CN104726598B - 用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用 - Google Patents
用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用。本发明提供了如下1)‑4)中任一所述物质在鉴定或辅助鉴定待测枣为北京地方枣品种中的应用，1)引物对，所述引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；2)成套引物，所述成套引物由所述引物对和荧光引物，所述荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列3；3)含有所述引物对或所述成套引物的PCR试剂；4)含有所述引物对或所述成套引物的试剂盒。本发明的实验证明，上述引物及方法简单，重复性好，灵敏度高，能够准确鉴别北京11个地方品种枣。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用。
背景技术
枣(Ziziphus jujuba Mill.)，鼠李科(Rhamnaceae)，枣属(Ziziphus Mill.)。枣树原产我国，是果树栽培历史最久的果树之一，为古代五果之一，也是我国当今第一大干果。枣果实不仅营养丰富、味道甘美，同时又为补中益气、养血安神、缓和药性的常用中药，是集营养与医疗保健于一体的优质滋补品。
目前发现和记载的枣品种和优良类型达800多种，北京原产及引种栽培的一些枣品种或类型命名和种植比较混乱，所以亟需种质和品种鉴定的方法。
随着PCR技术的日益完善，许多基于PCR的分子标记大量涌现，其中，用于种质资源鉴定及植物育种的主要分子标记有限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单重复序列DNA(SSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)以及染色体原位杂交等。
发明内容
本发明的目的是提供用于鉴定11个北京地方枣品种的引物及其应用。
本发明提供了如下1)-4)中任一所述物质在鉴定或辅助鉴定待测枣为北京地方枣品种中的应用：
1)引物对，所述引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；
2)成套引物，所述成套引物由所述引物对和荧光引物，所述荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列3；
3)含有所述引物对或所述成套引物的PCR试剂；
4)含有所述引物对或所述成套引物的试剂盒。
上述物质在区分或辅助区分北京地方枣品种中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述荧光引物5’末端标记荧光基团；
所述北京地方枣品种为11个北京地方枣，所述11个北京地方枣具体为北安河脆枣、红螺脆枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽枣和老虎眼枣。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测枣品种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)用上述引物对对待测枣的基因组DNA进行PCR扩增，得到待测枣PCR扩增产物；
2)用上述荧光引物对所述待测枣PCR扩增产物进行荧光标记扩增，得到待测枣带荧光扩增产物；
3)将所述待测枣带荧光扩增产物进行毛细管电泳检测，
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.41bp和304.3bp，则所述待测枣为或候选为北安河脆枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为303.28bp和307.49bp，则所述待测枣为或候选为红螺脆枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.25bp和302.14bp，则所述待测枣为或候选为长辛店白枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.33bp，则所述待测枣为或候选为瓶儿枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302.15bp和304.31bp，则所述待测枣为或候选为鸡心脆枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为349.34bp，则所述待测枣为或候选为缨络枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.32bp，则所述待测枣为或候选为郎家园枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为301.8bp和303.85bp，则所述待测枣为或候选为西峰山大家枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302.29bp和304.36bp，则所述待测枣为或候选为京枣39；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为304.34bp，则所述待测枣为或候选为莲蓬籽枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.58bp，则所述待测枣为或候选为老虎眼枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小不满足上述任一种大小，则所述待测枣不为或候选不为11个北京地方枣品种中任一个，所述11个北京地方枣为北安河脆枣、红螺脆枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽枣和老虎眼枣。
本发明的实验证明，用于鉴定11个北京地方枣品种的引物，包括由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成的引物对，用上述引物对枣进行PCR扩增，通过PCR扩增片段的大小就可鉴别是否为下列11个北京地方枣品种：1：北安河脆枣；2：红螺脆枣；3：长辛店白枣；4：瓶儿枣；5：鸡心脆枣；6：缨络枣；7：郎家园枣；8：西峰山大家枣；9：京枣39；10：莲蓬籽枣；11：老虎眼枣。上述引物及方法简单，重复性好，灵敏度高，能够准确鉴别北京11个地方品种枣。
附图说明
图1为CTAB法提取的11个枣品种的DNA电泳图。
图2为三引物扩增的11个枣品种的PCR片段。
图3为双引物扩增的11个枣品种的PCR片段。
图4为荧光引物扩增的11个枣品种的PCR片段。
图5为毛细管电泳检测的枣品种1(北安河脆枣)的SSR峰图。
图6为毛细管电泳检测的枣品种2(红螺脆枣)的SSR峰图。
图7为毛细管电泳检测的枣品种3(长辛店白枣)SSR峰图。
图8为毛细管电泳检测的枣品种4(瓶儿枣)的SSR峰图。
图9为毛细管电泳检测的枣品种5(鸡心脆枣)的SSR峰图。
图10为毛细管电泳检测的枣品种6(缨络枣)的SSR峰图。
图11为毛细管电泳检测的枣品种7(郎家园枣)的SSR峰图。
图12为毛细管电泳检测的枣品种8(西峰山大家枣)的SSR峰图。
图13为毛细管电泳检测的枣品种9(京枣39)的SSR峰图。
图14为毛细管电泳检测的枣品种10(莲蓬籽枣)的SSR峰图。
图15为毛细管电泳检测的枣品种11(老虎眼枣)的SSR峰图。
图16为EcoRⅠ-1和MseⅠ-1的ALFP扩增结果。
图17为EcoRⅠ-2和MseⅠ-2的ALFP扩增结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、合成引物
设计并合成如下引物：
BFU0377F：5＇-CACGACGTTGTAAAACGACCCAGCTGGTATCCAATTGCT-3＇(序列1)；
BFU0377R：5＇-ACGACGATGCCATGAAAGAT-3＇(序列2)；
M13-0377通用引物：5＇6FAMTM-CACGACGTTGTAAAACGAC-3＇(序列3)，且其5＇末端荧光标记FAMTM。
实施例2、鉴定11个北京地方枣品种
11个北京地方枣品种名称如表1所示：
表1枣的品种名称和扩增片段大小
表1中的各品种枣记载在如下文献中：1990年10月公开出版的《北京果树志》(第十三章枣志)；2004年11月公开出版的《北京名果》(第六章枣)；2009年12月公开出版的《中国枣种质资源》(第七章我国主要枣种质资源)。
一、提取基因组DNA
采用CTAB法提取枣果实的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取植物材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5ml Eppendorf管中；
(2)加入预热的CTAB(700μl)提取缓冲液，混匀，65℃水浴40min，每5min轻轻震荡几次；
(3)加入等体积(700μl)的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀5min，4℃，12000r/min，离心10min；
(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；
(5)重复步骤(4)1-2次，以蛋白层不出现为止；
(6)吸上清，加入等体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；
(7)弃去上清液，用(500μl)75％乙醇洗涤沉淀2次，离心10000rpm(short)，空离心，用枪头吸干净；
(8)室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于50-100μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
结果如图1所示，其中，1到11分别为11个枣品种，1：北安河脆枣；2：红螺脆枣；3：长辛店白枣；4：瓶儿枣；5：鸡心脆枣；6：缨络枣；7：郎家园枣；8：西峰山大家枣；9：京枣39；10：莲蓬籽枣；11：老虎眼枣；可以看出，提取出11个枣品种的基因组DNA。
二、PCR扩增
分别以上述11个枣品种的基因组DNA为模板，用引物BFU0377F，BFU0377R和M13-0377进行PCR扩增。
上述采用PCR扩增体系如下：20μL PCR扩增体系：2μL模板、2μL Buffer(含Mg2+)、1.6μL dNTP、0.5μL BFU0377F(20mM)、0.5μL BFU0377R(20mM)、0.5μL M13-0377(20mM)(带荧光引物)、0.2μL Tag酶、12.7μL ddH2O。
PCR扩增程序如下：
94℃5min；
(94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 45s)×1；
(94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s)×1；
(94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s)×1；
(94℃ 45s，54℃ 45s，72℃ 45s)×1；
(94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 45s)×1；
(94℃ 45s，52℃ 45s，72℃ 45s)×30cycles；
72℃ 10min；
4℃保存。
2.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果如图2所示，其中只有瓶儿枣扩增出条带，其他品种都没有扩增出条带。
因此先用正向引物和反向引物进行PCR扩增(a)，再以扩增产物作为模板，用M13-0377荧光引物进行PCR扩增(b)。
具体如下：
(a)PCR扩增体系如下：20μL PCR扩增体系：2μL模板、2μL Buffer(含Mg2+)、1.6μLdNTP、0.5μL BFU0377F(20mM)、0.5μL BFU0377R(20mM)、0.2μL Tag酶、13.2μL ddH2O。
PCR扩增程序同上。
2.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
结果如图3所示，其中标号M为Marker DL 2000。标号1到11分别为11个枣品种，1：北安河脆枣；2：红螺脆枣；3：长辛店白枣；4：瓶儿枣；5：鸡心脆枣；6：缨络枣；7：郎家园枣；8：西峰山大家枣；9：京枣39；10：莲蓬籽枣；11：老虎眼枣；可以看出11个枣品种都跑出扩增出条带了。
(b)分别用(a)中的11个枣品种的扩增产物作为模板，用M13-0377(带荧光引物)进行荧光标记扩增，得到11个品种的带荧光扩增产物。
上述荧光标记扩增体系如下：20μL荧光PCR扩增体系：15μL模板(上述PCR产物)、0.5μL M13-0377(20mM)(带荧光引物)、2μL 10×Buffer(含Mg2+)、0.2μL Tag酶、2.3μLddH2O。
上述荧光标记扩增程序如下：
94℃ 5min；
(94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s)×16cycles；
72℃ 10min；
4℃保存。
2.5％琼脂糖凝胶电泳检测荧光标记扩增产物。
电泳荧光标记扩增产物，结果如图4所示，1：北安河脆枣；2：红螺脆枣；3：长辛店白枣；4：瓶儿枣；5：鸡心脆枣；6：缨络枣；7：郎家园枣；8：西峰山大家枣；9：京枣39；10：莲蓬籽枣；11：老虎眼枣；可以看出，枣的11个品种均跑出条带。将PCR产物进行毛细管电泳检测，仪器是ABI3730xl，检测步骤如下：1)琼脂糖电泳检测样品浓度，确定上样量；2)样品与LIZ500内标混好后上样至ABI3730xl测序仪；3)从仪器上导出的结果用Genemapper V4.0软件进行分析。
结果如图5-图14所示：
图5为毛细管电泳检测的枣品种1(北安河脆枣)的SSR峰图；
图6为毛细管电泳检测的枣品种2(红螺脆枣)的SSR峰图；
图7为毛细管电泳检测的枣品种3(长辛店白枣)SSR峰图；
图8为毛细管电泳检测的枣品种4(瓶儿枣)的SSR峰图；
图9为毛细管电泳检测的枣品种5(鸡心脆枣)的SSR峰图；
图10为毛细管电泳检测的枣品种6(缨络枣)的SSR峰图；
图11为毛细管电泳检测的枣品种7(郎家园枣)的SSR峰图；
图12为毛细管电泳检测的枣品种8(西峰山大家枣)的SSR峰图；
图13为毛细管电泳检测的枣品种9(京枣39)的SSR峰图；
图14为毛细管电泳检测的枣品种10(莲蓬籽枣)的SSR峰图；
图15为毛细管电泳检测的枣品种11(老虎眼枣)的SSR峰图；
可以看出，这11个枣品种均出现峰值，有的是在两个位置出现峰值，有的只在一个位置出现峰值。出现的位置是在298.25bp-349.34bp这个范围之间，其中最小的是品种5长辛店白枣，298.25bp，但它还有另外一个位置是302.14bp；最大的是品种10缨络枣，349.34bp。其中11个枣品种扩增片段大小如上表1所示。
从上述实验可以看出，本发明的成套引物可以鉴定11个北京地方枣。
对照：
用如下表2和表3的EcoRⅠ-1和MseⅠ-1、EcoRⅠ-2和MseⅠ-2分别对11个枣品种进行ALFP扩增。
EcoRⅠ-1和MseⅠ-1结果如图16所示，EcoRⅠ-2和MseⅠ-2结果如图17所示，1为北安河脆枣；2为金芒果；3为红螺脆枣；4为雪枣；5为长辛店白枣；6为大白玲；7为蜂蜜；8为瓶儿枣；9为鸡心脆枣；10为缨络枣；11为郎家园枣；12为西峰山大家枣；13为京枣39；14为莲蓬籽枣；15为老虎眼枣；可以看出，无法区分出不同品种。
表2为ALFP扩增引物序列
| 代号 | 引物序列 |
| EcoRⅠ-1 | 5'-GACTGCGTACCAATTCACT-3' |
| MseⅠ-1 | 5'-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3 |
| EcoRⅠ-2 | 5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3' |
| MseⅠ-2 | 5'-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3 |
表3为ALFP扩增接头序列
| EcoRⅠadopter5' | 5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3' |
| EcoRⅠadopter3' | 5'-AATTGGTACGCAGTCTAC-3' |
| MseⅠadopter5' | 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3' |
| MseⅠadopter3' | 5'-TACTCAGGACTCAT-3' |
| EcoRⅠ-0预扩增引物 | 5'-GACTGCGTACCAATTC-3' |
| MseⅠ-0预扩增引物 | 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' |
Claims (4)
1.如下1)-3)中任一所述物质在鉴定或辅助鉴定待测枣为北京地方枣品种中的应用：
1)成套引物，所述成套引物由引物对和荧光引物组成，
所述引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；
所述荧光引物的核苷酸序列为序列表中序列3；
2)含有所述成套引物的PCR试剂；
3)含有所述成套引物的试剂盒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述荧光引物5’末端标记荧光基团。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述北京地方枣品种为11个北京地方枣，所述11个北京地方枣具体为北安河脆枣、红螺脆枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽枣和老虎眼枣。
4.一种鉴定或辅助鉴定待测枣品种的方法，包括如下步骤：
1)用序列1所示的引物1和序列2所示的引物2对待测枣的基因组DNA进行PCR扩增，得到待测枣PCR扩增产物；
2)用核苷酸序列如序列3所示的荧光引物对所述待测枣PCR扩增产物进行荧光标记扩增，得到待测枣带荧光扩增产物；
3)将所述待测枣带荧光扩增产物进行毛细管电泳检测，
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.41bp和304.3bp，则所述待测枣为或候选为北安河脆枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为303.28bp和307.49bp，则所述待测枣为或候选为红螺脆枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.25bp和302.14bp，则所述待测枣为或候选为长辛店白枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.33bp，则所述待测枣为或候选为瓶儿枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302.15bp和304.31bp，则所述待测枣为或候选为鸡心脆枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为349.34bp，则所述待测枣为或候选为缨络枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.32bp，则所述待测枣为或候选为郎家园枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为301.8bp和303.85bp，则所述待测枣为或候选为西峰山大家枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为302.29bp和304.36bp，则所述待测枣为或候选为京枣39；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为304.34bp，则所述待测枣为或候选为莲蓬籽枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小为298.58bp，则所述待测枣为或候选为老虎眼枣；
若所述待测枣带荧光扩增产物的大小不满足上述任一种大小，则所述待测枣不为或候选不为11个北京地方枣品种中任一个，
所述11个北京地方枣为北安河脆枣、红螺脆枣、长辛店白枣、瓶儿枣、鸡心脆枣、缨络枣、郎家园枣、西峰山大家枣、京枣39、莲蓬籽枣和老虎眼枣。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |