CN101845471A - 快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法，采用一种高速剪切分散机使壳聚糖快速分散溶解形成高浓度底物溶液，并利用添加部分可降解壳聚糖的水解酶将溶液黏度变稀，可使反应体系中壳聚糖底物的浓度提高到10％～20％。酶反应完成后，产物溶液用超滤方法除去壳聚糖水解酶蛋白及壳聚糖大分子，透过液经纳滤浓缩脱盐，再通过真空浓缩过程可使产物壳寡糖固形物含量达到20％～35％。最后，浓缩液经喷雾干燥得到淡黄色壳寡糖粉末。本方法有效解决了壳聚糖溶解时间长、产生的溶液浓度低，从而造成因低底物浓度反应而引起的高能耗问题，大大降低了后续处理如分离纯化、浓缩、干燥等过程中的能耗水平，减少了生产成本。

Description

快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法

技术领域

本发明涉及壳寡糖的工业化生产技术，具体涉及通过一种高速剪切分散机快速溶解壳聚糖并在高底物浓度条件下酶法生产壳寡糖的方法。

背景技术

壳寡糖(Chitooligosaccharides)是壳聚糖经过水解生成的聚合度为2～20的低聚糖，是一种由氨基葡萄糖或少量N-乙酰氨基葡萄糖组成的低聚物。壳寡糖不仅保持了壳聚糖大分子所具有的某些功能性质，而且还具有许多壳聚糖所不具备的独特的生理活性和功能性质，在食品、医药、化妆品和农业等领域有着极其广泛的应用，已成为国际上新兴的一种功能性低聚糖。尤其引人注目的是其在抑制肿瘤细胞的生长，激活巨噬细胞的吞噬功能，活化肠道内的双歧杆菌，提高机体免疫力等方面有很高的活性。同时壳寡糖还具备壳聚糖所不具备的良好的吸湿性、保湿性、溶解性与抗菌性，可以作为食品添加剂如防腐剂和果蔬保鲜剂等。

目前，国内外壳寡糖制备方法主要有化学降解法、物理降解法和酶催化水解法。化学法制备的产物分子量分布宽，聚合度5以上的壳寡糖收率低，存在结构被破坏的危险。物理法降解有限，只能得到低分子量的壳聚糖；酶法制备过程温和，分子量分布相对容易控制，产物安全性高，是一种比较理想的制备壳寡糖的方法。随着膜分离技术等在壳寡糖生产中的应用，酶法生产壳聚糖的工艺不断得到完善。近十年来，国内外有一些酶法报道文章或专利报道，但在方法中由于受壳聚糖溶解限制和本身的黏度，壳聚糖的酶法制备底物浓度一般为1％～5％；在一种以发酵超滤耦合为特征的制备壳寡糖的方法(CN1928106A)中，壳聚糖底物浓度2％～3％；在专利《用固定化酶技术制备壳低聚糖或壳寡糖的方法》(CN10104841A)中，底物壳聚糖溶液3％～5％；在一种将壳聚糖的降解与膜分离耦合的壳寡糖生产方法(CN1126756C)中，壳聚糖底物浓度0.5％～3％；在《一种水溶性壳低聚糖的制备方法》(CN1544479A)中，搅拌8h才使脱乙酰度71.2％的壳聚糖充分溶解得到的底物浓度为5％，溶解慢；在CN1470168、CN1687139、CN1772915、CN1401652A等的方法中，底物浓度都不超过5％；夏文水(CN1425696A)通过采取40℃～90℃的加温措施并加入2％～5％盐酸，使得壳聚糖分子被水解，从而降低黏度以增加浓度到5％～10％；黄代勇(CN101240305A)在一种酶法降解壳聚糖生产壳寡糖的方法中，提到按底物浓度15％～20％配制，但没有提出任何必要的增溶方法或手段，故达到上述浓度的可行性值得商榷。我们的实验也表明，以脱乙酰度85％、黏均分子量300,000左右的壳聚糖在2％醋酸溶液中，其溶解浓度不超过4％，如大于4％将形成难以搅拌的凝胶。总之，由于壳聚糖溶解过程缓慢，形成底物浓度低，导致在反应产物分离纯化和干燥过程中生产能耗大，生产成本高，很大程度上限制了酶法制备壳寡糖技术的工业化应用。因此，有必要研究一种可以在较高底物浓度下酶法生产壳寡糖的方法。

(1)壳聚糖是一种高分子聚合物，分子量从几十万到上百万，溶液的黏度很高，采取普通的溶解方法溶解速度很慢，因此要解决壳聚糖的快速分散和溶解问题。

(2)由于壳聚糖溶解慢而产生底物浓度低，由此在酶法制备壳寡糖时产生高能耗，增加生产成本，本发明着力解决如何提高酶反应过程中壳聚糖底物浓度的问题。

(3)较低的底物浓度不但使能耗水平上升也使产品的生产周期加长，从而降低生产效率，因此要解决提高生产效率的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以有效克服现有技术条件下壳聚糖溶解速度慢、底物浓度低、能耗大和生产成本高的瓶颈问题的快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法。

本发明的技术解决方案：

一种快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)制备高底物浓度壳聚糖溶液：

以壳聚糖粉末和水加入到高速剪切分散机中，转速1500rpm以上运行1～5min后，加入醋酸使其溶解，在温度40℃～50℃时按10～50U/g的比例加入壳聚糖水解酶，运转待溶液黏度＜1000cp和pH＞4.3时，转速3000rpm，添加壳聚糖，同时补加冰醋酸，再按上述壳聚糖水解酶的用量比例加入壳聚糖水解酶液，维持反应体系的黏度＜1000cp，pH＜4.5，直至得到的壳聚糖溶液中壳聚糖底物浓度达到10％～20％；

(2)酶解反应：

将步骤(1)制得的壳聚糖溶液按20～80U/g的比例加入壳聚糖水解酶，在搅拌下，控制pH 4.2～4.8和温度40℃～50℃反应5～24h，降解至目标分子量后终止反应，最终得到浓度为10％～20％的酶解产物液；

(3)反应产物分离：

用碱液调节反应液pH至7.0～8.0，静置30min～60min，形成絮凝物，离心3000～4000rpm或过滤去水不溶性壳聚糖及其他杂质；

(4)超滤分级：

采用截留分子量30,000～1,000Da的超滤膜进行分级处理，同时除去分子量大的壳聚糖和酶蛋白成分，得到超滤透过液；

(5)纳滤浓缩脱盐：

用截留分子量500Da的纳滤膜对超滤透过液进行浓缩和脱盐处理，浓缩比为1/3～1/4，采用稀释过滤的方式，脱盐次数为2～4次，脱盐率达70％～90％。

(6)真空浓缩：

在真空度大于0.085MPa的条件下进行浓缩，浓缩温度控制在70℃以下，以避免褐变产生，使得到的浓缩液中固形物含量达25％以上；

(7)喷雾干燥：

将步骤(6)得到的浓缩液在进风温度170～200℃、出风温度70～90℃下喷雾干燥，得到淡黄色壳寡糖粉末状产品。

步骤(1)中壳聚糖粉末和水的质量比为5∶100。

步骤(1)中第一次加入醋酸的量为水体积的2％，补加的醋酸量为需补加醋酸的溶液体积的2％。

步骤(4)中截留的大分子壳聚糖返回反应器继续酶解。

本发明的有益效果：通过高速剪切分散机和酶解的促溶作用，可以有效提高酶反应过程中的底物浓度。常规制备方法中底物浓度一般不超过5％，本方法将壳聚糖的浓度提高到了10％～20％，相比已有报道方法可以有效缩短壳聚糖的溶解时间。强酸降解增溶因要强酸高温的条件，会引起产物色泽加深，形成副产物复杂，而本方法条件温和、没有副反应发生，产物色泽好、质量高。本方法因底物浓度高，使酶法反应得到的产物壳寡糖浓度增大，经过后续处理可大大降低生产中的能耗水平，符合国际社会提倡的节能减排、低碳绿色的科技发展趋势，同时高底物浓度的酶法生产壳寡糖有助于缩短生产周期，提高生产效率，降低生产成本。采用本发明介绍的方法制备壳寡糖产品质量高，本发明使得壳聚糖酶法制备壳寡糖具有生产意义上的技术可行性和可操作性。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

以壳聚糖250g和水5L加入到高速剪切分散机中，转速1500rpm以上运行1min后加入100mL冰醋酸，运行5min后，加2500U壳聚糖水解酶，控制温度在43℃～48℃之间，待黏度下降至1000cp以下、pH＞4.3时，3000rpm运行，不断补加壳聚糖粉末，并补加冰醋酸进行溶解，同时再按上述壳聚糖水解酶的用量补加壳聚糖水解酶，补加的醋酸量为需补加醋酸的溶液体积的2％，直至最终壳聚糖溶液的浓度达10％，pH4.6。将溶液加入壳聚糖水解酶10000U，在温度42℃～48℃，搅拌反应24h。用5M NaOH调节体系的pH至7.0，静置60min，形成絮凝物，3000rpm离心去除水不溶性壳聚糖及其他杂质。将上清液通过截留分子量1,0000的超滤膜，去除大分子壳聚糖和酶蛋白等，透过液经截留分子量500Da的纳滤膜浓缩脱盐，浓缩比为1/3～1/4，采用稀释过滤的方式，脱盐次数为2～4次，脱盐率大于75％。将浓缩液在真空度大于0.085Mpa、温度55℃条件下减压浓缩，使产物固形物含量达到25％，浓缩液在进风温度180℃、出风温度80℃时喷雾干燥得到淡黄色壳寡糖粉末。

实施例2

以壳聚糖250g和水5L加入到高速剪切分散机中，转速1500rpm以上运行1min后加入100mL冰醋酸，运行5min后，加12,500U壳聚糖水解酶，控制温度在45℃～50℃之间，黏度下降至1000cp以下，3000rpm运行，不断补加壳聚糖粉末，补加冰醋酸运行溶解，补加壳聚糖水解酶，直至最终壳聚糖溶液的浓度达15％，pH 4.6。将溶液在温度45℃～50℃，加壳聚糖水解酶40,000U，搅拌反应5h。其余处理步骤同实施例1。

实施例3

按照实施例1的步骤，继续补加壳聚糖使其最终底物浓度达到20％，酶解反应中壳聚糖水解酶的用量为20,000U，pH4.5，温度43℃～48℃，反应时间为24h。最后得到浅黄色壳寡糖粉末。

实施例4

按照实施例3的步骤，制备20％的壳聚糖底物溶液，酶解反应中壳聚糖水解酶的用量为80,000U，pH 4.5，43℃～48℃，反应时间为5h。最后得到浅黄色壳寡糖粉末。

实施例5

按照实施例3的步骤，壳聚糖投放总量10kg，酶的用量按比例增加，制备得到壳寡糖粉末。

Claims (4)

1.一种快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)制备高底物浓度壳聚糖溶液：

以壳聚糖粉末和水加入到高速剪切分散机中，在转速1500rpm以上运行1～5min后，加入醋酸使其溶解，在温度40℃～50℃时按10～50U/g的比例加入壳聚糖水解酶，运转待溶液黏度＜1000cp和pH＞4.3时，转速3000rpm，添加壳聚糖，同时补加冰醋酸，再按上述壳聚糖水解酶的用量比例加入壳聚糖水解酶液，维持反应体系的黏度＜1000cp，pH＜4.5，直至得到的壳聚糖溶液中壳聚糖底物浓度达到10％～20％；

(2)酶解反应：

将步骤(1)制得的壳聚糖溶液按20～80U/g的比例加入壳聚糖水解酶，在搅拌下，控制pH 4.2～4.8和温度40℃～50℃反应5～24h，降解至目标分子量后终止反应，最终得到浓度为10％～20％的酶解产物液；

(3)反应产物分离：

用碱液调节反应液pH至7.0～8.0，静置30min～60min，形成絮凝物，离心3000～4000rpm或过滤去水不溶性壳聚糖及其他杂质；

(4)超滤分级：

采用截留分子量30,000～1,000Da的超滤膜进行分级处理，同时除去分子量大的壳聚糖和酶蛋白成分，得到超滤透过液；

(5)纳滤浓缩脱盐：

用截留分子量500Da的纳滤膜对超滤透过液进行浓缩和脱盐处理，浓缩比为1/3～1/4，采用稀释过滤的方式，脱盐次数为2～4次，脱盐率达70％～90％。

(6)真空浓缩：

在真空度大于0.085MPa的条件下进行浓缩，浓缩温度控制在70℃以下，以避免褐变产生，使得到的浓缩液中固形物含量达25％以上；

(7)喷雾干燥：

将步骤(6)得到的浓缩液在进风温度170～200℃、出风温度70～90℃下喷雾干燥，得到淡黄色壳寡糖粉末状产品。

2.根据权利要求1所述的快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)中壳聚糖粉末和水的质量比为5∶100。

3.根据权利要求1所述的快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶解制备壳寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)中第一次加入醋酸的量为水体积的2％，补加的醋酸量为需补加醋酸的溶液体积的2％。

4.根据权利要求1、2或3所述的快速溶解壳聚糖、以高底物浓度酶法制备壳寡糖的方法，其特征在于：步骤(4)中截留的大分子壳聚糖返回反应器继续酶解。