CN102973941A

CN102973941A - 包载化疗药物的聚合物水凝胶及其在预防肿瘤复发和防治术后腹腔粘连中的用途

Info

Publication number: CN102973941A
Application number: CN2012104506189A
Authority: CN
Inventors: 钱志勇; 巩长旸; 魏于全; 赵霞
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明属于医药用高分子材料领域，具体涉及能预防肿瘤复发和防治术后腹腔粘连的包载化疗药物的聚合物水凝胶。本发明所要解决的技术问题是为对抗肿瘤细胞减灭术后既有肿瘤残余，又伴有腹膜缺损的复杂情况提供一种有效的新选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种包载化疗药物的聚合物水凝胶，所述聚合物水凝胶为PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物或PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物溶于水中制成的凝胶。制备方法为将PEG-PCL-PEG共聚物或PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物40～60°C下溶于水中，自组装形成胶束，然后加入化疗药物溶液，继续搅拌，形成载化疗药物水凝胶体系。为肿瘤细胞减灭术后抗癌防粘同步治疗模式提供了一种新的有效选择。

Description

包载化疗药物的聚合物水凝胶及其在预防肿瘤复发和防治术后腹腔粘连中的用途

技术领域

本发明属于医药用高分子材料领域，具体涉及能预防肿瘤复发和防治术后腹腔粘连的包载化疗药物的聚合物水凝胶。

背景技术

癌症是人类最严重的疾病之一，每年导致几百万患者的死亡。作为癌症的高发类型之一，盆腹腔恶性肿瘤占每年新增肿瘤患者的10%。对于直结肠癌，卵巢癌和其他晚期盆腹腔恶性肿瘤患者，肿瘤细胞减灭术是一种非常有效的治疗方法，可以为术后化疗创造有利条件。但是肿瘤细胞减术后肿瘤残留和严重的术后盆腹腔粘连会对患者的预后有很大的影响。

对于术后残余肿瘤，术后化疗在临床上广泛应用，并被证明是一种有效的治疗方法。但是化疗药物没有特异性，且有较强的毒副作用，会产生严重的骨髓抑制和免疫抑制，这就影响了静脉给药的术后化疗强度。作为一种新的化疗策略，腹腔化疗已经在进行临床试验，预期其会提高化疗效果。采用腹腔化疗的原因是腹腔化疗可以达到更高的细胞毒性药物浓度，并可以延长与病灶的接触时间，同时与静脉给药相比可以降低系统毒性。最近，在III期临床试验中发现，腹腔化疗比传统静脉化疗在残余小体积上皮卵巢癌的治疗中有治疗优势。

尽管肿瘤细胞减灭术为后续的腹腔化疗创造了有利条件。但此类手术却无可避免地导致了广泛的腹膜缺损，继而形成广泛的腹腔粘连，这不仅影响了化疗药物在腹腔内的分布，从而降低了腹腔化疗的效果，还甚而可以导致化疗失败。除药物分布以外，腹腔化疗疗效还取决于药物对癌组织的渗透深度，而后者又与腹腔内药物浓度及药物滞留时间密切相关。因此，如何预防肿瘤细胞减灭术后的腹腔粘连以及提高腹腔药物浓度、延长药物在腹腔中的滞留时间是两个非常值得探究的课题。前期的研究中，我们已经成功制备了具有良好的生物相容性及生物可降解性的温度敏感型PEG-PCL-PEG水凝胶和PCL-PEG-PCL水凝胶（一种温度敏感型三嵌段共聚物及其制备方法和用途ZL 200810300751.X，具溶胶-凝胶转变特性的温敏型三嵌段共聚物及制备方法，ZL200810300757.7）。该体系在低温时呈液态，易于与药物混合，而在37°C附近则呈不可流动的凝胶状，可以作为药物缓释载体^{[44,48-50,52,53,140]}。体外药物释放实验证实该水凝胶具有良好的药物缓释特性。我们还证实了该水凝胶具有良好的防治腹腔粘连效果(CN200910304210.9PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物在制备医用防粘连材料中的用途,CN201010138739.0PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物在制备医用防粘连材料中的用途)。

本领域目前需要有能够对抗肿瘤细胞减灭术后既有肿瘤残余，又伴有腹膜缺损的复杂情况的术后抗癌防粘连产品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为对抗肿瘤细胞减灭术后既有肿瘤残余，又伴有腹膜缺损的复杂情况提供一种有效的新选择。

本发明解决技术问题的技术方案是提供一种包载化疗药物的聚合物水凝胶，其特征在于：所述聚合物水凝胶为PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物或PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物溶于水中制成的凝胶。

其中，所述PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物分子量为1500～8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.2～2.5。

其中，所述PCL-PEG-PCL共聚物分子量为2000～5000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.3～2。

其中，上述的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物为PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物为C₇₀₀–E_1000–C₇₀₀、C₁₀₀₀-E₁₀₀₀-C₁₀₀₀、C₁₀₀₀-E₁₅₀₀-C₁₀₀₀、C₁₅₀₀-E₂₀₀₀-C₁₅₀₀、C₁₅₀₀-E₁₅₀₀-C₁₅₀₀及C₂₀₀₀-E₂₀₀₀-C₂₀₀₀；其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。

其中，上述的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的浓度为5-40wt%。

其中，上述PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的浓度为8-25wt%。

其中，上述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500～10000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.4～2.6。

其中，上述PEG-PCL-PEG共聚物分子量为2000～8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.5～2。

其中，上述的PEG-PCL-PEG共聚物为：

E₅₅₀–C₂₀₀₀-E₅₅₀、E₅₅₀–C₂₂₀₀-E₅₅₀、E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀、E₇₅₀-C₂₅₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₃₀₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₃₅₀₀-E₇₅₀或E₁₅₀₀-C₃₀₀₀-E₁₅₀₀中的至少一种；其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。

其中，上述共聚物的浓度为15～40wt%。

其中，上述共聚物的浓度为20～30wt%。

其中，上述的化疗药物为紫杉醇、顺铂、阿霉素中的至少一种。

其中，上述的化疗药物的浓度为0.1-100mg/mL。

其中，上述的化疗药物的浓度为0.1-50mg/mL。

其中，上述的化疗药物的浓度为0.1-10mg/mL。

其中，上述的水为生理盐水。

本发明还提供了制备上述聚合物水凝胶的方法，其特征在于包括下述步骤：将PEG-PCL-PEG共聚物溶于水中，自组装形成胶束，并降温至4°C使体系处于溶胶状态，得到空白水凝胶，空白水凝胶在4°C下搅拌，加入PBS溶液混合均匀，然后加入化疗药物溶液，继续搅拌，形成载化疗药物水凝胶体系。

进一步的，上述的聚合物水凝胶水凝胶的制备方法包括以下步骤；首先，将PEG-PCL-PEG共聚物或PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物在温度40～60°C下溶于水中，自主装形成胶束，并降温至0～4°C使体系处于溶胶状态，得到空白水凝胶；边搅拌，边加入PBS溶液，然后加入盐酸阿霉素溶液，继续搅拌10--30min，形成载Dox水凝胶体系。最终水凝胶的浓度为15-35wt%，Dox的最终浓度范围0.1-20mg/mL。

同时，本发明还提供了上述的聚合物水凝胶在制备能预防肿瘤复发和防治术后腹腔粘连的医疗器械和/或药物中的用途。所述的术后腹腔粘连是指瘤细胞减灭术后的腹腔粘连。

由于腹腔粘连不仅影响了化疗药物在腹腔内的分布，从而降低了腹腔化疗的效果，还甚而可以导致化疗失败。除药物分布以外，腹腔化疗疗效还取决于药物对癌组织的渗透深度，而后者又与腹腔内药物浓度及药物滞留时间密切相关。因此，如何预防肿瘤细胞减灭术后的腹腔粘连以及提高腹腔药物浓度、延长药物在腹腔中的滞留时间是两个非常值得探究的课题。在本发明中建立了全新的术后残余肿瘤并腹腔损伤粘连模型，来模拟临床中出现的在肿瘤细胞减灭术后既有肿瘤残余，又伴有腹膜缺损的复杂情况。通过载模型化疗药物的PCL-PEG-PCL和PEG-PCL-PEG水凝胶体系的治疗，证明该载药水凝胶体系是否可以同时防治术后腹腔粘连和提高术后化疗效果。并发现载有高浓度阿霉素的水凝胶体系对腹膜创面无危害、腹膜的复原过程好，从而为肿瘤细胞减灭术后抗癌防粘同步治疗模式提供了一种新的有效选择。

附图说明

图1Dox水凝胶的制备与表征。A：Dox水凝胶在10℃和37°C；B：SEM图片；C：流变测试；D：凝胶时间测试；E：体外释放行为。图1为载Dox水凝胶体系的体外药物释放行结果。从图中可以看出，Dox可以在较长的时间内从水凝胶体系中缓慢释放出来。在第一小时和第一天，分别有6.15%和27.69%的Dox释放出来，在14天的释放周期内，有52%的Dox释放出来。

图2Dox水凝胶对小鼠CRPC模型的治疗效果。A：生理盐水组；B：空白水凝胶组；C：游离Dox组；D：Dox水凝胶组；E：各组小鼠的生存曲线。

图3小鼠腹膜-盲肠摩擦模型的建立（A）和治疗（B），及对照组（C）和治疗组（D）的粘连评价。

图4各组小鼠的组织标本病理观察和扫描电镜观察。A至Ｃ分别为水凝胶治疗组修复的腹壁，修复的盲肠和对照组粘连组织。Ｄ至Ｅ分别为水凝胶治疗组修复的腹壁表面，修复的盲肠表面和盲肠表面高倍放大。CE：肠粘膜；SK：腹壁骨骼肌；SM：肠平滑肌；Me：间皮细胞。

图5水凝胶在小鼠腹腔粘连模型中的组织粘附和降解行为。

图6Dox水凝胶治疗组小鼠的组织标本病理观察和扫描电镜观察。A和B分别为修复的盲肠和修复的腹壁，可见新生间皮细胞层。C和D分别为修复的盲肠表面和修复的腹壁表面SEM照片，可见表面梭形间皮细胞；E和F分别为修复的盲肠表面和修复的腹壁表面SEM高倍放大照片，可见表面长满绒毛的梭形间皮细胞。SK：腹壁骨骼肌；SM：肠平滑肌；Me：间皮细胞。

图7术后肿瘤残余并腹膜损伤模型的建立和治疗效果评价。A：肿瘤结节取出；B：腹膜-盲肠摩擦损伤；C：Dox水凝胶进行治疗；D：生理盐水组治疗效果；E：空白水凝胶组治疗效果；F：游离Dox组治疗效果；G：Dox水凝胶组治疗效果。

具体实施方式

实施例一

1实验操作及结果

1.1原料与试剂

阿霉素（Dox,Sigma,USA），多聚甲醛（成都科龙化工试剂厂）。以上药品及其它试剂均为分析纯。

PEG-PCL-PEG（聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇）和PCL-PEG–PCL（聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯）共聚物参加之前发明人发表的文章及已经公开的专利申请：一种温度敏感型三嵌段共聚物及其制备方法和用途ZL200810300751.X。具溶胶-凝胶转变特性的温敏型三嵌段共聚物及制备方法ZL200810300757.7。

CT26细胞株购自American Type Culture Collection(ATCC),四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室保存。RPMI1640培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibico BRL公司，培养基用青霉素和链霉素为国产注射用药。

BALB/c小鼠，鼠龄6-8周，体重18±2克，雌性，购于四川大学实验动物中心。饲养温度为20-22°C，相对湿度50-60%，自由取食取水，小鼠在实验前至少饲养一周熟悉新环境。1.2载Dox水凝胶的制备与表征

首先，将PEG-PCL-PEG共聚物（E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀），或者PCL-PEG-PCL共聚物(C₁₀₀₀-E₁₀₀₀-C₁₀₀₀)在60°C下溶于水中，自组装形成胶束，并降温至4°C使体系处于溶胶状态，得到空白水凝胶。载Dox的水凝胶体系采用pH介导的自主装方法制备，按上述方法制备出空白水凝胶体系，取0.7mL在4°C下搅拌，加入0.1mL PBS溶液（10X），然后加入0.2mL盐酸阿霉素溶液，继续搅拌30min，形成载Dox水凝胶体系。最终水凝胶的浓度为25wt%。Dox的最终浓度0.5mg/mL。

Dox水凝胶的形貌采用扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）观察。Dox水凝胶体系的温度依赖性相转变通过流变法测试，方法如前所述；水凝胶体系的凝胶时间通过流变法测试，将处于溶胶状态下的水凝胶体系（4°C）分别迅速升温至25°C和37°C，监测其储能模量和耗散模量的变化，每10秒钟采集数据一次^[141]。载Dox水凝胶体系的体外药物释放行为通过无透析膜法进行测试。将200mL载Dox水凝胶体系（凝胶浓度25wt%，含1mg Dox）装入5mL EP管中，加入1mL的PBS（pH=7.4），并置于37m转速为100rpm的空气浴摇床中。在特定的时间点，释放介质被全部取出，换为预热的新PBS液。取出的液体于-20°C冷冻保存待测。释放介质中的Dox含量通过HPLC检测。

1.3小鼠结肠癌腹腔转移模型建立和治疗

小鼠结肠癌腹腔转移模型（CRPC）采用BALB/c小鼠建立,每只小鼠腹腔接种200μL CT26细胞悬液，含细胞2×10⁵个。使用上述制备的装载Dox的PEG-PCL-PEG水凝胶和空白PEG-PCL-PEG水凝胶进行试验。在接种后，80只小鼠被随即分为4组，每组20只，在肿瘤接种后7天，肿瘤生长至直径约为2mm时开始治疗。各组老鼠分别腹腔注射200L以下药物（单次治疗）：Dox水凝胶（含5mg/kg Dox），游离Dox溶液（含5mg/kg Dox），空白水凝胶和生理盐水。在观察肿瘤生长组（10只/组），接种肿瘤细胞21天后处死小鼠，统计各组肿瘤结节数目和重量。在观察生存期组（10只/组），统计小鼠的生存期，小鼠没有心跳和呼吸判定为死亡。

1.4小鼠腹壁-盲肠摩擦腹腔粘连模型的建立和治疗

BALB/c小鼠用来建立腹壁-盲肠摩擦腹腔粘连模型，并进行治疗和效果评价。采用戊巴比妥钠溶液（10mg/mL）腹腔注射麻醉，备皮，消毒术区并铺巾。取腹部正中切口达腹腔，寻找盲肠并用无菌干纱布摩擦其浆膜面直至损伤并伴有点状渗血，创面大小约1cm²。在盲肠创面相对的右侧腹壁上同样用无菌干纱布摩擦其浆膜面直至损伤并剥离附有浅肌层的腹膜，创面大小约1cm²。将摩擦后的盲肠置于腹膜创面位置，使两者对和。未采取任何止血或者腹腔灌洗措施。在创面上分别应用0.2mL以下溶液后，双层缝合关腹。

20只小鼠随机分为2组：第一组为生理盐水对照组（10只），在关腹前将0.2mL的NS滴在两腹膜创面上，14天后处死小鼠，解剖观察粘连形成情况；第二组为水凝胶治疗组（10只），关腹前将0.2mL水凝胶（25wt%）均匀涂抹在盲肠和腹壁创面上，14天后处死小鼠，观察治疗效果。

术后14天，采用过量的戊巴比妥钠静脉注射处死动物，观察腹腔粘连情况。两位独立的观察者采用双盲法，用国际标准粘连评分方法进行粘连评分。0分：无粘连；1分：薄膜状粘附；2分：单根条索状粘连；3分：多根条索状粘连；4分：同时累及腹壁及内脏的致密粘连^[142-144]。每只小鼠的粘连程度以最高等级为准。将粘连组织，修复好的腹壁和修复好的盲肠组织取出，去除内容物清洗干净，用中性福尔马林液固定。

1.5毒性评价

为了观察水凝胶是否有毒性反应，在整个治疗周期内观察水凝胶治疗组小鼠，观察项目包括身体状态（包括活动，状态，毛色，粪便，行为等），体重变化，和死亡率。在处死小鼠后，进行尸检，对小鼠的主要脏器进行大体观察，并取标本，用中性福尔马林液固定。以下组织：心，肝，脾，肺，肾，胃，空肠，和结肠取出并用10%中性福尔马林液固定。然后进行标准步骤的梯度脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，封片，最后进行显微镜观察。

1.6水凝胶在小鼠模型中的组织粘附和降解行为

为观察水凝胶在小鼠腹腔粘连模型中的组织粘附和降解行为，建立上述小鼠腹壁-盲肠摩擦腹腔粘连模型。

40只小鼠在关腹前将200mL水凝胶（25wt%）均匀涂抹在盲肠和腹壁创面上，分别于第1,3，5，7，10和14天后处死小鼠，解剖观察水凝胶的织粘附和降解行为。

1.7包载Dox对治疗粘连效果的影响

为证实包载Dox是否会对水凝胶的防治粘连效果产生影响，建立上述小鼠腹壁-盲肠摩擦腹腔粘连模型。

10只小鼠在关腹前将200mL载Dox水凝胶（25wt%）均匀涂抹在盲肠和腹壁创面上，于术后第14天处死小鼠，解剖观察腹壁和盲肠的修复情况。将腹壁和盲肠组织取出，去除内容物清洗干净，用中性福尔马林液或者2.5%戊二醛溶液固定。

1.8术后肿瘤残留并腹腔损伤模型的建立和治疗

为模拟临床上肿瘤细胞减灭术后腹腔残存肿瘤并伴有术中腹腔损伤的情况，采用BALB/c小鼠建立术后肿瘤残留并腹腔损伤模型。每只小鼠腹腔接种200mL CT26细胞悬液，含细胞2×10⁵个。在接种7天后，肿瘤生长至直径约为2mm时进行开腹手术，直径大于2mm的肿瘤结节被取出，其他较小的肿瘤结节被保留下来，模拟肿瘤细胞减灭术后腹腔内残存肿瘤细胞的情况。接下来，寻找盲肠并用无菌干纱布摩擦其浆膜面直至损伤并伴有点状渗血，创面大小约1cm²。在盲肠创面相对的右侧腹壁上同样用无菌干纱布摩擦其浆膜面直至损伤并剥离附有浅肌层的腹膜，创面大小约1cm²。将摩擦后的盲肠置于腹膜创面位置，使两者对和，模拟在肿瘤细胞减灭术中无法避免的腹膜损伤。术中未采取任何止血或者腹腔灌洗措施。在创面上分别应用0.2mL以下药物后，双层缝合关腹。

40只小鼠随机分为4组，每组10只小鼠，各组小鼠分别在关腹前将0.2mL的以下药物均匀涂抹在盲肠和腹壁创面上（单次治疗）：：Dox水凝胶（含5mg/kg Dox，水凝胶浓度25wt%），游离Dox溶液（含5mg/kg Dox），空白水凝胶（浓度25wt%）和生理盐水。在接种肿瘤细胞21天后处死小鼠，统计各组肿瘤结节数目和重量。同时按照上述评分方法对腹腔粘连效果进行评分。

1.9组织病理学分析

取出受损的盲肠、腹壁及粘连的盲肠和腹壁，按标准程序用4％中性多聚甲醛固定并石蜡包埋、切片并进行HE染色。光学显微镜下观察。

1.10间皮层修复检测

取出受损的盲肠和腹壁，用2.5％戊二醛溶液固定后，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，并用扫描电镜以观察腹膜创面的间皮化情况。

1.11统计学方法

实验数据均用SPSS 15.0统计软件包处理，试验结果以均数加减标准差表示。计量数据采用Student’s T检测；各组之间的均数比较采用方差分析(ANOVA)。生存数据用Kaplan-Meier法计算，并采用Log-rank test进行统计学分析。粘连评分并不总是符合正态分布，因此中位粘连评分采用Mann-Whitney U-检验，粘连率的比较采用Fisher确切概率法。以P＜0.05为统计学显著性界限。

2结果

2.1载Dox水凝胶的制备与表征

如图1所示，制备出的Dox水凝胶为均一稳定的载药系统。当温度较低，低于临界凝胶温度时，Dox水凝胶体系是可自由流动、可注射的溶胶状态（图1-A，左），当温度升高到体温时，体系迅速转变为不可流动的凝胶状态（图1A，右）。图1-B为Dox水凝胶内部结构SEM图片，由图所示，Dox水凝胶内部为三维网状结构，网孔显圆形或椭圆形，且较均一。

图1-C和D为Dox水凝胶的温度敏感型和凝胶时间，通过流变测试。在低温时G’较小低于1Pa，并且G”大于G’，说明水凝胶处于可流动的溶胶状态。当温度升高至体温附近，G’急剧增大接近600Pa，且G’大于G”，说明此时体系处于不可流动的凝胶状态（图1-B）。在温度继续升高到42°C左右时，G’急剧减小，着意味着高温凝胶-溶胶转变。图1-D所示为Dox水凝胶在25℃和37°C时的凝胶时间，可以看出在25°C时，Dox水凝胶体系的凝胶时间小于50秒，而在37°C时，Dox凝胶时间小于20秒。以上实验可以说明，Dox水凝胶体系应用方便，可以通过注射应用于开腹手术或者腹腔镜手术，而且Dox水凝胶体系应用在体内时，可以迅速由溶胶状态转变为有一定凝胶强度的凝胶状态，迅速覆盖在创面上且可以保持较长的一段时间，不仅可以缓慢释放药物同时也可以作为阻隔剂防治粘连发生。

图3E为载Dox水凝胶体系的体外药物释放行结果。从图中可以看出，Dox可以在较长的时间内从水凝胶体系中缓慢释放出来。在第一小时和第一天，分别有6.15%和27.69%的Dox释放出来，在14天的释放周期内，有52%的Dox释放出来。

表1Dox水凝胶各对CRPC小鼠模型的治疗效果

组别	肿瘤结节数	肿瘤重量(克)	肿瘤治愈率(%)
				生理盐水	50.90±7.71	2.18±0.18	0
空白凝胶	51.50±6.87	2.14±0.22	0
				游离阿霉素	14.10±2.92	0.52±0.15	0
阿霉素凝胶	6.40±3.78**	0.24±0.12**	10

表2水凝胶和Dox水凝胶各对小鼠腹腔粘连模型的治疗效果

2.2Dox水凝胶对CRPC小鼠模型的治疗效果

在肿瘤生长抑制组，在接种后21天处死小鼠，对各治疗组小鼠的肿瘤结节进行数目和重量统计，结果示于表1和图2中。Dox水凝胶治疗组的肿瘤结节数目和重量比游离Dox治疗组（分别为P＜0.001和P＜0.001），空白水凝胶组（分别为P＜0.001和P＜0.001）和生理盐水组（分别为P＜0.001和P＜0.001）都有明显的降低。而且，Dox水凝胶组无肿瘤残留率也较其他组高。上述结果说明Dox水凝胶体系不仅可以抑制肿瘤转移，而且可以抑制肿瘤生长。Dox水凝胶治疗组的小鼠生存期比其他三组也有明显的延长。Dox水凝胶组，游离Dox组，空白水凝胶组和生理盐水组的平均中位生存期分别为34天，29天，24天和25天。

2.3水凝胶对小鼠腹腔粘连模型的治疗效果

20只小鼠用来建立腹膜-盲肠摩擦腹腔粘连模型（图3-A），水凝胶作为防粘连阻隔剂涂抹在受损组织上（图3-B）。两周后处死小鼠进行粘连评价，结果示于表2中。

水凝胶治疗组的粘连中位分数明显低于对照组（P＜0.001,Mann-Whitney U test），并且水凝胶在开腹观察时已经完全消失。所有对照组小鼠在盲肠与受损腹壁处都发生了4分粘连（图3-C），与此相比，没有一只水凝胶治疗组小鼠发生4分粘连（P＜0.001,Fisher’s exacttest）。水凝胶治疗组有7只小鼠（70%）未发生任何粘连（图3-D），而对照组则都发生了粘连（P＜0.001,Fisher’s exact test）。在治疗组还有两只小鼠发生2分粘连，分别为小肠与切口间，和未被摩擦的盲肠与小肠间。另一只发生了1分粘连，位于网膜与切口间。所有的三处粘连均发生在没有涂抹水凝胶处。

图4-A至C分别为为修复后的腹壁，修复后的盲肠和粘连组织的病理切片HE染色照片。可以看到，从治疗组取出的腹壁和盲肠组织未发生粘连，组织已经复原，在组织表面已经形成一层新生的间皮细胞，在间皮细胞下层形成了不同程度的纤维化组织。而在生理盐水对照组，可以看到，盲肠的平滑肌层和腹壁的骨骼肌层相互接近，两层之间由不同程度的纤维化组织相连接，并且其中有不同程度的炎性细胞浸润，两种组织已经完全融合。可见，生理盐水对照组的粘连形成较紧密，程度较重。

图4-D至F分别为水凝胶治疗组修复的腹壁表面，修复的盲肠表面和修复盲肠表面的高倍放大图片。从图中可以看出创面上生长出一层层伸长的扁平梭形间皮细胞。在高倍放大图片上可以清晰地看出这些梭形间皮细胞表面已经基本长满长绒毛。由以上结果得出，壁层腹膜和脏层腹膜都已经布满新生的间皮细胞，已经完全痊愈，以后没有在发生粘连的担忧。

2.4毒性评价

在水凝胶治疗组，小鼠无一死亡，并且没有毒性反应。与生理盐水组相比，水凝胶治疗组小鼠的行为，活动和皮毛均正常。在小鼠处死后，对其主要脏器进行大体观察和组织切片观察，未出现异常。水凝胶治疗组小鼠的新生间皮细胞并未出现任何异常。

2.5水凝胶体内组织粘附和降解行为

在进行水凝胶在小鼠腹腔粘连模型中的组织粘附和降解试验中没有出现粘连情况。在治疗组术后第一天，腹腔中的水凝胶由于与腹腔渗出液混合，显粉红色。这些粉红色水凝胶密实的贴附在脏层和壁层损伤面上，像一层固体的阻隔膜。腹腔内还存在少量的渗出液（图5A）。水凝胶逐渐在第3-5天从壁层损伤面上消失（图5-B，C），而脏层损伤面上的水凝胶则在第5-7天时逐渐消失（图5-C，D）。这些水凝胶由于肠蠕动和体内降解，逐渐变为粘稠润滑的液体。粘稠的润滑液体在术后第一天可以观察到（图5-A），在第三天时，液体的将略有增加（图5-B）。在其后逐渐吸收减少，并在术后第14天完全消失（图5-C，D，E和F）。伴随着创面上凝胶的降解和吸收，脏层和壁层创口逐渐愈合，并分别在第7天和第5天完全修复。在第14天时，脏层和壁层创口表面已经基本恢复到正常状态。

2.6包载Dox对水凝胶防治粘连的影响

为了证实包载Dox是否会对水凝胶的防粘连效果产生影响，我们建立了小鼠腹腔粘连模型，并应用Dox水凝胶进行治疗，其治疗结果示于表2中。与对照组相比，Dox水凝胶可以有效防止粘连发生（P＜0.001），而且Dox水凝胶组与空白水凝胶组的治疗效果相当（P＝0.765）。

在病理切片观察中，并未发现粘连组织，而且受损组织表面已经重新间皮化（图6-A和B）。SEM结果更加肯定了上述结果，在受损腹壁和盲肠创面上，新生了一层间皮细胞（图6-C和D），在新生间皮细胞表面满布细小的绒毛（图6-E和F）。

上述结果说明，包载Dox并不会对水凝胶的防治粘连效果产生影响，Dox水凝胶的防粘连效果与空白水凝胶相当。

3.7Dox水凝胶对肿瘤残留并腹腔粘连模型的治疗效果

如前所述，建立术后肿瘤残留并腹腔粘连模型，并进行治疗（图7-A至C），治疗结果示于表3和图7-D至G中。

表3Dox水凝胶同时提高腹腔化疗效果和预防术后腹腔粘连的治疗效果

在抗肿瘤效果评价中，Dox水凝胶组的平均肿瘤数目和质量都比游离Dox组（p<0.001和p<0.01），空白水凝胶组（p<0.001和p<0.001）和生理盐水组（p<0.001和p<0.001）明显下降。另外，Dox水凝胶组有30%的小鼠在尸检中未发现肿瘤残留。在防治粘连效果评价中，Dox水凝胶组的平均分数比生理盐水（p<0.001）和游离Dox组（p<0.001）明显降低，但是与空白水凝胶组的治疗效果无明显差异（p=0.654）。

从上述结果中得出，Dox水凝胶在小鼠术后肿瘤残留并腹腔粘连模型中可以同时提高术后腹腔化疗效果和防治术后粘连发生。

3讨论

腹膜由单层间皮细胞构成。正常情况下间皮细胞可以分泌具有润滑作用的氨基葡聚糖，可以减轻内脏摩擦及预防腹腔粘连。然而手术创伤几乎必然导致腹腔粘连。这是由于创伤启动了炎症反应，导致血管通透性改变及富含纤维蛋白的渗出物增加，早期形成疏松的纤维素样粘连。此种粘连可以被纤维蛋白溶酶级联反应所降解，但如果该级联反应地功能下降，成纤维母细胞入侵并产生胶原沉积，结果将导致不可逆的致密粘连发生[115,127,128]。腹腔粘连一般发生在术后的前期阶段，因此，在术中应用防粘连药物或器件成为防治术后粘连的首选方法。几十年来，科学家们为此一直进行着不懈的努力。科学家们针对粘连形成的发病机理进行了相关研究。并提出应用抗炎药物或者纤溶药物进行治疗，但是抗炎药物会妨碍伤口愈合，而纤溶药物则可能会有引起流血不止的风险。另外，药物在腹腔内的吸收代谢较快，这也妨碍了药物防治粘连的治疗效果[114-116]。专家们推荐使用防粘连阻隔剂在术后的前几天内将受损的创面分离开，以免形成粘连。防粘连阻隔剂可分为，聚合物粘稠溶液，固体膜和原位交联水凝胶[117-119]。这些阻隔剂被设计用来覆盖在受损组织表面，尽量避免受损组织的接触。对于聚合物溶液，其在体内的滞留时间较短，效果不理想[115]。对于固体膜，它不可能完全覆盖创面，而且对于出血的创面，膜的贴附性受到影响，并且由于肠蠕动膜可能会从创面脱落，所以有时需要将膜缝合于创面上，增加了操作难度[120,121]。而且在腹腔镜手术中，膜的应用极不方便。另外，固体膜的残留（超过30天）可能对创口愈合和人体有潜在危险。最近，许多基于透明质酸钠的原位交联水凝胶应用于防粘连研究中。但是这种水凝胶的凝胶时间过长（5至45分钟），并且有些需要进行紫外线照射而形成凝胶。还有，原位交联水凝胶的体内降解时间较长（超过7天），这就对间皮细胞的生长起到了负面作用。所以至今仍未找到一种理想的防粘连阻隔剂。

对于晚期直结肠癌、卵巢癌或者其他盆腹腔恶性肿瘤患者而言，我们寄希望于对患者施行肿瘤细胞减灭术，尽可能切除大块肿瘤组织，使残存肿瘤直径小于1cm，为手术后腹腔化疗创造有利条件。较之静脉化疗，腹腔化疗具有提高腹腔中药物浓度、延长药物在腹腔中的滞留时间以及减缓药物进入外周循环从而减轻药物毒副作用等优势。Ⅲ期临床实验表明：肿瘤细胞减灭术后，腹腔化疗对于腹腔残余癌灶的疗效优于传统的静脉给药途径。但肿瘤细胞减灭术所导致的广泛腹腔粘连，以及腹膜对诸如卡铂、顺铂等小分子抗癌药物的快速吸收机制，不仅影响药物在腹腔内的均匀分布，还降低了药物浓度并缩短了药物在腹腔内的滞留时间，进而削弱了腹腔给药的优势。对于肿瘤细胞减灭术后的残存癌灶而言，腹腔化疗的疗效不仅取决于药物的分布，也取决于药物对组织的渗透深度，而药物对组织渗透的深度又取决于药物浓度及药物在腹腔的滞留时间^[136,137]。而延长药物滞留时间的方法就只有增加腹腔的液体灌注量，或者腹腔置管滴注化疗。前者势必降低药物的浓度，而后者又带来诸多并发症，如局部护理、腹腔感染等。

因此，为在肿瘤细胞减灭术后既防治术后腹腔粘连、又同时提高腹腔化疗效果，我们提出一种全新的治疗方式，使用既具有药物缓释特性又具有防粘连效果的水凝胶体系。实验结果证明，载阿霉素水凝胶体系可以同时防止腹腔粘连和提高腹腔化疗效果。在实验中我们观察到，水凝胶可以粘附于受损脏层和壁层腹膜上，并逐渐降解，伴随着水凝胶的降解，出现了粘稠状润滑液体，此液体在14天内完全吸收。尽管粘稠状润滑液体的形成机理尚不完全清楚，但是我们注意到，在腹膜修复和重新间皮化过程中伴随着此润滑液体的发生，发展和消失，从而证明了水凝胶及其降解产物有良好的组织相容性。再有，实验显示，腹膜间皮细胞的修复需要5至7天的时间。而水凝胶也在基本一致的时间内从腹膜表面消失，这既可以在粘连形成关键的前期防止其发生，又可以在起效后，于适当的时间消失，从而不影响间皮细胞的修复过程。众所周知，当新生间皮细胞层完全覆盖腹膜创面后，粘连就不会发生。因此水凝胶的粘附和降解时间与粘连防治的关键时期和间皮细胞修复的时期相吻合，是一种理想的防粘连阻隔剂。

此外，虽然包载了细胞毒性化疗药物，化疗药物既可以杀伤肿瘤细胞又可以杀伤正常细胞，但是载药水凝胶体系也表现出很好的粘连防治效果。其原因可能如下：在正常环境下，腹膜间皮细胞修复与腹腔内游离间皮细胞在腹膜创面的贴附，激活和增殖有关。在阿霉素水凝胶用后的初期，由于腹腔中高浓度的阿霉素，腹膜创面的间皮化被抑制。同时，局部高浓度的阿霉素也会向创面深部渗透，抑制纤维母细胞的活性。接下来，随着水凝胶的降解和阿霉素的吸收，腹腔中阿霉素的浓度逐渐降低，腹膜创面开始间皮化过程。

4结论

(1)本发明制备了载Dox水凝胶体系，通过扫描电镜检测了其内部机构，证明其内部为三维网状结构；通过流变法检测了Dox水凝胶的温度敏感性和凝胶时间，证明Dox水凝胶有良好的温度敏感性和较短的凝胶时间；通过体外药物释放行为研究，证明Dox水凝胶有良好的药物缓释性能。

(2)建立了小鼠CRPC模型，并采用Dox水凝胶进行治疗。结果发现，Dox水凝胶不仅可以抑制肿瘤转移，也可以抑制肿瘤生长。Dox水凝胶治疗组小鼠的生存期明显延长。

(3)建立了小鼠腹壁-盲肠摩擦腹腔粘连模型，并考察了水凝胶防治粘连的效果。结果发现水凝胶防治粘连的效果很好。

(4)通过小鼠模型的盲肠和腹壁受损组织的HE染色发现，在水凝胶治疗组，14天后，创面已经完全愈合不会再发生粘连现象。

(5)通过小鼠模型的盲肠和腹壁受损组织的扫描电镜观察发现，在水凝胶治疗组，14天后，创面已经覆盖着一层新生间皮细胞，创口已经完全愈合不会再发生粘连现象。

(6)观察了水凝胶治疗组创伤组织的愈合过程与水凝胶组织附着和降解过程。发现脏层腹膜和壁层腹膜分别在术后第3-5天和5-7天完全愈合。水凝胶可以附着于受损组织表面，并随着创面愈合在合适的时间逐渐被机体吸收。

(7)研究了包载Dox对水凝胶防治粘连效果的影响。结果发现，包载Dox对水凝胶防治粘连效果没有影响，Dox水凝胶的防治粘连效果很好。

(8)建立了术后肿瘤残余并腹腔粘连模型，并进行治疗效果评价。结果发现Dox水凝胶在小鼠术后肿瘤残留并腹腔粘连模型中可以同时提高术后腹腔化疗效果和防治术后粘连发生。

Claims

1.包载化疗药物的聚合物水凝胶，其特征在于：所述聚合物水凝胶为PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物或PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物溶于水中制成的凝胶。

2.根据权利要求1所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述PCL-PEG-PCL共聚物分子量为2000～8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.5～2.5。

3.根据权利要求2所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物为C₇₀₀–E₁₀₀₀–C₇₀₀、C₁₀₀₀-E₁₀₀₀-C₁₀₀₀、C₁₀₀₀-E₁₅₀₀-C₁₀₀₀、C₁₅₀₀-E₂₀₀₀-C₁₅₀₀、C₁₅₀₀-E₁₅₀₀-C₁₅₀₀及C₂₀₀₀-E₂₀₀₀-C₂₀₀₀；其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。

4.根据权利要求1所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的浓度为5-35wt%。

5.根据权利要求1所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500～8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.5～2.5。

6.根据权利要求6所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述的PEG-PCL-PEG共聚物为E₅₅₀–C₂₀₀₀–E₅₅₀、E₅₅₀–C₂₂₀₀–E₅₅₀、E₅₅₀-C₂₅₀₀-E₅₅₀、E₇₅₀-C₂₅₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₃₀₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₃₅₀₀-E₇₅₀或E₁₅₀₀-C₃₀₀₀-E₁₅₀₀；其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。

7.根据权利要求6所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述共聚物的浓度为15～40wt%。

8.根据权利要求1-7所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述的水为生理盐水。

9.根据权利要求1～9任一项所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述的化疗药物为紫杉醇、顺铂、阿霉素或多烯紫杉醇中的至少一种。

10.根据权利要求1～9任一项所述的聚合物水凝胶，其特征在于：所述的化疗药物的浓度为0.1-100mg/mL。

11.制备权利要求1～10任一项所述的聚合物水凝胶的方法，其特征在于包括下述步骤：将PEG-PCL-PEG共聚物或PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物40～60°C下溶于水中，自组装形成胶束，并降温至0～4°C使体系处于溶胶状态，得到空白水凝胶，空白水凝胶在0～4°C下搅拌，加入PBS溶液混合均匀，然后加入化疗药物溶液，继续搅拌，形成载化疗药物水凝胶体系。

12.制备权利要求1～10任一项所述的聚合物水凝胶的方法，其特征在于包括下述步骤：

首先，将PEG-PCL-PEG共聚物或PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物在温度40～60°C下溶于水中，自主装形成胶束，并降温至0～4°C使体系处于溶胶状态，得到空白水凝胶；边搅拌，边加入PBS溶液，然后加入盐酸阿霉素溶液，继续搅拌10--30min，形成载Dox水凝胶体系，最终水凝胶的浓度为15-35wt%，Dox的最终浓度范围0.1-20mg/mL。

13.权利要求1～10任一项所述的聚合物水凝胶在制备能预防肿瘤复发和防治术后腹腔粘连的医疗器械和/或药物中的用途。