CN110317842A - 一种壳聚糖溶液的水解方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种壳聚糖溶液的水解方法及其应用。所述的水解方法采用分时段嵌合式控制壳聚糖溶解及酶解过程、控量程序加酶耦合超滤分离方法，高效获取目标低聚壳寡糖。该水解方法对于高浓度的壳聚糖溶液适用性很好，反应条件温和，反应过程易控制，显著提高了水解效率及目标壳寡糖得率，所制得的壳寡糖产品氧化程度低，品质较高，对生产功能性低聚壳寡糖具有重要意义，具有广阔的推广应用前景。

Description

一种壳聚糖溶液的水解方法及其应用
技术领域
本发明属于海洋资源综合利用及海洋多糖产物生产制备技术领域，特别涉及一种壳聚糖溶液的水解方法及其应用。
背景技术
壳聚糖是来源于海洋及陆地甲壳类动物的多糖物质，自然界含量丰富，具有多种有益生物活性，其降解产物——低聚壳寡糖(聚合度通常介于2～20之间，分子量一般不超过3kDa)不仅保留了壳聚糖原有的生物活性，而且其水溶性较好，具有许多新的生物活性，如吸湿保湿性、抑菌性、抗癌抗肿瘤性等，在调节植物生理免疫、动物营养及食物功能性等方面具有良好的应用前景。
壳聚糖可以通过化学法、物理法和酶水解法降解。化学法降解最早用于工业化，技术要求低，壳聚糖降解快，也易于实现工业化生产，但低聚壳寡糖的产率低而且分子量分布较宽、单糖含量高，脱盐工艺复杂，生产过程中产品化学结构可能遭到破坏，产品安全性受质疑。物理法主要有超声波法、微波法、辐射法等，该法操作较简单、可控性好、污染小，但是降解初期速率较快，后期则缓慢，耗时长，耗能高，目前未能实现工业化生产。酶法降解是用专一性酶或非专一性酶对壳聚糖进行降解进而得到分子量较低的壳寡糖。酶水解法则条件温和、分子量分布相对容易控制且不会导致还原端基的氧化和降解，对环境的污染较小，所使用的酶包括非专一性酶包括纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶等，价格低廉但酶解效率低，专一性酶——壳聚糖酶，价格高但效率高。
目前工业上酶解生产壳寡糖时，壳聚糖浓度可以提高到6％(w/v)，一定程度上能减少浓缩能耗和缩短生产周期，但是溶液粘度太高，导致壳聚糖溶解及酶解周期长，生产困难；目前国内外已有研究报道过有关壳寡糖的分离纯化和将水解过程与分离纯化过程相结合的研究，但针对工业上使用高浓度壳聚糖溶液生产壳寡糖的工艺，鲜有关于优化其分离纯化条件的报道及应用，而且工业上壳聚糖水解过程与分离纯化过程不相关联，大大影响了生产效率和产物得率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种壳聚糖溶液的水解方法。所述的方法为高浓度壳聚糖溶液专一酶高效水解技术，该技术采用分时段嵌合式控制壳聚糖溶解及酶解过程、控量程序加酶耦合超滤分离方法，高效获取目标低聚壳寡糖，可提高壳聚糖溶液浓度，并提高酶解效率及产物得率，效果显著。
本发明的另一目的在于提供所述的壳聚糖溶液的水解方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种壳聚糖溶液的水解方法，包括如下步骤：
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
将壳聚糖颗粒均匀悬浮在水中，得到壳聚糖悬浮溶液；
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解
在步骤(1)制得的壳聚糖悬浮溶液中滴加酸溶液，使壳聚糖在40～80min内溶解完全；期间，在壳聚糖溶解开始后10～20min时第一次加入壳聚糖酶；在壳聚糖溶解开始后30～40min时第二次加入壳聚糖酶，在壳聚糖溶解开始后55～70min时第三次加入壳聚糖酶，以控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp(厘泊)之内；
(3)程序控量加酶耦合超滤
调节步骤(2)所得的溶液pH至5～5.5，加入壳聚糖酶，第一次水解壳聚糖，得到壳聚糖水解液，将壳聚糖水解液超滤分离低聚壳聚糖，向未透过液中加入酸溶液和壳聚糖酶进行第二次水解，超滤分离，收集透过液；
(4)调节步骤(3)的透过液的pH至中性，脱盐，制备得到低聚壳寡糖。
所述的低聚壳寡糖指聚合度2～6的壳寡糖。
所述的壳聚糖溶液的浓度可高至10～12％，对壳聚糖溶液浓度的适用性远高于现有技术。
所述的壳聚糖溶液的水解方法还可以包括进一步的浓缩、干燥、包装，得到成品壳寡糖。
所述的浓缩的优选为真空浓缩；所述的真空浓缩的条件优选为50～75℃、0.085～0.09MPa；所述的浓缩优选达到固形物含量为35～45％，溶液粘度为350～450cp。
所述的干燥优选为微波真空干燥，其干燥程度优选为含水量2％以下。
所述的微波真空干燥的条件优选为：微波功率密度2～6W/g、真空度0.07～0.085MPa、物料厚度0.6～1cm。
所述的壳聚糖溶液的水解方法优选在酶解罐中进行。
步骤(1)中所述的壳聚糖优选为脱乙酰度为85％～90％的壳聚糖；所述的壳聚糖的粒度优选为60～100目。
步骤(1)中所述的水优选为去离子水、蒸馏水或超纯水。
步骤(1)中所述的壳聚糖和水优选按质量比(8～12)：(90～95)配比。
步骤(2)中所述的酸溶液优选为盐酸溶液；所述的盐酸溶液优选为浓度为15～20％(w/w)的盐酸溶液；所述盐酸溶液的加入量优选按盐酸溶液与所述的壳聚糖悬浮溶液按体积质量比(4～8)：(98～107)配比。
步骤(2)中所述的壳聚糖溶解嵌合酶解，如果壳聚糖在55min内溶解完全，则不需要在加入第三次壳聚糖酶。
步骤(2)中所述的第一次加入的壳聚糖酶的加入量优选按每千克壳聚糖配比2000～4000个活力单位(U)壳聚糖酶计算。
步骤(2)中所述的第二次加入的壳聚糖酶的加入量优选按每千克壳聚糖配比2000～6000个活力单位(U)壳聚糖酶计算。
步骤(2)中所述的第三次加入的壳聚糖酶的加入量优选按每千克壳聚糖配比0～2000个活力单位(U)壳聚糖酶计算。
步骤(3)中所述的调节步骤(2)所得的溶液pH优选通过氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液调节。
所述的氢氧化钠溶液优选为浓度为2～4％(w/w)氢氧化钠溶液；所述的碳酸钠溶液优选为浓度为8～12％(w/w)碳酸钠溶液。
步骤(3)的操作优选保温在45～55℃下进行。
步骤(3)中所述的第一次水解所加入的壳聚糖酶的加入量优选按每千克壳聚糖配比4000～8000个活力单位(U)壳聚糖酶计算。
步骤(3)中所述的第二次水解所加入的壳聚糖酶的加入量优选按每千克壳聚糖配比2000～4000个活力单位(U)壳聚糖酶计算；所述的壳聚糖为原壳聚糖量，以步骤(1)壳聚糖悬浮溶液为计算基准。
步骤(3)中所述的超滤的条件优选为35～50℃、0.3～0.5Mpa；滤膜优选为1.5kDa滤膜。
步骤(3)中所述的酸溶液优选为盐酸水溶液，进一步优选为pH5～5.5的盐酸水溶液；该步骤中加入酸溶液目的在于补充透过液的体积，使得未透过液的体积与超滤前基本相当。
步骤(4)中所述的调节步骤(3)的透过液的pH优选通过氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液调节。
所述的氢氧化钠溶液优选为浓度为2～4％(w/w)氢氧化钠溶液；所述的碳酸钠溶液优选为浓度为8～12％(w/w)碳酸钠溶液。
步骤(4)中所述的脱盐优选在35～50℃、0.6～0.8Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
所述的壳聚糖溶液的水解方法在生产低聚壳寡糖中的应用。
通过所述的壳聚糖溶液的水解方法制备得到的低聚壳寡糖。
本发明的原理：壳聚糖在酸溶液中，克服自身分子间氢键作用及破坏结晶结构而逐渐崩解，溶液粘度急剧增大，给设备搅拌及后续的酶解反应造成较大困难，影响生产效率。而壳聚糖酶为内切酶，将壳聚糖大分子水解为分子量较小的分子链段，可迅速使溶液粘度大大降低。结合壳聚糖在酸溶液中的溶解规律及壳聚糖酶的水解特性，本发明提出在壳聚糖溶解过程中嵌合壳聚糖酶水解，使壳聚糖边溶解边水解以降低溶液粘度，壳聚糖溶解过程分子结构紧缩团聚前已进行水解，方便生产及操作控制。另外，在酶解过程中，由于壳聚糖中间产物会与壳聚糖酶逐渐结合为复合物，抑制酶活性，酶解效率下降；目标壳寡糖，尤其是壳六糖、壳五糖等会被壳聚糖酶进一步降解为壳三糖等，降低功能性。针对此，本发明提出程序控量加酶耦合超滤技术，多次控量加入壳聚糖酶，维持高效的酶解效率，提高高功能性壳寡糖成分的得率。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效：
(1)壳聚糖由于其特殊的溶液性质，即使利用不同方法提高浓度，通过其水解生产壳寡糖的效率还是十分低下。采用本发明所涉及的技术，利用壳聚糖酶水解壳聚糖生产壳寡糖具有条件温和，反应过程易控制，因此研究此技术对生产功能性低聚壳寡糖具有重要意义。
(2)本发明方法的可将壳聚糖溶液浓度提高至10～12％，酶解效率提高约1～1.5倍，目标壳寡糖产品得率可提高约30～50％，产品氧化程度低，品质较高。
附图说明
图1是对比例1的加盐酸溶解过程中壳聚糖溶液的粘度变化结果分析图。
图2是对比例2中不同加酶方式对还原糖生成量的影响结果分析图；其中，“原始”对应步骤(4)的处理组①，“4h”对应步骤(4)的处理组②，“4h+8h”对应步骤(4)的处理组③。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.本发明的壳聚糖水解方法
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
取脱乙酰度为90％、粒度为60目的壳聚糖8kg，加入90kg蒸馏水，于酶解罐中缓慢搅拌，使壳聚糖颗粒均匀悬浮。
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解控制溶液粘度
向壳聚糖悬浮液中滴加浓度为15％(w/w)的盐酸溶液8L，控制盐酸滴加速度使壳聚糖在70min内溶解完全。期间，在壳聚糖溶解开始后15min时按照2000U/kg(1kg壳聚糖中加入2000个活力单位(U)壳聚糖酶)比例加入壳聚糖酶，之后在壳聚糖溶解开始后35min时按照4000U/kg比例加入壳聚糖酶，最后在壳聚糖溶解开始后55min时按照2000U/kg比例加入壳聚糖酶，以控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp(厘泊)之内。
(3)调整溶液pH
向溶解并控粘的壳聚糖溶液中滴加2％(w/w)氢氧化钠溶液，调整溶液为pH5.0。
(4)程序控量加酶耦合超滤技术
将调整pH后的壳聚糖溶液保温至45℃，按照8000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解5.5h。壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于35℃、0.5Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。未透过液再次泵送入酶解罐中，补充pH5.0盐酸水溶液30kg及按照2000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解5.5h，然后再一次进行超滤分离，合并两次的透过液，待用。
(5)透过液中和及脱盐处理
用2％(w/w)氢氧化钠溶液将透过液pH调整为中性，然后在35℃、0.8Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
(6)产物溶液真空浓缩处理
将脱盐后的壳寡糖溶液在75℃、0.085MPa下浓缩至固形物含量为45％，溶液粘度达到450cp左右。
(7)微波真空干燥处理
将产物浓缩液于微波功率密度2W/g、真空度0.085MPa、物料厚度0.6cm条件下微波真空干燥至含水量2％，真空包装后即为成品。
2.对照组
在浓度为6％的壳聚糖溶液中加入盐酸水溶液进行溶解60min，再加入与本实施例中“1.本发明的壳聚糖水解方法”同等量的壳聚糖酶水解12h，然后分离收集目标壳寡糖。
3.效果实验
(1)产品得率计算
按照公式目标壳寡糖得率＝(目标壳寡糖质量/壳聚糖质量)*100％，分别计算两种方法的产品得率。
(2)氧化程度测定
氧化程度以产物具有的抗氧化能力为评判标准，抗氧化能力的测定：配制1mg/mL的壳寡糖溶液，并采用邻二氮菲亚铁氧化法检测壳寡糖清除羟自由基·OH的能力(操作方法可参见文献：张敬晗,金黎明,张盼,等.壳聚糖及其衍生物清除羟自由基的能力[J].食品与药品,2008,10(7):23-24.)
(3)酶解效率
酶解效率为单位时间内目标壳寡糖的获得比率，也即(目标壳寡糖的质量/壳聚糖溶解开始到酶解结束时间)。目标壳寡糖的质量通过HPLC测定获得，测定方法为：取一定质量的酶解液，立即沸水浴灭酶15min，在室温、8000rpm下离心10min，以去除未水解的壳聚糖和酶蛋白，留上清液。同时配制10mg/mL的氨基葡萄糖盐酸盐和DP 2～6的壳寡糖标准品溶液。以70％乙腈为流动相，色谱仪流速控制为0.9mL/min，用示差折光检测器检测。
表1
方法 本发明 对照组
壳聚糖溶液浓度 8.1％ 6％
产品得率 52.1％ 40％
羟自由基清除率 85％ 75％
酶解效率 0.66kg/h 0.3kg/h
结果如表1所示，通过本发明的壳聚糖水解方法可将壳聚糖溶液浓度提高至8.1％(可根据步骤(1)的原料计算得到([8+90)/90]*100％＝8.1％)，酶解效率提高约1.2倍，目标壳寡糖产品得率可提高约30％，产品氧化程度低，品质较高。
实施例2
1.本发明的壳聚糖水解方法
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
取脱乙酰度为85％、粒度为100目的壳聚糖12kg，加入91kg蒸馏水，于酶解罐中缓慢搅拌，使壳聚糖颗粒均匀悬浮。
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解控制溶液粘度
向壳聚糖悬浮液中滴加浓度为20％(w/w)的盐酸溶液4L，控制盐酸滴加速度使壳聚糖在40min内溶解完全。期间，在壳聚糖溶解开始后10min时按照3000U/kg(1kg壳聚糖中加入3000个活力单位(U)壳聚糖酶)比例加入壳聚糖酶，之后在壳聚糖溶解开始后30min时按照6000U/kg比例加入壳聚糖酶，控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp(厘泊)之内。
(3)调整溶液pH
向溶解并控粘的壳聚糖溶液中滴加4％(w/w)氢氧化钠溶液或8～12％(w/w)碳酸钠溶液，调整溶液pH在5.2之间。
(4)程序控量加酶耦合超滤技术
将调整pH后的壳聚糖溶液保温至55℃，按照4000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解5h。壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于50℃、0.3Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。未透过液再次泵送入酶解罐中，补充pH5.2盐酸水溶液40kg及按照4000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解5h，然后再一次进行超滤分离，合并两次的透过液，待用。
(5)透过液中和及脱盐处理
用4％(w/w)氢氧化钠溶液或8～12％(w/w)碳酸钠溶液将透过液pH调整为中性，然后在50℃、0.6Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
(6)产物溶液真空浓缩处理
将脱盐后的壳寡糖溶液在50℃、0.09MPa下浓缩至固形物含量为35％，溶液粘度达到350cp左右。
(7)微波真空干燥处理
将产物浓缩液于微波功率密度6W/g、真空度0.07MPa、物料厚度1cm条件下微波真空干燥至含水量2％，真空包装后即为成品。
2.对照组
在浓度为6％的壳聚糖溶液中加入盐酸水溶液进行溶解60min，再加入与本实施例中“1.本发明的壳聚糖水解方法”同等量的壳聚糖酶水解12h，然后分离收集目标壳寡糖。
3.效果实验
产品得率及酶解效率的计算及氧化程度测定方法同实施例1。
表2
方法 本发明 对照组
壳聚糖溶液浓度 11.6％ 6％
产品得率 60％ 40％
羟自由基清除率 90％ 75％
酶解效率 0.75kg/h 0.3kg/h
结果如表2所示，通过本发明的壳聚糖水解方法，可将壳聚糖溶液浓度提高至11.6％，酶解效率提高约1.5倍，目标壳寡糖产品得率可提高约50％，产品氧化程度低，品质较高。
实施例3
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
取脱乙酰度为88％、粒度为80目的壳聚糖10kg，加入95kg蒸馏水，于酶解罐中缓慢搅拌，使壳聚糖颗粒均匀悬浮。
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解控制溶液粘度
向壳聚糖悬浮液中滴加浓度为18％(w/w)的盐酸溶液6L，控制盐酸滴加速度使壳聚糖在80min内溶解完全。期间，在壳聚糖溶解开始后20min时按照4000U/kg(1kg壳聚糖中加入4000个活力单位(U)壳聚糖酶)比例加入壳聚糖酶，之后在壳聚糖溶解开始后40min时按照3000U/kg比例加入壳聚糖酶，最后在壳聚糖溶解开始后70min时按照2000U/kg比例加入壳聚糖酶，以控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp(厘泊)之内。
(3)调整溶液pH
向溶解并控粘的壳聚糖溶液中滴加8％(w/w)碳酸钠溶液，调整溶液pH在5.5之间。
(4)程序控量加酶耦合超滤技术
将调整pH后的壳聚糖溶液保温至50℃，按照6000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解3h。壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于45℃、0.4Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。未透过液再次泵送入酶解罐中，补充pH5.5盐酸水溶液55kg及按照3000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解3h，然后再一次进行超滤分离，合并两次的透过液，待用。
(5)透过液中和及脱盐处理
用8％(w/w)碳酸钠溶液将透过液pH调整为中性，然后在45℃、0.7Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
(6)产物溶液真空浓缩处理
将脱盐后的壳寡糖溶液在60℃、0.085MPa下浓缩至固形物含量为40％，溶液粘度达到400cp左右。
(7)微波真空干燥处理
将产物浓缩液于微波功率密度4W/g、真空度0.08MPa、物料厚度0.8cm条件下微波真空干燥至含水量2％，真空包装后即为成品。
2.对照组
在浓度为6％的壳聚糖溶液中加入盐酸水溶液进行溶解60min，再加入与本实施例中“1.本发明的壳聚糖水解方法”同等量的壳聚糖酶水解12h，然后分离收集目标壳寡糖。
3.效果实验
产品得率及酶解效率的计算及氧化程度测定方法同实施例1。
表3
方法 本发明 对照组
壳聚糖溶液浓度 9.5％ 6％
产品得率 58％ 40％
羟自由基清除率 90％ 75％
酶解效率 0.69kg/h 0.3kg/h
结果如表3所示，通过本发明的壳聚糖水解方法，可将壳聚糖溶液浓度提高至9.5％，酶解效率提高约1.3倍，目标壳寡糖产品得率可提高约45％，产品氧化程度低，品质较高。
实施例4
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
取脱乙酰度为90％、粒度为60目的壳聚糖12kg，加入90kg蒸馏水，于酶解罐中缓慢搅拌，使壳聚糖颗粒均匀悬浮。
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解控制溶液粘度
向壳聚糖悬浮液中滴加浓度为20％(w/w)的盐酸溶液6L，控制盐酸滴加速度使壳聚糖在65min内溶解完全。期间，在壳聚糖溶解开始后10min时按照4000U/kg(1kg壳聚糖中加入4000个活力单位(U)壳聚糖酶)比例加入壳聚糖酶，之后在壳聚糖溶解开始后30min时按照2000U/kg比例加入壳聚糖酶，最后在壳聚糖溶解开始后55min时按照1000U/kg比例加入壳聚糖酶，以控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp(厘泊)之内。
(3)调整溶液pH
向溶解并控粘的壳聚糖溶液中滴加12％(w/w)碳酸钠溶液，调整溶液pH在5.5之间。
(4)程序控量加酶耦合超滤技术
将调整pH后的壳聚糖溶液保温至50℃，按照5000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解4h。壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于40℃、0.4Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。未透过液再次泵送入酶解罐中，补充pH5.5盐酸水溶液45kg及按照3000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解4h，然后再一次进行超滤分离，合并两次的透过液，待用。
(5)透过液中和及脱盐处理
用12％(w/w)碳酸钠溶液将透过液pH调整为中性，然后在40℃、0.8Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
(6)产物溶液真空浓缩处理
将脱盐后的壳寡糖溶液在55℃、0.09MPa下浓缩至固形物含量为42％，溶液粘度达到420cp左右。
(7)微波真空干燥处理
将产物浓缩液于微波功率密度3W/g、真空度0.075MPa、物料厚度0.7cm条件下微波真空干燥至含水量2％，真空包装后即为成品。
2.对照组
在浓度为6％的壳聚糖溶液中加入盐酸水溶液进行溶解60min，再加入与本实施例中“1.本发明的壳聚糖水解方法”同等量的壳聚糖酶水解12h，然后分离收集目标壳寡糖。
3.效果实验
产品得率及酶解效率的计算及氧化程度测定方法同实施例1。
表4
方法 本发明 对照组
壳聚糖溶液浓度 11.8％ 6％
产品得率 52％ 40％
羟自由基清除率 85％ 75％
酶解效率 0.6kg/h 0.3kg/h
结果如表4所示，通过本发明的壳聚糖水解方法，可将壳聚糖溶液浓度提高至11.8％，酶解效率提高约1倍，目标壳寡糖产品得率可提高约30％，产品氧化程度低，品质较高。
对比例1
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
取脱乙酰度为90％、粒度为80目的壳聚糖8kg，加入90kg蒸馏水，于酶解罐中缓慢搅拌，使壳聚糖颗粒均匀悬浮。
(2)壳聚糖溶解
向壳聚糖悬浮液中滴加浓度为18％(w/w)的盐酸溶液6L，控制盐酸滴加速度使壳聚糖在50min内溶解完全。
(3)调整溶液pH
向溶解并控粘的壳聚糖溶液中滴加4％(w/w)氢氧化钠溶液，调整溶液pH在5.3。
(4)壳聚糖糖酶解及分离
将调整pH后的壳聚糖溶液保温至45～55℃，按照8000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解12h。酶解结束后，壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于50℃、0.5Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。
(5)透过液中和及脱盐处理
用4％(w/w)氢氧化钠溶液将透过液pH调整为中性，然后在50℃、0.8Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
(6)产物溶液真空浓缩处理
将脱盐后的壳寡糖溶液在60℃、0.085MPa下浓缩至固形物含量为40％，溶液粘度达到400cp左右。
(7)干燥处理
将产物浓缩液于喷雾至含水量2％，真空包装后即为成品。
产品得率及酶解效率的计算及氧化程度测定方法同实施例1。
酶解效率按照单位时间内目标壳寡糖的获得比率(目标壳寡糖质量/(1h+12h))(分母为壳聚糖溶解及水解时间总和)。据上述方法得到的目标寡糖得率为45％，酶解效率为0.35kg/h，目标壳寡糖清除羟自由基·OH的率为80％。
对步骤(2)壳聚糖溶解的粘度进行测定，结果如图1所示，在壳聚糖加酸溶解过程中粘度先不断提高，而后在25～30min内急剧下降，通过芘探针荧光光谱测定壳聚糖分子内疏水性增加，表明形成了紧缩团聚机构，不利于后续的酶解过程，酶解效率很低。
对比例2
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
取脱乙酰度为90％、粒度为60目的壳聚糖12kg，加入90kg蒸馏水，于酶解罐中缓慢搅拌，使壳聚糖颗粒均匀悬浮。
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解控制溶液粘度
向壳聚糖悬浮液中滴加浓度为20％(w/w)的盐酸溶液6L，控制盐酸滴加速度使壳聚糖在65min内溶解完全。期间，在壳聚糖溶解开始后10min时按照4000U/kg(1kg壳聚糖中加入4000个活力单位(U)壳聚糖酶)比例加入壳聚糖酶，之后在壳聚糖溶解开始后30min时按照2000U/kg比例加入壳聚糖酶，最后在壳聚糖溶解开始后55min时按照1000U/kg比例加入壳聚糖酶，以控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp(厘泊)之内。
(3)调整溶液pH
向溶解并控粘的壳聚糖溶液中滴加12％(w/w)碳酸钠溶液，调整溶液pH在5.5之间。
(4)壳聚糖糖酶解及分离
对调整pH后的壳聚糖溶液分别进行三组处理：
①将调整pH后的壳聚糖溶液保温至45～55℃，按照12000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解12h。酶解结束后，壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于50℃、0.5Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。
②将调整pH后的壳聚糖溶液保温至45～55℃，按照6000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解4h。酶解结束后，按照6000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解8h，然后将壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于50℃、0.5Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。
③将调整pH后的壳聚糖溶液保温至45～55℃，按照6000U/kg比例加入壳聚糖酶，缓慢搅拌，使壳聚糖酶解4h。酶解结束后，按照3000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解4h，然后再按照3000U/kg(原壳聚糖量)比例补充壳聚糖酶，缓慢搅拌，继续水解4h。酶解结束后，将壳聚糖水解液泵送入超滤分离器中，于50℃、0.5Mpa下通过1.5kDa滤膜分离目标壳寡糖，收集透过液。
在相应时间点分别对3个处理组的还原糖生成量进行检测，还原糖的测定采用DNS法测定水解液中的还原糖含量(参见文献：陈小娥.曲霉产壳聚糖酶酶学性质及作用机理研究[D].江南大学,2004)
以上3个处理组分别进行下述步骤(5)～(7)的操作。
(5)透过液中和及脱盐处理
用12％(w/w)碳酸钠溶液将透过液pH调整为中性，然后在40℃、0.8Mpa下通过纳滤膜分离器进行脱盐处理，脱除溶液中的Na+、Cl-等离子。
(6)产物溶液真空浓缩处理
将脱盐后的壳寡糖溶液在55℃、0.09MPa下浓缩至固形物含量为42％，溶液粘度达到420cp左右。
(7)微波真空干燥处理
将产物浓缩液于微波功率密度3W/g、真空度0.075MPa、物料厚度0.7cm条件下微波真空干燥至含水量2％，真空包装后即为成品。
表5
步骤(4的)不同处理 ① ② ③
产品得率 50％ 62％ 70％
羟自由基清除率 85％ 90％ 92％
酶解效率 0.45kg/h 0.55kg/h 0.70kg/h
还原糖检测结果如图2所示。由本实施例可见，本发明的在步骤(4)中采用创新的分步加酶法，产品得率和酶解效率显著提高，产品氧化程度低，品质更好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)壳聚糖悬浮溶液制备
将壳聚糖颗粒均匀悬浮在水中，得到壳聚糖悬浮溶液；
(2)壳聚糖溶解嵌合酶解
在步骤(1)制得的壳聚糖悬浮溶液中滴加酸溶液，使壳聚糖在40～80min内溶解完全；期间，在壳聚糖溶解开始后10～20min时第一次加入壳聚糖酶；在壳聚糖溶解开始后30～40min时第二次加入壳聚糖酶，在壳聚糖溶解开始后55～70min时第三次加入壳聚糖酶，以控制壳聚糖-盐酸溶液粘度在5000cp之内；
(3)程序控量加酶耦合超滤
调节步骤(2)所得的溶液pH至5～5.5，加入壳聚糖酶，第一次水解壳聚糖，得到壳聚糖水解液，将壳聚糖水解液超滤分离低聚壳聚糖，向未透过液中加入酸溶液和壳聚糖酶进行第二次水解，超滤分离，收集透过液；
(4)调节步骤(3)的透过液的pH至中性，脱盐，制备得到低聚壳寡糖。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的第一次加入的壳聚糖酶的加入量按每千克壳聚糖配比2000～4000个活力单位壳聚糖酶计算；
步骤(2)中所述的第二次加入的壳聚糖酶的加入量按每千克壳聚糖配比2000～6000个活力单位壳聚糖酶计算；
步骤(2)中所述的第三次加入的壳聚糖酶的加入量按每千克壳聚糖配比0～2000个活力单位壳聚糖酶计算。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的第一次水解所加入的壳聚糖酶的加入量按每千克壳聚糖配比4000～8000个活力单位壳聚糖酶计算；
步骤(3)中所述的第二次水解所加入的壳聚糖酶的加入量按每千克壳聚糖配比2000～4000个活力单位壳聚糖酶计算。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
所述的壳聚糖溶液的水解方法还可以包括进一步的浓缩、干燥、包装，得到成品壳寡糖。
5.根据权利要求4所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
所述的浓缩的为真空浓缩；
所述的干燥为微波真空干燥。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的壳聚糖为脱乙酰度为85％～90％的壳聚糖；
步骤(1)中所述的壳聚糖的粒度为60～100目。
7.根据权利要求1所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的酸溶液为盐酸溶液；
所述盐酸溶液的加入量按盐酸溶液与所述的壳聚糖悬浮溶液按体积质量比(4～8)：(98～107)配比。
8.根据权利要求1所述的壳聚糖溶液的水解方法，其特征在于：
步骤(3)的操作在45～55℃下保温进行；
步骤(3)中所述的超滤的条件为35～50℃、0.3～0.5Mpa；
步骤(3)中所述的超滤的滤膜为1.5kDa滤膜。
9.权利要求1～8任一项所述的壳聚糖溶液的水解方法在生产低聚壳寡糖中的应用。
10.一种低聚壳寡糖，其特征在于：
通过权利要求1～8任一项所述的壳聚糖溶液的水解方法制备得到的。
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