CN104744568B - 对神经激肽‑1受体蛋白特异性识别的p物质多肽探针及其制备与应用 - Google Patents

对神经激肽‑1受体蛋白特异性识别的p物质多肽探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供对神经激肽‑1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针，所述P物质多肽探针为多肽二聚体或多肽聚合物,其单体由一段P物质氨基酸序列MLGFFQQPKPR、双功能螯合基团、荧光基团和三联吡啶基团通过赖氨酸连接而成。该多肽探针是一类新型的用于制备具有多种肿瘤诊断作用的多肽二聚体和多肽聚合物，该多肽二聚体和多肽聚合物通过双功能螯合基团将金属Gd3+标记到多肽分子上，在体内经标记的P物质多肽探针与NK‑1受体蛋白特异性结合浓聚到肿瘤部位，利用磁成像和光学成像技术检测神经激肽‑1受体蛋白，以提高检测灵敏性。

Description

对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针及其制 备与应用
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断的药物领域，具体涉及的是对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针及其制备与应用，该P物质多肽探针为新型多肽二聚体和多肽聚合物，通过特异性结合肿瘤中的神经激肽-1（NK-1）受体蛋白来检测肿瘤。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国城市人口恶性肿瘤死亡原因中，肺癌居首位，近几年来世界各国肺癌的发病率和死亡率都有明显增高的趋势，但其治疗效果在近10中没有明显提高，总的治愈率为10%左右。目前早期诊断缺乏特异性指标和方法，且部分影响诊断性分期的检查难以普及实施，肺癌患者早期无特异性症状，故就诊时多为中晚期。
靶向治疗，即在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点（该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段），来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，该治疗方法已逐渐成为今后研究的主要方向之一。肿瘤组织是一个特殊的微环境，其中包含很多在正常细胞中没有或含量很低的蛋白，如神经激肽-1受体蛋白。该蛋白在肺癌的多种细胞中表达，如内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞，并促进这些细胞的增长及转移。故该蛋白可作为检测肺癌的一个靶标，通过检测NK-1受体蛋白来诊断肺癌。
P物质属于速激肽家族，其氨基酸序列为MLGFFQQPKPR，参与多种生理过程，近年来的研究发现，P物质作为一种神经递质，可以通过自分泌或者旁分泌，与其受体NK-1结合。这表明，P物质是一个很多前景的用于肺癌诊断的靶向性分子，并有可能对其他恶性肿瘤也有潜在应用价值。事实上，NK-1受体蛋白不仅在肺癌中有表达，也存在于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、结肠癌中，故含有P物质的探针可特异性检测以上多种肿瘤。但到目前为止，没有报道利用P物质探针通过磁成像和荧光成像双功能成像来检测NK-1受体蛋白的文献，故本发明首次提出了利用P物质多肽探针检测肿瘤。其优点在于通过超分子的思想合成多肽二聚体和多肽聚合物，通过磁成像和荧光成像双功能成像两种手段提高检测神经激肽-1受体蛋白的灵敏性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针及其制备与应用，该多肽探针是一类新型的用于制备具有多种肿瘤诊断作用的多肽二聚体和多肽聚合物，该多肽二聚体和多肽聚合物通过双功能螯合基团将金属Gd3+标记到多肽分子上，在体内经标记的P物质多肽探针与NK-1受体蛋白特异性结合浓聚到肿瘤部位，利用磁成像和光学成像技术检测神经激肽-1受体蛋白，以提高检测灵敏性。
本发明的目的是通过如下技术方案实现：
本发明提供对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针，其特征在于：所述P物质多肽探针为多肽二聚体或多肽聚合物,其单体由一段P物质氨基酸序列MLGFFQQPKPR、双功能螯合基团、荧光基团和三联吡啶基团通过赖氨酸连接而成。
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述多肽二聚体的单体氨基酸序列为：MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)KK(Dye)DOTA。
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述多肽聚合物的单体氨基酸序列为：MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)K(tpy)KK(Dye)DOTA。
本发明所述的P物质多肽探针，P物质氨基酸序列后加一系列赖氨酸一是为了增强肽链的水溶性，二是为了尽量远离前面的P物质序列，避免加入大基团可能会改变P物质的结构和功能。本发明所述的P物质多肽探针，在17和19位之间加一个赖氨酸是为减小空间位阻，所述两个基团顺序可以互换。
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述多肽聚合物的聚合度为3-5。
本发明所述二聚体的肽链上有一个三联吡啶基团，只能形成二聚体；本发明所述的多肽聚合物单体中有两个三联吡啶基团，理论上可以由很多个单体通过共价键形成，但在本申请中，由于空间位阻等原因导致所述多肽聚合物的聚合度在3-5。
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述双功能螯合基团为DOTA，所述DOTA是三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。
所述双功能螯合基团能够螯合金属Gd3+、F19、Mn2+。
本发明所述双功能螯合基团优选螯合金属Gd3+，目前用于临床上的造影剂主要是Gd3+配合物造影剂。
所述双功能螯合基团，由于多肽没有直接与金属形成稳定结合的功能团，所以解决的方法是在多肽上修饰上一些能与金属离子牢固结合的基团。本发明双功能螯合基团是具有易与多肽氨基酸残基结合的基团，又具有能与金属离子稳定络合的官能团，通过它的作用，可以形成磁成像金属一双功能螯合剂一抗体(多肽)的复合物。本发明中使用DOTA作为双功能螯合剂，该螯合剂螯合金属后具有良好的稳定性。
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述三联吡啶基团选自4'-(4-羧甲氧基苯基)-2,2':6',2''-三联吡啶）、4'-(4-羧基苯基)-2,2':6',2''-三联吡啶、4'-羧基-2,2':6',2''-三联吡啶中的一种。
4'-(4-羧甲氧基苯基)-2,2':6',2''-三联吡啶结构式:
4'-(4-羧基苯基)-2,2':6',2''-三联吡啶结构式:
4'-羧基-2,2':6',2''-三联吡啶结构式:
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述荧光基团在610nm发出强烈的荧光，实现荧光检测。
本发明所述的P物质多肽探针，优选的是，所述荧光基团为半菁染料。
所述半菁染料具有摩尔消光系数大、易于合成和纯化、适当的荧光量子产率等优点，已经被广泛应用于许多领域。本发明所述半菁染料能与很多生物分子，并引起光谱的移动、强度的变化。半菁染料的结构由菁染料得到，菁染料结构如下图，菁染料的2个氮原子均为是杂环核的组成部分，若菁染料分子中仅1个氮原子是杂环核的组成部分则称为半菁。
具体地说，本发明所述荧光基团优选自2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1,3,3-三甲基苯并吲哚鎓碘简称BIDC1，2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1-丁基-3,3-二甲基苯并吲哚鎓碘(BIDC2)和2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1-辛基-3,3-二甲基苯并吲哚鎓碘(BIDC3)。
本发明选取荧光染料的目的是在特定波长激发下能发出荧光便于检测，只要能实现该功能的其他染料都可以。
本发明还提供一种制备对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针的方法，包括以下步骤：
a、P物质序列的制备
（1）使用微波多肽合成仪合成，将Rink酰胺树脂和Fmoc(芴甲氧羰基)甲硫氨酸置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶液中，微波条件下反应30min后，再脱除Fmoc保护基团，得到与甲硫氨酸偶联的树脂；
（2）依次重复步骤（1），其中原料氨基酸依次替换为Fmoc亮氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc苯并氨酸、Fmoc苯并氨酸、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酰胺、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酰胺、Fmoc脯氨酸、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc脯氨酸、侧连带有保护基的Fmoc精氨酸、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
（3）将步骤(2)得到与上述氨基酸依次偶联的树脂和侧连带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸，置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中，微波条件下反应30min后，得到进一步与带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸偶联的树脂；
b、P物质多肽二聚体的制备
（1）在步骤a所得与氨基酸依次偶联的树脂中加入Pd(Ph3P)4(四三苯基膦钯)和PhSiH3（苯硅烷），在DMF中反应10分钟，脱除赖氨酸侧链上的Allco（烯丙氧羰基）保护基；
（2）将步骤（1）所得产物和三联吡啶置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应后，再脱除Fmoc保护基团；
（3）然后在有机碱、耦合剂和DMF溶液的条件下，依次和侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有Allco保护基的Fmoc赖氨酸反应；
（4）重复步骤（1）、（2），其（2）中原料替换为半菁染料、DOTA，最终得到连接有三联吡啶、半菁染料、DOTA的与氨基酸依次偶联的树脂；
（5）切割步骤（4）所得与氨基酸依次偶联的树脂，得到P物质多肽二聚体单体；
（6）将P物质多肽二聚体单体溶于超纯水中，加入GdCl3，室温搅拌过夜后，过滤，滤液经透析，冻干得到Gd3+标记的P物质多肽二聚体单体；
（7）将Gd3+标记的P物质多肽二聚体单体溶于超纯水中，加入FeCl2，室温搅拌过夜后，透析，冻干得到Gd3+标记的P物质多肽二聚体；
c、P物质多肽聚合物的制备
（1）将步骤a所得与氨基酸依次偶联的树脂，脱除Fmoc保护基团，在有机碱、耦合剂和DMF溶液存在的条件下，与侧连带有保护基Allco的Fmoc赖氨酸反应，将Fmoc赖氨酸偶联到肽链上；
（2）在步骤（1）所得产品中加入Pd(Ph3P)4和PhSiH3，在DMF中反应10分钟，脱除两个Fmoc赖氨酸侧链上的Allco保护基；
（3）将步骤（2）所得产品和三联吡啶置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团；
（4）重复步骤（3），其中原料依次替换为侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有Allco保护基的Fmoc赖氨酸；
（5）重复步骤（2）、（3），其中步骤（3）中原料依次替换为半菁染料、DOTA，最终得到连接有三联吡啶、半菁染料、DOTA的与氨基酸依次偶联的树脂；
（6）切割步骤（5）所得与氨基酸依次偶联的树脂，得到P物质多肽聚合物单体；
（7）将P物质多肽聚合物单体溶于超纯水中，加入GdCl3，室温搅拌过夜后，过滤，滤液经透析，冻干得到Gd3+标记的P物质多肽二聚体单体；
（8）将Gd3+标记的P物质多肽聚合物单体溶于超纯水中，加入FeCl2，室温搅拌过夜后，透析，冻干得到Gd3+标记的P物质多肽聚合物。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，优选的是，所述侧连带有保护基的Fmoc谷氨酰胺、侧连带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有保护基的Fmoc精氨酸依次为侧连带有Trt保护基的Fmoc谷氨酰胺、侧连带有Boc（叔丁氧羰基）保护基的Fmoc赖氨酸、侧连带有Pbf保护基的Fmoc精氨酸。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，优选的是，所述有机碱为DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)，所述耦合剂为PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基)。
在本发明切割步骤中，同时去掉氨基酸侧连保护基。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述多肽二聚体的单体氨基酸序列为：MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)KK(Dye)DOTA。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述多肽聚合物的单体氨基酸序列为：MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)K(tpy)KK(Dye)DOTA。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述多肽聚合物为多肽三聚体、多肽四聚体或多肽五聚体。
本发明所述二聚体的肽链上有一个三联吡啶基团，只能形成二聚体；本发明所述的多肽聚合物单体中有两个三联吡啶基团，理论上可以由很多个单体通过共价键形成，但在本申请中，由于空间位阻等原因导致所述多肽聚合物的聚合度在3-5。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述双功能螯合基团为DOTA，所述DOTA是三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述三联吡啶基团选自4'-(4-羧甲氧基苯基)-2,2':6',2''-三联吡啶）、4'-(4-羧基苯基)-2,2':6',2''-三联吡啶、4'-羧基-2,2':6',2''-三联吡啶中的一种。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述荧光基团在610nm发出强烈的荧光，实现荧光检测。
本发明所述的P物质多肽探针的制备方法，所述荧光基团为半菁染料；所述荧光基团优选自2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1,3,3-三甲基苯并吲哚鎓碘简称BIDC1，2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1-丁基-3,3-二甲基苯并吲哚鎓碘(BIDC2)和2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1-辛基-3,3-二甲基苯并吲哚鎓碘(BIDC3)中的一种。
本发明还提供一种所述对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针在制备用于诊断肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、结肠癌的药物的应用。
本发明提供的新型P物质多肽二聚体或多肽聚合物，其单体分子内含有一段P物质序列、一个双功能鳌合剂和一个荧光基团，实现荧光、磁双功能成像，此外还含有三联吡啶可络合金属离子形成稳定的二聚体或聚合物。
本发明所述P物质多肽单体为线性多肽。
本发明所述二聚体和聚合物均为薄膜状结构。
所述P物质多肽探针为紫红色液体。
本发明所述磁成像络合金属为Gd3+，所述磁成像络合金属Gd3+是通过双功能螯合基团DOTA标记所述P物质多肽二聚体和多肽聚合物。所述NK-1受体蛋白作为分子靶标，多肽二聚体和聚合物通过特异性结合该蛋白来实现肿瘤检测。
本发明公开的P物质多肽二聚体的单体为MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)KK(Dye)DOTA(Met-Leu-Gly-Phe-Phe-Gln-Gln-Pro-Lys-Pro-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(tpy)-Lys-Lys(Dye)-DOTA)，结构为：
所述磁成像金属Gd3+通过一个双功能螯合基团标记所述多肽，所述二聚体通过三联吡啶络合金属离子聚合得到，所述荧光团在540nm激发下，在610发出强烈荧光，所述P物质多肽二聚体为紫红色液体；
P物质多肽聚合物的单体为MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)K(tpy)KK(Dye)DOTA(Met-Leu-Gly-Phe-Phe-Gln-Gln-Pro-Lys-Pro-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(tpy)-Lys(tpy)-Lys-Lys(Dye)-DOTA)，结构为：
其中M代表甲硫氨酸，L代表亮氨酸，G代表甘氨酸，F代表苯丙氨酸，Q代表谷氨酰胺，P代表脯氨酸，K代表赖氨酸，R代表精氨酸，tpy代表三联吡啶，Dye代表一种荧光团2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1,3,3-三甲基苯并吲哚鎓碘，DOTA代表三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸。在本发明中设计的P物质多肽二聚体和聚合物首先使用微波多肽合成仪固相合成P物质序列，然后在反应瓶通过固相Fmoc法合成多肽单体，接着在水溶液中进行Gd3+标记，最后再加入Fe2+得到多肽二聚体或多肽聚合物。
本发明的有益效果是：
本发明提供的对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针及其制备与应用。（1）该探针即P物质多肽二聚体和聚合物是和NK-1受体蛋白具有高亲和力的配体，且薄膜状结构更易于结合蛋白，提高检测的灵敏度。（2）该多肽二聚体和多肽聚合物通过双功能螯合基团将金属Gd3+标记到多肽分子上，在体内经标记的P物质多肽探针与NK-1受体蛋白特异性结合浓聚到肿瘤部位，利用磁成像和光学成像两种信号检测神经激肽-1受体蛋白，可用于实现肿瘤的筛查和早期诊断，可识别高危人群和早期病变人群，提高了检测灵敏性。
附图说明
图1为所述P物质多肽二聚体单体的质谱分析谱图。
图2为所述P物质多肽二聚体单体的HPLC（高效液相色谱）分析谱图。
图3为所述P物质多肽聚合物单体的质谱分析谱图。
图4为所述P物质多肽聚合物单体的HPLC（高效液相色谱）分析谱图。
图5为所述P物质多肽聚合物在HBE细胞（人正常支气管细胞）和A549细胞（人肺癌细胞）中的共聚焦成像。
图6为所述P物质多肽聚合物在肺癌病人血清和正常人血清中的磁信号。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本发明所用试剂和仪器：
HPLC GE,AKTA
Microwave Peptide Synthesizer CEM
MALDI-TOF AB SCIE,4800Plus
0.5T MR NM2011Analyst Shanghai Niumag Corporation
Confocal Laser Scanning Microscopy Olympus
实施例1：
所述P物质多肽二聚体的制备方法包括以下步骤：
a、P物质序列的制备
（1）使用微波多肽合成仪合成，将Rink酰胺树脂(312mg,0.25mmol)和Fmoc甲硫氨酸(290.6mg,0.75mmol)置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中，微波条件下反应30min后，脱除Fmoc保护基团，得到与甲硫氨酸偶联的树脂；
（2）依次重复步骤（1），其中原料氨基酸依次替换为Fmoc亮氨酸(265.06mg,0.75mmol)、Fmoc甘氨酸(223.0mg,0.75mmol)、Fmoc苯并氨酸(290.57mg,0.75mmol)、Fmoc苯并氨酸(290.57mg,0.75mmol)、侧连带有Trt保护基的Fmoc谷氨酰胺(458.03mg,0.75mmol)、侧连带有Trt保护基的Fmoc谷氨酰胺(458.03mg,0.75mmol)、Fmoc脯氨酸(253.03mg,0.75mmol)、侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、Fmoc脯氨酸(253.03mg,0.75mmol)、侧连带有Pbf保护基的Fmoc精氨酸(513.58mg,0.75mmol)、侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、侧连带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
（3）将步骤(2)得到与上述氨基酸依次偶联的树脂和侧连带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸(339.38mg,0.75mmol)，置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中，微波条件下反应30min后，得到进一步与带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸偶联的树脂；
b、P物质多肽二聚体的制备
（1）在步骤a所得与上述氨基酸依次偶联的树脂中加入Pd(Ph3P)4(57.78mg,0.05mmol)和PhSiH3(0.74mL,6mmol)，在DMF中反应10分钟，脱除侧连带有保护基Alloc的Fmoc赖氨酸侧链上的Allco。
（2）将脱除Fmoc赖氨酸侧链上Allco的树脂和三联吡啶(415.5mg,0.75mmol)置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团。
（3）重复步骤（2），其中原料依次替换为侧连带有保护基Boc的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、侧连带有保护基Allco的Fmoc赖氨酸(339.38mg,0.75mmol)。
（4）重复步骤（1）、（2），其中原料替换为半菁染料(415.5mg,0.75mmol)。
（5）重复步骤（2），其中原料替换为DOTA(429.29mg,0.75mmol)，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
（6）切割步骤（5）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到P物质多肽单体。产品经C18制备柱制备。
（7）络合Gd3+离子，称取多肽单体8mg，溶于5mL超纯水中，使用0.1M NaOH调节pH至6.0，加入浓度为20mM的GdCl3374μL（3eq），将pH调至5.0，室温搅拌过夜。将反应液调PH至7.0-8.0，搅拌3h，使过量GdCl3沉淀，过滤。滤液用0.001M EDTA透析12h，再用超纯水透析12h，冻干得预期Gd3+标记的P物质多肽单体。MALDI-TOF质谱分析结果：m/z=3689.0。
（8）称取络合金属Gd3+的多肽单体8mg，溶于5mL超纯水中，使用0.1M NaOH调节pH至5.0，加入浓度为20mM的FeCl2340μL（3eq），将pH调至5.0，室温搅拌过夜。用超纯水透析24h，中间换一次水，冻干得预期Gd3+标记的P物质多肽聚合物约66mg（产率约7.2%），纯度大于95%。
进一步的，所述HPLC方法1为使用GE AKTA purifier100系统配备C18制备柱（3cm×25cm,10μm），紫外220nm和550nm双波长检测，梯度淋洗50分钟，流速17mL/min，其中流动相A为超纯水（0.05%TFA），B为甲醇（0.05%TFA）；起始浓度为30%A和70%B，线性梯度淋洗至100%B。
HPLC方法2为GE AKTA purifier100系统配备C18分析柱（1cm×15cm,10μm），紫外220nm和550nm双波长检测，梯度淋洗40分钟，流速1mL/min，其中流动相A为超纯水（0.05%TFA），B为甲醇（0.05%TFA）；起始浓度为10%A和90%B，线性梯度淋洗至100%B。
实施例2：
本实施例是实施例1的基础上进行的改进，本实施例中与实施例1相同的部分，请参照实施例1公开的内容进行理解，实施例1公开的内容也应当作为本实施例的内容，此处不做重复描述。
所述P物质多肽二聚体的制备方法包括以下步骤：
P物质多肽聚合物的制备
（1）采用固相Fmoc技术，将实施例1中步骤a所得与上述氨基酸依次偶联的树脂和侧连带有保护基Allco的Fmoc赖氨酸(339.38mg,0.75mmol)置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应将其偶联到肽链上。
（2）在步骤（1）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂中加入Pd(Ph3P)4(105.6mg,0.1mmol)和PhSiH3(1.48mL,12mmol)，在DMF中反应10分钟，脱除两个侧连带有保护基Alloc的Fmoc赖氨酸侧链上的Allco。
（3）将脱除Fmoc赖氨酸侧链上Allco的树脂和三联吡啶(831mg,1.5mmol)置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团。
（4）重复步骤（3），其中原料依次替换为侧连带有保护基Boc的Fmoc赖氨酸(351.41mg,0.75mmol)、侧连带有保护基Allco的Fmoc赖氨酸(339.38mg,0.75mmol)。
（5）重复步骤（2）、（3），其中原料替换为半菁染料(415.5mg,0.75mmol)。
（6）重复步骤（3），其中原料替换为DOTA(429.29mg,0.75mmol)，最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
（7）切割步骤（6）所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到P物质多肽单体。产品经C18制备柱制备。
（8）络合Gd3+离子，称取多肽单体8mg，溶于5mL超纯水中，使用0.1M NaOH调节pH至6.0，加入浓度为20mM的GdCl3328μL（3eq），将pH调至5.0，室温搅拌过夜。将反应液调PH至7.0-8.0，搅拌3h，使过量GdCl3沉淀，过滤。滤液用0.001M EDTA透析12h，再用超纯水透析12h，冻干得预期Gd3+标记的P物质多肽单体。MALDI-TOF质谱分析结果：m/z=4182.0。
（9）称取络合金属Gd3+的多肽单体8mg，溶于5mL超纯水中，使用0.1M NaOH调节pH至5.0，加入浓度为20mM的FeCl2298μL（3eq），将pH调至5.0，室温搅拌过夜。用超纯水透析24h，中间换一次水，冻干得预期Gd3+标记的P物质多肽聚合物约80mg（产率约8%），纯度大于95%。
进一步的，所述HPLC方法1为使用GE AKTA purifier100系统配备C18制备柱（3cm×25cm,10μm），紫外220nm和550nm双波长检测，梯度淋洗50分钟，流速17mL/min，其中流动相A为超纯水（0.05%TFA），B为甲醇（0.05%TFA）；起始浓度为40%A和60%B，线性梯度淋洗至100%B。
HPLC方法2为GE AKTA purifier100系统配备C18分析柱（1cm×15cm,10μm），紫外220nm和550nm双波长检测，梯度淋洗50分钟，流速1mL/min，其中流动相A为超纯水（0.05%TFA），B为甲醇（0.05%TFA）；起始浓度为20%A和80%B，线性梯度淋洗18min至60%B，再线性梯度淋洗30min至80%B。
效果实施例1.多肽聚合物在A549细胞与HBE细胞中的荧光强度的比较
在细胞层面上检测多肽聚合物在肺癌细胞和正常细胞中荧光强弱。分别在A549细胞和HBE细胞中加入1mL浓度为20μM的多肽聚合物，孵育30min，吸去孵育液，用磷酸缓冲液洗3次。然后将细胞置于激光共聚焦扫描显微镜下成像。实验发现，由于HBE细胞壁中NK-1蛋白含量很少，多肽聚合物不易进入HBE细胞，而A549细胞壁中含有NK-1蛋白，故多肽聚合物通过与NK-1蛋白结合，更容易进入A549细胞。参见图5，A549细胞中的荧光强度明显高于HBE细胞的荧光强度。所以可通过荧光成像的方法检测NK-1受体蛋白从而实现肿瘤的检测。
效果实施例2.多肽聚合物在肺癌病人血清中的磁信号与正常人血清中的磁信号的比较
建立临床检测肺癌模型。通过比较肺癌病人和正常人的血清加入多肽聚合物后的磁信号不同进行诊断。分别选取15例肺癌病人和15例正常人血清，加入多肽聚合物检测其T1值，每个样本重复三次。实验发现，由于非小细胞肺癌病人的血清中含有NK-1蛋白，故与多肽结合时其磁信号会增强，表现为T1值变小，参见图6，15例肺癌病人的血清的T1值均低于正常人血清的T1值。以810ms为界限，病人血清的T1值均低于810ms，少数可低至700ms,而正常人血清中因不含NK-1受体蛋白，其T1值均高于810ms。说明P物质多肽聚合物具有较高的检测神经激肽-1受体蛋白的灵敏性，具有用于多种肿瘤诊断的潜力，且该方法灵敏，操作简单。
本发明提供的对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针及其制备与应用。（1）该探针即P物质多肽二聚体和聚合物是和NK-1受体蛋白具有高亲和力的配体，且薄膜状结构更易于结合蛋白，提高检测的灵敏度。（2）该多肽二聚体和多肽聚合物通过双功能螯合基团将金属Gd3+标记到多肽分子上，在体内经标记的P物质多肽探针与NK-1受体蛋白特异性结合浓聚到肿瘤部位，利用磁成像和光学成像两种信号检测神经激肽-1受体蛋白，可用于实现肿瘤的筛查和早期诊断，可识别高危人群和早期病变人群，提高了检测灵敏性。

Claims (7)

1.对神经激肽-1受体蛋白特异性识别的P物质多肽探针，其特征在于：所述P物质多肽探针为多肽二聚体或多肽聚合物,其单体由一段P物质氨基酸序列MLGFFQQPKPR、双功能螯合基团、荧光基团和三联吡啶基团通过赖氨酸连接而成；
所述多肽二聚体的单体氨基酸序列为：MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)KK(Dye)DOTA；所述多肽聚合物的单体氨基酸序列为：MLGFFQQPKPRKKKKKK(tpy)K(tpy)KK(Dye)DOTA；
所述双功能螯合基团为三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸；所述双功能螯合基团能够螯合金属Gd3+、F19或Mn2+；
所述三联吡啶基团选自4'-(4-羧甲氧基苯基)-2,2':6',2”-三联吡啶、4'-(4-羧基苯基)-2,2':6',2”-三联吡啶、4'-羧基-2,2':6',2”-三联吡啶；
所述荧光基团为半菁染料。
2.根据权利要求1所述的P物质多肽探针，其特征在于：所述多肽聚合物的聚合度为3-5。
3.根据权利要求1所述的P物质多肽探针，其特征在于：所述荧光基团选自2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1,3,3-三甲基-1H-苯并吲哚鎓碘，2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1-丁基-3,3-二甲基-1H-苯并吲哚鎓碘和2-[4-(N,N-二羧乙基)氨基]苯乙烯基-1-辛基-3,3-二甲基-1H-苯并吲哚鎓碘。
4.一种制备权利要求1-3所述的P物质多肽探针的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a、P物质序列的制备
(1)将Rink酰胺树脂和Fmoc甲硫氨酸置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中，微波条件下反应30min后，再脱除Fmoc保护基团，得到与甲硫氨酸偶联的树脂；
(2)依次重复步骤(1)，其中原料氨基酸依次替换为Fmoc亮氨酸、Fmoc甘氨酸、Fmoc苯丙氨酸、Fmoc苯丙氨酸、侧链带有保护基的Fmoc谷氨酰胺、侧链带有保护基的Fmoc谷氨酰胺、Fmoc脯氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、Fmoc脯氨酸、侧链带有保护基的Fmoc精氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、最终得到与上述氨基酸依次偶联的树脂；
(3)将步骤(2)得到与上述氨基酸依次偶联的树脂和侧链带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸，置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中，微波条件下反应30min后，得到进一步与带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸偶联的树脂；
b、P物质多肽二聚体的制备
(1)在步骤a所得与氨基酸依次偶联的树脂中加入Pd(Ph3P)4和PhSiH3，在DMF中反应10分钟，脱除赖氨酸侧链上的Alloc保护基；
(2)将步骤(1)所得产物和三联吡啶置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应后，再脱除Fmoc保护基团；
(3)然后在有机碱、耦合剂和DMF溶液的条件下，依次和侧链带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸反应；
(4)重复步骤(1)、(2)，其(2)中原料替换为半菁染料、DOTA，最终得到连接有三联吡啶、半菁染料、DOTA的与氨基酸依次偶联的树脂；
(5)切割步骤(4)所得与氨基酸依次偶联的树脂，得到P物质多肽二聚体单体；
(6)将P物质多肽二聚体单体溶于超纯水中，加入GdCl3，反应处理后，得到Gd3+标记的P物质多肽二聚体单体；
(7)将Gd3+标记的P物质多肽二聚体单体溶于超纯水中，加入FeCl2，反应，后处 理得到Gd3+标记的P物质多肽二聚体；
c、P物质多肽聚合物的制备
(1)将步骤a所得与氨基酸依次偶联的树脂，脱除Fmoc保护基团，在有机碱、耦合剂和DMF溶液存在的条件下，与侧链带有保护基Alloc的Fmoc赖氨酸反应，将Fmoc赖氨酸偶联到肽链上；
(2)在步骤(1)所得产品中加入Pd(Ph3P)4和PhSiH3，在DMF中反应10分钟，脱除两个Fmoc赖氨酸侧链上的Alloc保护基；
(3)将步骤(2)所得产品和三联吡啶置于反应瓶中，加入有机碱和耦合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团；
(4)重复步骤(3)，其中原料依次替换为侧链带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有Alloc保护基的Fmoc赖氨酸；
(5)重复步骤(2)、(3)，其中步骤(3)中原料依次替换为半菁染料、DOTA，最终得到连接有三联吡啶、半菁染料、DOTA的与氨基酸依次偶联的树脂；
(6)切割步骤(5)所得与氨基酸依次偶联的树脂，得到P物质多肽聚合物单体；
(7)将P物质多肽聚合物单体溶于超纯水中，加入GdCl3，反应，后处理得到Gd3+标记的P物质多肽聚合物单体；
(8)将Gd3+标记的P物质多肽聚合物单体溶于超纯水中，加入FeCl2，反应，后处理得到Gd3 +标记的P物质多肽聚合物。
5.根据权利要求4所述的P物质多肽探针的制备方法，其特征在于：所述侧链带有保护基的Fmoc谷氨酰胺、侧链带有保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有保护基的Fmoc精氨酸依次为侧链带有Trt保护基的Fmoc谷氨酰胺、侧链带有Boc保护基的Fmoc赖氨酸、侧链带有Pbf保护基的Fmoc精氨酸。
6.根据权利要求4所述的P物质多肽探针的制备方法，其特征在于：所述有机碱为N，N-二异丙基乙胺，所述耦合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基。
7.一种权利要求1-3所述P物质多肽探针在制备用于诊断肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、结肠癌的药物上的应用。
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