7.5-8。新鲜粪便用PBS稀释为悬液，以1.5％(v/v)接种量接入厌氧小瓶。37℃发酵36h，分别取0、4、8、12、24、36h发酵液进行后续分析。薄层结果表明，半乳甘露寡糖可被肠道菌群快速利用，24h全部代谢，结果见图5。半乳甘露寡糖被肠道菌发酵，可迅速降低肠道环境中pH，有助于抑制肠道有害菌增殖，结果见图6。使用Agilent 1260高效液相色谱仪，匹配紫外检测器，利用日本Shodex KC-811有机酸柱分析发酵液中短链脂肪酸产物组成，证实半乳甘露寡糖发酵能够促进丁酸产生，结果见图7。利用Hiseq高通量测序平台，对12h及24h的发酵液进行16S rRNA菌群多样性分析，对比半乳甘露寡糖干预有无，肠道菌群结构及丰度的变化。结果显示，半乳甘露寡糖促进肠道产丁酸菌增殖，促进双歧杆菌增殖，抑制有害菌如脱硫弧菌增殖，有助于改善肠道菌群结构，结果见图8.
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种半乳甘露寡糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)：将半乳甘露聚糖与酸性甘露聚糖酶混合，水解；
(2)：将步骤(1)中得到的酶解液沸水浴灭活，冷却至室温离心，上清通过超滤获得目标产物200-1000Da寡糖糖液及大于1000Da糖液；
(3)将步骤(2)中得到的大于1000Da糖液加入纤维素酶，水解结束后沸水水浴灭活，冷却至室温；
(4)将步骤(3)中得到的纤维素酶的酶解液超滤得到200-1000Da半乳甘露寡糖糖液，合并两次200-1000Da糖液，干燥后即半乳甘露寡糖糖粉。
2.根据权利要求1所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用原料为包括瓜尔豆胶、田菁胶、刺槐豆胶、胡芦巴胶、塔拉胶在内的半乳甘露聚糖，半乳甘露聚糖与酸性甘露聚糖酶的比例为：每克半乳甘露聚糖加入酸性甘露聚糖酶500-2500U，温度35-60℃，pH 2.5-6.0，反应时间1-12h，半乳甘露聚糖底物浓度2％-20％。
3.根据权利要求1所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中超滤使用卷式超滤膜，截留分子量为200-1000Da。
4.根据权利要求1所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中半乳甘露聚糖与纤维素酶的比例为：每克半乳甘露聚糖加入纤维素酶300～2500U，温度35-60℃，pH 2.5-7.5，反应时间1-12h。
5.根据权利要求1所述的一种半乳甘露寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中获得半乳甘露寡糖聚合度为2-5，纯度95％以上，得率50-75％。
6.根据权利要求1-5任一所述方法制备的半乳甘露寡糖的应用，促进产丁酸菌增殖，提高丁酸产量，促进双歧杆菌增殖，抑制有害菌。
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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