CN104721810B - 类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用，属于类弹性蛋白多肽的医药配置品及用途。本发明所述类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂是由类弹性蛋白多肽风干絮状固体物质溶于磷酸盐缓冲液配制成的终浓度为500uM‑1000uM的液体制剂；其应用是将该液体制剂填充于胃肠道黏膜下层，类弹性蛋白多肽相变为凝胶状，使胃肠黏膜层与固有肌层充分的分离。这种填充剂注射后,胃肠道软组织分离距离显著增加且分离持续时间延长，而不需多次注射；该软组织分离制剂具有良好的生物相容性；其可降解特性更消除了异物残留的担忧。因此本发明适用于消化内镜下治疗中软组织分离，以便切除消化道的病变组织，使操作安全有效。
Description
技术领域
本发明涉及类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用，属于类弹性蛋白多肽的医药配置品及用途。
技术背景
在消化道内窥镜治疗中，内窥镜下黏膜切除术（EMR）及内窥镜黏膜下剥离术（ESD）是目前广泛应用于切除消化道癌前病变与消化道早期肿瘤的标准微创治疗手段。它们不仅可以使患者避免外科开腹手术的痛苦，还可以进行剥离后组织回收，进行病理学诊断，指导术后复查及进一步治疗，因此逐渐成为治疗治疗早期消化道肿瘤的首选方法。尽管这种内镜下治疗具有方法简便、创伤性小，疗效可靠的优势，但是其操作技术难度高，存在着相当比例的穿孔、出血等并发症，因而要求操作者具有更加熟练的操作技术，限制了其临床应用的发展和提高。
在内镜治疗操作中，有效的黏膜下软组织分离制剂注射，可使使黏膜下层与固有肌层分离，有效的分离病变组织与正常组织，以便于操作，预防和减少并发症，已成为提高内镜下黏膜切除治疗安全性的有效措施。但是，传统的软组织分离制剂如生理盐水等，在注射后的维持时间短、重复注射率高，不能有效地减少内镜治疗并发症的发生率，大大降低了内镜治疗的安全性。因此非常有必要寻找新型理想的软组织分离制剂以提高内镜下黏膜切除治疗的高效性和安全性。
类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELPs)是一种用基因工程方法获得的蛋白质聚合物，其结构主要由五肽重复序列（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，即缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-X氨基酸-甘氨酸）构成，来源于弹性蛋白的疏水区域，其中Xaa可以是除脯氨酸以外任一氨基酸。它具有一定的热敏性，当环境温度低于类弹性蛋白多肽的转相温度时，类弹性蛋白多肽呈液体状态；而当环境温度高于转相温度时，类弹性蛋白多肽聚集呈凝胶状。由于类弹性蛋白多肽具有这种特殊性质，加之有良好的组织相容性、非免疫原性，这为其在生物医学材料方面的研究和利用提供了依据。
目前，类弹性蛋白多肽多在组织工程上应用。其水凝胶体已成功应用于软骨、椎骨的组织修复、血管的移植、膀胱干细胞基体神经引导干细胞薄片及手术后的伤口愈合。另外，其在靶向肿瘤和构造药物载体微粒方面也取得了一定的研究进展。
发明内容
本发明就是为了解决现有技术中，传统的软组织分离制剂在注射后的维持时间短、重复注射率高，不能有效地减少内镜治疗并发症的发生率，提高内镜治疗的安全性等问题，而提供一种以类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂，将类弹性蛋白多肽风干絮状固体物质溶于磷酸盐缓冲液制成的终浓度为500uM-1000uM的液体制剂，尤其是浓度为500 uM。
类弹性蛋白多肽分子量为50kD，纯度为大于99%。
本发明所述的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂具有温敏特性，当温度超过其相变温度37℃时，其可由液态转化为凝胶状态。
本发明所述的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂的使用量为单次注射5-10ml。
一种类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂的应用，其是将类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂填充于胃肠道黏膜下层，类弹性蛋白多肽相变为凝胶状，使胃肠黏膜与固有肌层充分分离。
使用时，利用消化内镜进镜，到达操作部位，在内镜下通过注射针，于黏膜下层注射类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂，待黏膜与固有肌层充分分离，进行病变黏膜剥离切除。
本发明的有益效果是：在内镜治疗操作中，应用类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂注射于胃肠道黏膜下层，使黏膜与固有肌层充分的分离，以利于完全切除病变组织。该软组织分离制剂在体温下，由注射时的液相流动状态变相为类凝胶状态，使注射后的软组织分离距离显著增加，且保留时间延长，而不需多次注射，为手术提供良好视野和操作空间，从而提高成功率和减少手术时间，大大减低了内镜治疗并发症如穿孔、出血的发生；该软组织分离制剂具有良好的生物相容性，无毒副作用；其可降解特性更消除了异物残留的担忧。由于本发明适用于消化内镜下治疗中的软组织分离，以便切除病变组织，使操作更安全有效。
附图说明
图1 是不同黏膜下注射剂对SD大鼠胃黏膜厚度随时间变化的影响；
图2是每一时间点各组间黏膜厚度变化的对比图；
图3是30min时不同注射液维持黏膜厚度的组织学表现；
图4是黏膜切除后20min出血量对比图；
图5是注射ELPs内镜下黏膜剥离术标记图；
图6是黏膜下注射ELP后黏膜的隆起；
图7黏膜剥离边缘图；
图8是黏膜切除图；
图9是黏膜剥离形成的人工溃疡图；
图10是黏膜剥离术后人工溃疡2周图；
图11是黏膜剥离术后人工溃疡4周图；
图12是黏膜剥离术后溃疡愈合图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
本发明所述的类弹性蛋白多肽为ELP120-Tyr7, 含有7个酪氨酸，其分子量为50KDa，纯度为大于99%，应用浓度为500 uM，相变温度为37℃(500uM)。
一.类弹性蛋白多肽的制备
1.类弹性蛋白多肽的制备方法：
① 将表达类弹性蛋白多肽的载体转入到大肠杆菌表达菌株中；
② 含有pET-22b-ELPs 重组质粒的BL21 工程菌按 1∶100 的接种量接种到含100μg/mL 氨苄青霉素的TB 培养基中 (每升TB 培养基中含12 g 蛋白胨，24 g 酵母浸提物，2.31 g 磷酸氢二钾，12.54 g 磷酸二氢钾，4 mL 甘油)，37℃下 250 r/min 培养24 h；
③ 在4 ℃，4 000 r/min 离心15 min，收获菌体，用预冷的PBS 缓冲液 (137mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.2 mmol/L NaH2PO4，1.4 mmol/LKH2PO4，pH 为7.3) 重悬菌体，然后置冰浴中超声破碎 (超声2s，间隔3s，共5min)；
④ 类弹性蛋白多肽s 纯化采用可逆相变循环(Inverse transition cycling，ITC)，即在大肠杆菌破碎液，向其加入聚乙烯亚胺 (终浓度为0.5％) 以去除核酸；4 ℃，13000 r/min 离心15min，取上清；向上清液中添加 NaCl 至终浓度为 2 mol/L，37 ℃水浴15min后，13 000 r/min，离心15 min 去上清向沉淀中加入预冷的PBS 溶解沉淀，冰浴15 min后，4℃、13 000 r/min，离心15 min；向上清液中再添加NaCl 至终浓度为2 mol/L，37℃水浴15 min 后，13 000 r/min，离心15 min 去上清；向沉淀中加入预冷的PBS 溶解沉淀，冰浴15 min，4 ℃、13 000 r/min，离心15 min，收集上清液，以上过程为两轮ITC。
2.类弹性蛋白多肽纯度和分子量测定：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测类弹性蛋白多肽纯度。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI–MS）方法检测的类弹性蛋白多肽分子量。
3.类弹性蛋白多肽相变温度测定：测定类弹性蛋白多肽相变温度（A thermallyresponsive biopolymer for intra-articular drug delivery. Journal ofControlled Release 2006,115:175–182），即：测定 10℃到95℃ 类弹性蛋白多肽s的PBS溶液，在波长为350 nm处， 类弹性蛋白多肽溶液的浓度用温度控制的UV-Vis分光光度计测定，升温速率为1℃/min。相变温度定义为在OD350的最大值的一半所对应的温度。
4.类弹性蛋白多肽凝胶黏度测定：将试样倒入带恒温夹套的样品筒中．待恒温至所需温度（37℃）后，测定试样的黏度。每个实验数据均为3次以上测定结果的平均值。 对不同条件下（不同氨基酸组成，温度，浓度，反应时间等的）类弹性蛋白多肽所形成的溶胶或凝胶，通过流变曲线将不同转子及转速下的测定值换算成同一转子和转速下的相当值，以便比较。用黏度评价不同条件下的类弹性蛋白多肽凝固和交联速度和稳固性，探讨最佳的氨基酸组成，控制温度，浓度和反应时间以达到既灌注到了末梢血管（可塑性），又稳固限制类弹性蛋白多肽不流出肿瘤边界。
二.类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂的配制方法，包括以下步骤：
（1）称取50mg 类弹性蛋白多肽风干絮状固体物质；
（2）将絮状固体物质按照50:1比例溶于PBS缓冲液中；
（3）将上述溶液置放于冰盒中低温保存，即得1000 uM浓度的类弹性蛋白多肽溶液；
（4）将1000uM浓度的类弹性蛋白多肽溶液用PBS缓冲液稀释一倍低温保存，即得500uM浓度的类弹性蛋白多肽溶液。
本发明所述的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂的使用方法，包括以下步骤：
（1）利用内镜循腔进镜，缓慢少量给气，到达操作部位；
（2）利用氩气刀进行APC标记，确定病变范围，范围约3.0cm；
（3）自活检孔道插入一次性注射针，于操作部位标记边缘注射混有0.5%美兰染色剂的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂（浓度为500uM）；
（4）注射后待局部黏膜完全隆起，黏膜与固有肌层充分分离，立即经活检孔道插入钩刀、配合IT刀通电剥离切除黏膜。
实施例1：类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂在大鼠胃部黏膜下剥离术中有效性和安全性的研究
1.1实验方法：
54只雄性SD大鼠随机分为三部分（n=18）。每次实验三个组随机各取一只同时进行以下实验，重复进行。禁食24h后称重，5%水合氯醛（0.7ml/100g）腹腔内注射麻醉。大鼠取仰卧位，固定四肢于无菌实验台上，切开腹部，纱布衬垫，暴露鼠胃，用虹膜剪沿胃大弯剪开胃组织，打开胃壁暴露胃黏膜并去除残留物。在整个实验操作过程中密切观察大鼠的呼吸、心率。操作过程中大鼠如出现躁动、挣扎等反应，及时补充麻药，从小量开始，速度缓慢，防止发生麻醉意外。
第一组观察不同软组织分离制剂分离组织的有效性。根据注射不同的注射剂随机分为三个亚组（n=6），暴露胃后壁实验组黏膜下注射类弹性蛋白多肽(ELP)，对照组分别注射透明质酸钠（SH）和生理盐水（NS）均为0.2ml，观察并用游标卡尺记录药物注射后0min，5min，10min，30min及60min局部黏膜隆起厚度及黏膜表面的改变；第二组显微镜下观察注射不同软组织分离制剂后30min黏膜隆起的HE组织学表现（n=6）；第三组，观察黏膜下剥离时不同软组织分离制剂对出血的影响（n=6）。给予上述软组织分离制剂处理后，用无菌手术刀片完整切除黏膜下注射后形成的隆起部位，利用电子天平称取棉签重量测定黏膜切除20分钟内的出血量。
1.2 实验结果
（1）黏膜隆起厚度的变化
ELP、SH和NS组注射后初始抬举厚度为4.14±0.37mm、3.77±0.43mm、3.43±0.67mm；30min、60min后ELP组抬举厚度为胃壁厚度的2.0～2.3倍；SH组为1.5倍；NS组为0.5～1.0倍。ELP组与SH或NS组相比黏膜隆起变化更为缓慢稳定，差异有显著性；注射5min后的各时间点，ELP组黏膜隆起厚度与SH、NS组相比差异性显著,即ELP组黏膜隆起厚度始终明显大于SH、NS组，参照图1，ELP组、SH组、NS组黏膜隆起在60min内均有下降趋势，ELP组更为缓慢、持久；★ELP、SH与NS相比P<0.05；■ELP与SH相比P<0.05。
（2）组织学改变
30min时不同软组织分离制剂维持黏膜厚度的组织学表现如下，组织学观察ELP组维持黏膜隆起厚度明显大于SH、NS组，参照图2，注射5min后，ELP组黏膜隆起厚度始终明显大于SH、NS组；注射10min后,SH组与NS组相比差异有统计学意义，即SH组黏膜隆起厚度大于NS组，★P<0.05；ELP注射部位的周围组织中未见明显的炎性细胞浸润，未见组织细胞明显的坏死；参照图3，ELP注射部位的周围组织中未见明显的炎性细胞浸润，未见组织细胞明显的坏死。
（3）各组黏膜隆起剥离出血量
ELP组、SH组及NS组黏膜隆起剥离时的出血量分别为854.8±98.9mg、726.3±104.8mg、1144.0±112.4mg。ELP组、SH组分别与NS组相比差异有显著性，即类弹性蛋白多肽与SH组在黏膜剥离后的出血量明显低于NS组，参照图4，不同组黏膜切除均有出血； ELP与SH组在黏膜剥离后的出血量明显低于NS组；▲：P<0.05。
1.3实验结论
黏膜下注射类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂，在黏膜下组织中的弥散明显延缓，在黏膜下形成较持久的液体垫维持黏膜厚度，有利于黏膜组织的剥离切除，并可以减少出血量；组织学观察类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂注射部位的周围组织中未见明显的炎性细胞浸润及坏死。这些结果提示其可以有效地减少黏膜剥离中并发症的发生并且对组织未造成明显损伤，具有作为内镜治疗操作过程中黏膜下软组织分离制剂的潜在可能性。
实施例2：类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂在内镜下黏膜剥离术中有效性和安全性的研究
2.1实验方法：
小猪(35.1±3.5kg)禁食水24小时，小猪腿部备皮，取左侧卧位，肌注氯胺酮（20mg/kg），插管连接呼吸机，并以丙泊酚静脉诱导并维持麻醉。同时打开内镜主机，调试好工作站和刻录机，安装胃镜，连接吸引器，连接好电切设备，备好一次性注射针，注射器等。利用内镜循腔进镜，缓慢少量给气，到达胃部；利用氩气刀进行APC标记，范围约3.0cm; 自活检孔道插入一次性注射针，于胃壁标记边缘注射混有0.5%美兰的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂（浓度为500uM）；注射后待局部黏膜完全隆起，立即经活检孔道插入钩刀、配合IT刀通电剥离。观察黏膜切除操作的难易程度，并发症发生情况，剥离的黏膜完整情况。术毕，复苏动物，送回动物房继续饲养，两周后复查胃镜，观察局部溃疡愈合情况。参见图5、图6、图7、图8、图9。
2.2 实验结果，参见图10、图11、图12。
（1）单次注射10ml的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂后可使标记区域黏膜完全隆起；电切过程不需要再次补充类弹性蛋白多肽；
（2）电切剥离黏膜容易，未出现出血、穿孔等并发症；
（3）标记黏膜可以完整切除，未见标记区域黏膜残留；
（4）术后复查胃镜局部溃疡明显缩小。
2.3 实验结论
单次黏膜下注射类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂可以使黏膜和固有肌层充分分离，操作过程持续期间不需要再次补充软组织分离制剂，并且大大降低了手术并发症发生率，操作形成的人工溃疡愈合良好。以上证明类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂可以作为一种新型理想的黏膜下软组织分离制剂，应用于内镜治疗，提高内镜下治疗的高效和安全性。
Claims (1)
1.一种类弹性蛋白多肽在制备软组织分离制剂中的应用，其是将类弹性蛋白多肽风干絮状固体物质溶于磷酸盐缓冲液配制成终浓度为500uM的液体制剂，所述液体制剂填充于胃肠道黏膜下，温度超过37℃时，类弹性蛋白多肽相变为凝胶状，使胃肠黏膜与固有肌层充分的分离。
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