CN104726442A - 一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，属于生物化学领域。所述方法包括：在45-70℃下，优选50-65℃下，将游离耐热过氧化氢酶与载体在缓冲液中混合，获得的固定化耐热过氧化氢酶。本发明方法能够获得具有较高稳定性的固定化过氧化氢酶，本发明提供的制备方法具有操作简单、工艺稳定、耗时短、生产成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，特别是涉及在高温条件下制备固定化耐热过氧化氢酶的方法。
背景技术
过氧化氢酶(CAT)又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它是一类抗氧化剂，以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气这两种无害物质。正是由于这一高效环保的功效，过氧化氢酶被广泛应用于食品，医药，环保和水处理等领域(Zhang D.X.,et al.,Chinese journal of biotechnology,2012,26:1473-1481；Wang L.,et a l.,Electroana lysis,2004,16:627-632.)。固定化酶技术是产生于20世纪六十年代，目前已广泛应用于生物催化领域的工业生产中。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高、回收方便、易于控制、可重复使用、成本低廉等优点，因此工业应用中生产生物催化剂酶的固定化已经成为人们研究的热点(Sheldon R.A.,et al,Chemicalsociety reviews,2013,42:6223-6235)。
而在固定化酶的工业应用中，为了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶具有较好的活性和稳定性，可以重复、多批次的使用(Liese A.,et al,Chemical society reviews,2013,42,6236-6249)。因此，在过氧化氢酶工业化应用的开发中，可以通过酶分子的基因工程改造、新型固定化酶载体的制备、固定化工艺的改进等，制备得到酶活高、稳定性好的固定化过氧化氢酶。
发明内容
本发明提供了一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，该方法在基本不影响耐热过氧化氢酶活性的前提下，进一步提高了固定化酶的催化稳定性并缩短了固定化时间，因此该方法降低了固定化成本并更有利于固定化酶的工业生产。
发明人发现在高温条件下进行耐热过氧化氢酶的固定化，可以大大缩短固定化时间和降低所需的缓冲液浓度，且获得的固定化耐热过氧化氢酶的热稳定性显著增加。另外，发明人还发现在高温固定化之前预先对耐热过氧化氢酶进行高温纯化，可以获得更好的效果。
用于本发明的方法在载体可以是酶固定化领域常用载体，例如氨基载体和环氧基载体，但是优选环氧基载体。
一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于在45-70℃下，优选50-65℃下，将游离耐热过氧化氢酶与载体在缓冲液中混合，获得的固定化耐热过氧化氢酶，混合的时间为0.5-10小时，优选1.5小时。
所述混合在缓冲液中进行。所述缓冲液为磷酸缓冲液或硼酸缓冲液。所述缓冲液的使用浓度为0.1-1.2mol/L，优选0.8mol/L。
所述混合在搅拌下进行，所述搅拌的速度为50-300rpm，优选150rpm。
在所述混合之前通过将游离耐热过氧化氢酶放置在50-70℃下，优选65℃下，对其进行纯化。所述纯化的时间为0.5-10h，优选1.5小时。
所述载体包括氨基载体和环氧基载体，优选环氧基载体。
本发明具有以下优点：
(1)在高温条件下对耐热过氧化氢酶进行纯化，操作简单易行，纯化效果较好。
(2)高温制备的固定化过氧化氢酶较常温制备的固定化过氧化氢酶热稳定性增强。
(3)固定化所需的时间大大缩短，且固定化时需加入的缓冲液浓度大大降低。
(4)所用的试剂都是常见的试剂，用量较小，成本低，无污染。
(5)本方法具有工艺简单、操作方便、操作稳定性好等特点，非常适于工业化生产。
具体实施方式
如果没有特别说明，在本申请中所述的过氧化氢酶就是指耐热过氧化氢酶。
作为本发明的方法中使用的耐热过氧化氢酶，其可以通过本领域技术人员已知的方法获得。举例来说，所述过氧化氢酶可以通过微生物如重组大肠杆菌培养获得；例如，由重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-CATHis经过摇瓶培养，超声波细胞破碎，离心，制备而得(Luo H,et a l.,Advances in Materials Research,2012,365:367-374)。
作为本发明的方法中使用的载体，为酶固定化工艺中常用的富含环氧基的载体，也称为环氧基载体，以及富含氨基的载体，即氨基载体。本发明所采用的环氧基载体和氨基载体(例如LX1000-EPC和LX1000-HA)得自西安蓝晓科技有限公司。
作为在本发明的方法中使用的缓冲体系可以为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液等。
以下通过具体实施例，对高温制备固定化过氧化氢酶的方法进行详细的阐述。
实施例中的分析方法：
(1)游离过氧化氢酶的酶活测定：
过氧化氢酶活力的定义：在25℃、pH7.0、底物浓度一定的条件下，每分钟分解1μmol过氧化氢所需的酶量为1个活力单位。
1)用0.1mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液配制6,12,18,24,30mM的过氧化氢溶液。
2)取1mL上述方法配制的过氧化氢底物溶液和2mL磷酸缓冲液(pH7.0)加入1cm比色皿中混匀
3)以去离子水为空白对照，在240nm波长处测量其吸光度值(采用上海尤尼柯仪器有限公司生产的UV-3802准双光束紫外可见分光光度计进行测定)。以过氧化氢浓度为横坐标，OD240为纵坐标绘制标准曲线。
4)用0.1mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液配制30mM的过氧化氢溶液。
5)取1mL，30mM过氧化氢底物溶液和1.9mL磷酸缓冲液(pH7.0)加入1cm比色皿中，最后加入0.1mL酶液混匀
6)以去离子水为空白对照，在240nm波长处测量其吸光度值，每隔半分钟记一次数，连续5min内计数。
7)通过标准曲线和以下公式，计算出游离过氧化氢酶的活性：
其中，ΔOD——取5min内体系内在240nm下，吸光度值的变化线性部分
V——体系体积/mL
ε240——240nm下过氧化氢的摩尔消光系数(0.0408)
T——催化体系线性反应时间/min
v——酶液体积/mL
(2)固定化过氧化氢酶的酶活测定：
1)称取约0.1g的固定化酶于25℃预热5min。
2)加入25℃预热的0.1mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液配制70mM的过氧化氢溶液5mL。
3)25℃、160rpm反应1min。
4)取1mL上清液加入硫酸进行终止反应。
5)将上述混合液12000rpm离心3min后取1mL上清液到1cm比色皿中，再加入2mL的0.1mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液测定其在240nm处的吸光度值(采用上海尤尼柯仪器有限公司生产的UV-3802准双光束紫外可见分光光度计进行测定)。
6)通过标准曲线计算过氧化氢反应前后的浓度，固定化过氧化氢酶的活性计算公式如下：
其中：V—过氧化氢溶液体积/mL
t—反应时间/min
m—固定化酶的质量/g
C0—过氧化氢初始浓度/mM
Ce—过氧化氢剩余浓度/mM
(3)固定化酶的热稳定性确定
在本发明中，固定化酶的热稳定性考察是在0.1M的pH7.0的磷酸钾溶液中，于55℃水浴中进行热处理不同时间后的残余酶活比。残余酶活比＝固定化酶热处理后酶活/固定化酶原始酶活。
实施例1：用环氧基载体在55℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)1g环氧基载体LX-1000EPC加入一定体积的0.1M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液，搅拌清洗载体一段时间后过滤抽干。
(2)配制1.2M，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
(3)将酶活为400U/mL，比酶活为309U/mg的游离过氧化氢酶在65℃下处理2h，然后通过离心去除沉淀物。测得处理后的游离酶酶活635U/mL,比酶活为1267U/mg。
(4)取步骤(3)处理后的游离酶10mL,取步骤(1)清洗后的载体1g加入到该体系中，并加入20mL步骤(2)中配制的磷酸钾缓冲液，在55℃下以160rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，55℃下制备的固定化过氧化氢酶固定1.5h后酶活就达到了最优结果1800U/g。将55℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活为92％。
对比例1：用环氧基载体在25℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例1，首先将载体进行清洗并对游离酶进行高温纯化的处理。
(2)同实施例1将酶液、磷酸缓冲液和载体混合均匀，在25℃下以160rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，在25℃下制备的固定化过氧化氢酶固定13h后酶活达到了最优结果1900U/g。并对在25℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活比例分别为78％。实施例1和对比例1的比较结果发现，相比常规的25℃下进行酶的固定化，在55℃下进行固定化获得最高固定化酶酶活所需的时间更短，而且固定化酶的热稳定性更好。
实施例2：用环氧基载体在55℃，低缓冲液浓度条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例1，首先将载体进行清洗并对游离酶进行高温纯化。
(2)配制0.6M，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
(3)同实施例1将载体、酶液以及缓冲液均匀混合，在55℃下以200rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，55℃下制备的固定化过氧化氢酶固定1h后酶活就达到了最优结果1827U/g。将55℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活为89％。
对比例2：用环氧基载体在25℃，低缓冲液浓度条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例1，首先将载体进行清洗并对游离酶进行高温纯化的处理，并配制磷酸钾缓冲液。
(2)同实施例1，将载体、酶液以及缓冲液均匀混合，在25℃下以200rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，25℃下制备的固定化过氧化氢酶固定10h后酶活达到了最优结果1625U/g。将25℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活为73％。
实施例2和对比例2的比较结果发现，在较低缓冲液浓度条件下固定化过氧化氢酶，55℃进行固定化比25℃时获得的固定化酶的酶活收率更高，固定化酶的热稳定性更好。
实施例3：用氨基载体在55℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)1g环氧基载体LX-1000HA加入一定体积的0.1M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液，搅拌清洗载体一段时间后过滤抽干，并同实施例1对酶液进行高温纯化。
(2)取步骤(1)处理后的游离酶和清洗后的载体混合均匀，在55℃下以160rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，在55℃下制备的固定化过氧化氢酶固定4h后酶活达到了最优结果为2107U/g。将55℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活为82％。
对比例3：用氨基载体在25℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例3，首先将载体进行清洗并对游离酶进行高温纯化的处理。
(2)同实施例3将酶液、磷酸盐缓冲液和载体混合均匀，在25℃下以160rpm的转速搅拌24h，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，在25℃下制备的固定化过氧化氢酶固定13h后酶活达到了最优结果2018U/g。并对在25℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活比例分别为65％。
实施例3和对比例3的比较结果发现，相比常规的25℃下进行酶的固定化，在55℃下进行固定化获得最高固定化酶酶活所需的时间更短，而且固定化酶的热稳定性更好。
实施例4：游离酶60℃高温纯化后用氨基载体在55℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例3，首先将载体进行清洗。
(2)将酶活为400U/mL，比酶活为309U/mg的游离过氧化氢酶在60℃下处理3h，然后通过离心去除沉淀物。测得处理后的游离酶酶活655U/mL,比酶活为1236U/mg。
(3)取步骤(2)处理后的游离酶与步骤(1)清洗后的载体混合均匀，在55℃下以160rpm的转速搅拌8h，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，在55℃下制备的固定化过氧化氢酶固定4h后酶活达到最优结果为1978U/g。将55℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活为77％。
对比例4：游离酶60℃高温纯化后用氨基载体在25℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例3，首先将载体进行清洗并对游离酶进行高温纯化的处理。
(2)同实施例3将酶液、磷酸盐缓冲液和载体混合均匀，在25℃下以160rpm的转速搅拌24h，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，在25℃下制备的固定化过氧化氢酶固定13h后酶活达到了最优结果1890U/g。并对在25℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活比例分别为59％。
实施例5：用环氧基载体在55℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)1g环氧基载体LX-1000EPC加入一定体积的0.1M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液，搅拌清洗载体一段时间后过滤抽干。
(2)配制1.2M，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
(3)取酶活为336U/mL的过氧化氢酶粗酶液10mL,取步骤(1)清洗后的载体1g加入到该体系中，并加入20mL步骤(2)中配制的磷酸钾缓冲液，在55℃下以160rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，55℃下制备的固定化过氧化氢酶固定2.5h后酶活就达到了最优结果1598U/g。将55℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活为85％。
对比例5：用环氧基载体在25℃条件下固定化过氧化氢酶
(1)同实施例5，首先将载体进行清洗。
(2)同实施例5将酶液、磷酸缓冲液和载体混合均匀，在25℃下以160rpm的转速搅拌，并定时取样分析。将上述固定后得到的固定化酶用0.1M、pH值7.0的磷酸钾缓冲液洗涤，抽干回收。
将处理后的固定化酶进行酶活测定，在25℃下制备的固定化过氧化氢酶固定22h后酶活达到了最优结果1708U/g。并对在25℃下制备的固定化酶对其55℃热处理60h后，测得其残余酶活比例分别为76％。
实施例5和实施例1分别采用粗酶液和高温纯化的酶液进行固定化，发现实施例1中采用高温纯化的酶液可以在相对更短的时间里达到最高固定化酶活。实施例5对比例5的比较结果发现，同样采用未纯化的粗酶液进行固定化，在55℃下进行固定化可以比25℃获得最高固定化酶酶活所需的时间更短，而且固定化酶的热稳定性更好。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于在45-70℃下，将游离耐热过氧化氢酶与载体在缓冲液中混合，混合的时间为0.5-10小时，获得的固定化耐热过氧化氢酶。
2.权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述载体为氨基载体或环氧基载体。
3.权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于其中所述混合温度是50-65℃。
4.权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于混合的时间为1.5小时。
5.权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述缓冲液为磷酸缓冲液或硼酸缓冲液，缓冲液的使用浓度为0.1-1.2mol/L。
6.权利要求5所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于缓冲液的使用浓度为0.8mol/L。
7.权利要求1或3或4任一项所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述混合在搅拌下进行，搅拌的速度为50-300rpm。
8.权利要求7所述的制备固定化耐热过氧化氢酶方法，其特征在于所述混合搅拌的速度为150rpm。
9.权利要求1所述的制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于在所述混合之前要将游离耐热过氧化氢酶放置在50-70℃下进行纯化，纯化的时间为0.5-10h。
10.权利要求9所述的制备固定化耐热过氧化氢酶的方法，其特征在于游离耐热过氧化氢酶的纯化温度为65℃，纯化时间为1.5小时。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150624 |