CN104721131A

CN104721131A - 一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂及制备方法

Info

Publication number: CN104721131A
Application number: CN201510165083.4A
Authority: CN
Inventors: 吴敬波; 傅少志; 邹晓晏
Original assignee: Affiliated Hospital of Luzhou Medical College
Current assignee: Affiliated Hospital of Luzhou Medical College
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2035-04-09
Also published as: CN104721131B

Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂及其制备方法，它包括重量比为（100～250）︰（4～20）︰（2000～4000）︰（8000～6000）的紫杉醇胶束、顺铂、温敏性水凝胶和生理盐水，其中，温敏性水凝胶选自嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇。本发明提供的用于肿瘤局部原位治疗的凝胶制剂，能够提高顺铂和紫杉醇药物的靶向性，减小其毒副作用，解决癌症患者身体深部癌组织的定点给药、原位局部治疗的难题，达到更好的持续治疗效果，并且该凝胶制剂具有双重缓释功效，其同时负载顺铂和紫杉醇，将细胞周期特异性药物和非特异性药物搭配使用，起到了协同增强的效果，提高了对肿瘤组织的杀灭作用。

Description

一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗肿瘤的药物制剂，具体涉及一种用于肿瘤原位局部治疗的凝胶药物制剂。

背景技术

近年来，恶性肿瘤的发病率及死亡率都逐年升高，严重威胁着人类的健康。对于肿瘤的治疗，主要有手术治疗、化疗、放疗、药物治疗等，在各种治疗方法中，化疗仍然是治疗许多肿瘤的常用方法。但是许多化疗药物，比如紫杉醇、顺铂等，其药物靶向性都很差，采用传统的输注途径往往因为药物靶向性差而产生巨大的毒副作用，这样很难使药物在肿瘤局部发挥作用。

发明内容

本发明的目的就在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于肿瘤局部原位治疗的凝胶制剂，提高顺铂和紫杉醇药物的靶向性，减小其毒副作用，解决癌症患者身体深部癌组织的定点给药、原位局部治疗的难题，达到更好的持续治疗效果，并且该凝胶制剂具有双重缓释功效，其同时负载顺铂和紫杉醇，将细胞周期特异性药物和非特异性药物搭配使用，起到了协同增强的效果，提高了对肿瘤组织的杀灭作用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂，包括重量比为（100～250）︰（4～20）︰（2000～4000）︰（8000～6000）的紫杉醇胶束、顺铂、温敏性水凝胶和生理盐水。

其中，温敏性水凝胶选自嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇（PEG-PCL- PEG），简称PECE，其中嵌段PEG与嵌段PCL的分子量之比为（1～3）︰1。若该比例小于1︰1，则聚合物中的亲水链段PEG比例过高而导致聚合物溶解性太好，不能形成凝胶；若该比例大于3︰1，则因聚合物中疏水链段PCL的比例太高而导致聚合物不能溶解于水，即不能形成溶液。

紫杉醇胶束由嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）包裹紫杉醇药物分子制成，相应的制备方法可见专利ZL 201110139616.3 “二嵌段聚合物负载紫杉烷类药物的胶束和冻干制剂、制法及应用”所述。紫杉醇药物分子在胶束中所占的质量分数为4%～10%，若低于4%，则在配置水凝胶时要保障紫杉醇药物剂量为1毫克的话就需要加入更多的胶束粉末，这样则会影响所形成的水凝胶的温度敏感性能。若高于10%，加入的胶束粉末虽少，但是载药量高了会使形成的胶束的核壳结构不稳定，药物容易从胶束中崩解出来形成突释现象，从而使胶束的药物缓释功能大打折扣。

本配方中顺铂的质量相对其他组分来说介于4—20毫克，主要是因为若是低于含量4毫克的话，要达到相当的治疗效果，就需要注射更多剂量的凝胶制剂，给病人和临床医师带来更多的负担和操作困难。而20毫克则是目前临床治疗过程中成人每天接受顺铂治疗的最大剂量。

本配方中凝胶基质PECE聚合物介于2000—4000，而生理盐水介于8000—6000，主要是因为这二者是配置水凝胶的基础材料，当PECE聚合物取2000毫克时，生理盐水取8000毫克，此时配制的水凝胶中PECE质量分数为20%；而当PECE聚合物取4000毫克时，生理盐水取6000毫克，此时配制的水凝胶中PECE质量分数为40%。若是PECE质量分数低于20%，则此时配制出的水凝胶太稀而不能呈现良好的温度敏感性能，注射到体内肿瘤组织后容易流出而造成药物损失。而当质量分数高于40%时，配制出的凝胶体系由于太粘稠而造成注射时的推挤困难。

上述用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂的制备方法为：

（1）按照重量比为紫杉醇胶束粉末︰顺铂︰PECE︰生理盐水=（100～250）︰（4～20）︰（2000～4000）︰（8000～6000），准确称取各原料；

（2）在室温下将PECE完全溶解于生理盐水中，然后将其加热至60℃保持1～3分钟后再放入0℃冰水中孵化直至形成无色透明的溶液；

（3）将顺铂和紫杉醇胶束粉末加入步骤（2）制得的溶液中，利用搅拌、超声波等方式使二者在溶液中分散均匀，然后采用钴60机器进行灭菌，选用剂量为2000cGy，照射时间25分钟，即得本发明凝胶制剂。

要将顺铂和紫杉醇胶束共同负载于PECE上制成凝胶制剂，关键在于要将顺铂和紫杉醇胶束粉末完全分散在PECE溶液中，而PECE室温下溶解时一般呈乳白色浑浊不透明的混合液，因此在这个过程中要采用加热到60^oC保持1-3分钟左右的方法助溶，然后再放在0^oC冰水浴中孵化直到形成无色透明的溶液，这样顺铂和紫杉醇胶束粉末才能完全分散在PECE溶液中。PECE在经过室温溶解—加热助溶—冰浴孵化后一定要能形成透明的溶液，而要达到这个要求的话，对负载体的要求就是聚合物PECE(PEG-PCL-PEG)中PCL嵌段分子量与PEG嵌段分子量之比在（1～3）︰1之间。若该比例小于1︰1，则聚合物中的亲水链段PEG比例过高而导致聚合物溶解性太好，不能形成凝胶；若该比例大于3︰1，则因聚合物中疏水链段PCL的比例太高而导致聚合物不能溶解于水，即不能形成溶液。

本发明将由温敏性水凝胶、顺铂、紫杉醇胶束合成的双重药物缓释制剂通过瘤内注射应用于肿瘤的原位局部治疗，本发明制剂在室温下呈可流动的低粘度溶胶状态，注射到体内即变为不能流动的凝胶状态，从而在局部将顺铂与纳米紫杉醇胶束缓慢释放出来，起到持续治疗作用。其中，紫杉醇胶束以缓释胶束的形式存在，即将具有抗癌作用的紫杉醇包裹在缓释胶束中，包裹在胶束中的紫杉醇释放较慢，从而再次起到持续抗肿瘤的作用。

紫杉醇在本发明中经PEG-PCL和PECE的二次包裹，当凝胶注射到组织内后，水凝胶基质PECE先降解，此时其中负载的顺铂先释放出来发挥对肿瘤细胞的毒杀作用，同时包裹紫杉醇的胶束也被释放出来，但是此时紫杉醇尚包裹于聚合物胶束中，还未发挥其毒性作用。随后随着其载体二嵌段聚合物PEG-PCL的降解，紫杉醇才开始释放出来发挥作用。本发明采用这种一前一后的释放方式使凝胶具有双重缓释功效，从而使细胞周期特异性药物和非特异性药物搭配起来使用，起到了协同增强的效果，更有利于提高疗效。

本发明选择PECE作为顺铂和紫杉醇的药物载体，首先因为其温度敏感性，经发明人实验发现，PECE水凝胶的温敏性能是其在较低温度（如室温）时处于流动的溶胶状态，而当温度达到36℃时则发生溶胶-凝胶转变，变成不能流动的凝胶状态。而这个转变温度刚好处于体温附近，这意味着在低温时可将其轻松吸入注射器等容器内，并从体外注射到体内。当在体温的作用下使其温度高于36℃时便会发生凝胶转变，成为不能流动的水凝胶。因此其作为本发明凝胶制剂的药物载体是非常适合的。其次，制备PECE温敏性水凝胶的基质是可降解聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇（PEG-PCL-PEG），其中的组分PEG和PCL都是经过美国食品药品管理局（FDA）认可的可用于人体的聚合物材料，因此由这两种嵌段组成的聚合物PECE也同样具有良好的生物相容性，当被用作生物医药材料时容易获得国家批准。另外，合成这个聚合物的起始材料是聚乙二醇（PEG）和聚己内酯（PCL），成本较低，合成操作简单，收率高。

与现有技术相比，本发明创造性的将细胞周期特异性药物紫杉醇和细胞周期非特异性药物顺铂共同负载于一种温敏性水凝胶中，并且紫杉醇以胶束形式存在，使得本发明具有双重缓释效果。在室温条件下本发明凝胶药物呈可流动的低粘度溶胶状态，当注射到体内后随即转变为不能流动的凝胶，从而将顺铂与紫杉醇缓慢释放出来。本发明利用温敏性水凝胶的热响应特性，在实验中用于肺癌的瘤内注射，在肿瘤组织内部形成一个原位的药物释放中心，起到持续的原位靶向治疗作用，具有明显的抗肿瘤作用，同时减少了传统给药途径引起的全身毒副作用，在肿瘤的原位局部治疗中具有潜在的应用前景。本发明是一种可以用于肿瘤原位局部治疗的新制剂，在临床运用中具有重要意义，特别是可以在CT引导下在体外以最小的侵入方式将本发明药物制剂注射到体内深部的肿瘤组织内，直接建立原位靶向的局部治疗。

附图说明

图1为本发明凝胶制剂的性状照片，其中A瓶处于室温状态，B瓶处于35℃温度下；

图2为本发明凝胶制剂的储能模量图；

图3为体内抗肿瘤作用下的瘤块体积的变化结果图；

图4为肺癌裸鼠模型的生存分析图。

具体实施方式

为了更加清楚的理解本发明的目的、技术方案及有益效果，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不将本发明的保护范围限定在以下实施例中。

一、实验材料：

1、实验动物：健康雌性裸鼠，3-4周龄，体重18-24g，购自重庆腾鑫药物技术有限公司（实验支物合格证编号：SCXK（京）2012-0006），SPF条件下分笼饲养，自由进食饮水。

2、细胞株：A549肺癌细胞株（泸州医学院附属医院中心实验室提供，保种于泸州医学院附属医院肿瘤科实验室）。

3、主要试剂：

ε-己内酯（ε-CL）：购自美国Alfa Aesar公司。

聚（乙二醇）甲基醚 (MPEG, Mn= 550 and 2000)：购自美国Aldrich公司。

辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)：购自美国Sigma公司。

六亚甲基二异氰酸酯 (HMDI)：购自美国Aldrich公司。

顺铂注射液（DDP）：购置云南个旧药物药业有限公司（6mg/mL，生产批号：100100002）

紫杉醇注射液：购自四川太极集团。

紫杉醇标准品：购自成都曼斯特药物有限公司，生产批号：100401-200501。

10%胎牛血清：购Hyclone公司。

0.25%胰酶：购自Hyclone公司。

RPMI-1640培养基：购自美国Sigma公司。

MTT：购自美国Sigma公司。

甲醇和乙腈色谱纯：购自成都科龙化学试剂公司。

二、制备嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇（PECE）和嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯（MPEG-PCL）：

MPEG-PCL聚合物是以Sn(Oct)₂作为催化剂，以聚合物MPEG为引发剂，通过ε-CL 的开环聚合反应合成的，就是将ε-CL与MPEG一起放入干燥的含有氮气的玻璃容器中，加入催化剂Sn(Oct)₂并辅以温和的搅拌。玻璃容器内温度必须保持在130摄氏度，并持续6小时。MPEG-PCL聚合物在进一步应用前必须经过纯化并放于干燥、密闭的容器中。

PECE聚合物分两步合成。首先，通过催化剂Sn(Oct)₂的作用，聚合物MPEG引发ε-CL 进行开环聚合反应合成出理论分子量为1650的双嵌段共聚物MPEG-PCL (MPEG550-PCL1100)。其次，将上一步合成的双嵌段共聚物MPEG-PCL在HMDI作用下通过交联反应合成PECE三嵌段共聚物。所合成PECE三嵌段共聚物的分子量大约为3140。

三、制备纳米紫杉醇胶束（MPEG-PCL/PTX）：

将96mg实际分子量为3860的MPEG-PCL双嵌段共聚物（理论分子量为4000(MPEG2000-PCL2000) 与4mg的紫杉醇标准品溶于10ml的无水乙醇中，并在40摄氏度下温和的搅拌。待所有成分都完全溶解形成均一、透明的溶液后，将溶液通过旋转蒸发器蒸发，温度控制在60摄氏度。当所有的无水乙醇蒸发以后，紫杉醇以非结晶形式分散于聚合物中并在瓶壁形成一薄层分散膜，然后去离子水加入瓶中在65摄氏度的水浴中轻轻振摇使药物薄膜完全溶于水中，即形成MPEG-PCL/PTX胶束溶液，并通过220纳米的滤器过滤负载紫杉醇的澄清胶束溶液。将该溶液通过冷冻干燥机冻干成白色粉末状的MPEG-PCL/PTX胶束药物。

四、制备本发明凝胶制剂：

本发明凝胶制剂重量比为紫杉醇胶束︰顺铂注射液︰PECE︰生理盐水=（100～250）︰（4～20）︰（2000～4000）︰（8000～6000）。

制备方法为：

1、在室温下将PECE完全溶解于生理盐水中，然后将其加热至60℃保持1～3分钟后再放入0℃冰水中孵化直至形成无色透明的溶液；

2、将顺铂注射液和紫杉醇胶束加入上述步骤制得的溶液中，利用搅拌、超声波等方式使二者在溶液中分散均匀，然后采用钴60机器进行灭菌，选用剂量为2000cGy，照射时间25分钟，即得。

五、本发明凝胶制剂的流变学特性：

流变学特性通过试管倒置法和AR2000 ex流变仪（TA仪器公司，美国）进行检测。参见图1，通过试管倒置法看出，在室温下，本发明凝胶制剂PDMP是呈可流动的溶胶状态；当温度升至生理体温附近（大约37℃）时，流体状态的凝胶制剂即变为不能流动的胶体状态。参见图2储能模量图可以得到本发明凝胶制剂的流变结果为：当温度低于24摄氏度时，凝胶药物体系有较低的储能模量(G')和损耗模量(G'')，表明该凝胶药物体系在转变为不能流动的凝胶状态，低于该温度时呈可流动的低粘度液体状态；当温度高于35摄氏度时，该体系的储能模量(G')和损耗模量(G'')显著提高，表明此时已转变为不能流动的凝胶状态。

六、本发明凝胶制剂的体内抗肿瘤作用：

使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基将A549细胞放在37℃饱和湿度、5%CO₂恒温培养箱内培养。待细胞铺满80%培养瓶后，搜集1×10⁶个/ml单细胞悬液。在每只裸鼠右侧腋下接种100ul (即含1×10⁶ 个肿瘤细胞)A549细胞, 约3周后该部位长出约6×6mm的瘤块，作为保种传代的荷瘤裸鼠。选择肿瘤生长良好,无自发性出血坏死、瘤周无感染病灶的保种传代的荷瘤裸鼠进行体内传代，经传3代后，待荷瘤平均大小达到7×7mm左右，得到供瘤鼠3只，选择肿瘤生长良好,无自发性出血坏死、瘤周无感染病灶的荷瘤鼠，无菌皮下剥离出肿瘤，去除皮肤及包膜，用0.9%生理盐水漂洗血液及皮毛，选取鱼肉状组织并切成约2×2mm大小的组织块，接种于实验裸鼠的右侧腋下，3周左右长出长径约7×7mm左右的近圆形实体瘤。随机将24只荷瘤裸鼠（每组小鼠的体重和肿瘤体积经统计学分析差异无统计学意义）随机分为4组（各组分别为6只）， (a)：生理盐水组(NS组)；(b)：空白PECE组( PECE组)；(c)：单纯的PTX(5mg/Kg) +DDP (2mg/Kg)(PTX+DDP组)；(d)：PECE/DDP+ MPEG-PCL/PTX组 (PDMP组，又名双重药物缓释制剂组)。

采用A549裸鼠肺癌移植瘤模型通过瘤内注射对双重药物缓释制剂体内抗肿瘤的作用进行评估。参见图3、图4，可以得到本发明制剂能明显抑制肿瘤生长，并且明显延长荷植瘤裸鼠的生存期：双重药物缓释制剂组的中位生存期为53天，与游离药物DDP+PTX组（40天）、单纯PECE水凝胶组（26天）、NS组（25天）相比是明显延长的，并且其差异具有统计学意义（P < 0.05)。而单纯的PECE凝胶载体材料则未展现出任何的抗肿瘤作用。

Claims

1.一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂，其特征在于：所述凝胶制剂包括紫杉醇胶束、顺铂、温敏性水凝胶和生理盐水，其重量比为紫杉醇胶束︰顺铂︰温敏性水凝胶︰生理盐水=（100～250）︰（4～20）︰（2000～4000）︰（8000～6000）。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂，其特征在于：所述的温敏性水凝胶选自嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇。

3.根据权利要求2所述的一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂，其特征在于：所述的嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇中聚乙二醇嵌段与聚己内酯嵌段的分子量之比为（1～3）︰1。

4.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂，其特征在于：所述的紫杉醇胶束由嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯包裹紫杉醇药物分子制成，紫杉醇药物分子在胶束中所占的质量分数为4%～10%。

5.一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）按照重量比为紫杉醇胶束︰顺铂︰嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇︰生理盐水=（100～250）︰（4～20）︰（2000～4000）︰（8000～6000），准确称取各原料；

（2）在室温下将嵌段聚合物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇完全溶解于生理盐水中，然后将其加热至60℃保持1～3分钟后再放入0℃冰水中孵化直至形成无色透明的溶液；

（3）将顺铂和紫杉醇胶束加入步骤（2）制得的溶液中混匀，灭菌即得。

6.根据权利要求4所述的一种用于肿瘤原位治疗的凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述灭菌方式采用钴60机器进行灭菌，选用剂量为2000cGy，照射时间25分钟。