KR20080013224A

KR20080013224A - 생분해성 나노섬유 복합체와 그의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20080013224A
Application number: KR1020060074428A
Authority: KR
Inventors: 유혁상; 최지숙
Original assignee: (주)나노필; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2006-08-07
Filing date: 2006-08-07
Publication date: 2008-02-13

Abstract

본 발명은 생분해성 나노섬유 복합체와 그의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생분해성 고분자인 폴리카프로락톤(Poly(ε-caprolactone, PCL)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민 Poly(ε-caprolactone)-Poly(ethylen-glycol)(PCL-PEG-NH₂)의 블락 공중합체를 혼합한 후 전기방사법으로 방사함으로써, 나노섬유의 친수성 정도를 조절할 수 있고, 나노섬유를 구성하는 폴리에틸렌글리콜이 수상으로 뻗어 나오면서 이의 말단에 결합된 아민기가 노출되어 생체적합성 성장인자와의 화학적 결합이 가능하므로 나노섬유로부터 성장인자의 방출속도를 저하시킬 수 있어 장기간 사용이 가능하고, 이를 드레싱재에 적용할 경우 손상된 세포의 성장을 촉진시키는 효과를 기대할 수 있는 생분해성 나노섬유 복합체와 그의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

폴리카프로락톤, 생분해성, 나노섬유, 성장인자, 드레싱재

Description

생분해성 나노섬유 복합체와 그의 제조방법 및 이의 용도{Fabrication of growth factor conjugated electrospinned nanofibers for wound healing}

도 1은 본 발명의 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법을 간단하게 나타낸 그림이다.

도 2는 전기방사기 일구현예를 나타낸 간략도이다.

도 3은 실시예 1에 의하여 제조된 폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비를 달리한 나노섬유의 전자현미경 사진이며, 이들의 혼합비는 (a)100/0, (b) 95/5, (c) 90/10 및 (d) 80/20 이다.

도 4는 실시예 1에 의하여 제조된 생분해성 나노섬유의 평균직경을 나타낸 그래프이다.

도 5는 실시예 1에 의하여 제조된 생분해성 나노섬유의 표면에 노출된 아민기의 함량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 실시예 2에 의하여 제조된 생분해성 나노섬유 복합체[폴리카프로락톤 : 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체. (a)95/5, (b) 90/10 및 (d) 80/20 이다.]와 비교예 1에 의하여 제조된 고분자 용액과 FITC-BSA의 혼합비율 . d)95/5, (e)90/10 및 (f)80/20]의 전자현미경 사진이다.

도 7은 실시예 2에 의하여 제조된 생분해성 나노섬유 복합체[폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비, (a)95/5, (b) 90/10 및 (d) 80/20 이다.]와 비교예 1에 의하여 제조된 나노섬유와 FITC-BSA의 혼합물[(d)95/5, (e)90/10 및 (f)80/20]의 성장인자의 방출율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 생분해성 나노섬유 복합체와 그의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

나노섬유는 넓은 표면적과 높은 다공도를 가지고 있다[S. R. Bhattarai et al., Biomaterials 25 (2004) 2595-2602]. 나노섬유는 그 직경이 작을수록 부피 대비 면적 비율이 상당히 넓다. 넓은 표면적은 습윤상태를 충분히 조성할 뿐만 아니라 그 구조는 세포외기질의 구조와 유사한 삼차원적인 구조를 가지고 있기 때문에 세포가 붙어서 성장하기에 충분한 면적을 공급해주어 상처부의의 세포재생에 효과적이다[W. J. Li et al., Biomaterials 26 (2005) 599-609].

또한, 굴곡진 상처에도 완전한 밀착이 가능하다. 나노섬유의 높은 다공도는 산소의 공급을 원활히 하기 때문에 상처 치유의 효과를 상승시킬 수 있다[S. Litster et al., J. Power Sources Available online 22 July 2005].

또한, 나노섬유의 기공(pore)의 크기는 수㎚ 내지 수㎛까지 조절이 가능하 며, 상기한 기공의 크기는 ㎛ 크기인 세균의 침투를 차단하는데 효과적이다[W. J. Li et al., Biomaterials 26 (2005) 599-609].

한편, 나노섬유를 제조하는 방법에는 자기결합방법(self-assembly), 상분리방법(phase separation), 그리고 전기방사법(electrospninning)이 있다[L.A. Smith et al., Colloids and surfaces B: Biointerfaces 39 (2004) 125-131].

상기 자기결합의 방법은 단백질의 자기결합하는 성질을 이용한 것으로 반응을 증진시키기 위해서 pH, 온도, 2가 양이온의 첨가 등의 방법을 사용한다. 이렇게 얻은 나노섬유는 1차원의 형태를 가지고 있다. 상분리방법을 통해서 얻은 나노섬유는 거대기공(macropore)들과 3차원의 형태를 가지고 있다.

상기와 같은 방법으로 제조되는 나노섬유는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 나노섬유가 사용 가능한 분야인 상처치유를 위한 드레싱제 분야에서의 종래 기술을 살펴보면, 기존의 상처 치유를 위한 드레싱 제는 산소 공급의 문제, 드레싱 제의 교체 시에 발생 되는 감염 등의 문제점들이 있는데 이는 더딘 상처 치유와 제 2차 감염을 야기시키는 문제점을 나타낸다.

또한 물리적으로 성장인자를 결합시켰을 경우, 초기의 상처 치유는 빠른 듯 보이나 초기 방출양이 결합된 성장인자의 대부분이기 때문에 지속적인 효과를 기대하기 어렵다.

이에 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노 력한 결과, 폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체를 전기방사법으로 방사하여 제조된 생분해성 나노섬유가 활성화되어 아민기가 노출되며, 상기 아민기와 결합가능한 생체적합성 성장인자를 부여할 경우 이들이 화학적으로 결합하므로 성장인자의 방출속도가 감소됨을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 생체적합성 성장인자와 화학적 결합이 가능한 생분해성 나노섬유를 제조하는 방법과, 이렇게 제조된 생분해성 나노섬유와 생체적합성 성장인자가 화학적으로 결합된 생분해성 나노섬유 복합체 및 이를 적용한 용도를 제공하는데 그 목적이 있다

본 발명은 말단에 아민기가 존재하는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블락 공중합체(PEG-PCL-PEG diblock copolymer)를 포함하는 생분해성 수지가, 상기 아민기와 결합 가능한 작용기를 가지는 생체적합성 활성성분과 화학적으로 결합되어 이루어진 생분해성 나노섬유 복합체를 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기한 생분해성 나노섬유 복합체로 이루어진 생분해성 드레싱재를 포함한다.

또한, 본 발명은 폴리카프로락톤(Poly(ε-caprolactone)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체의 혼합물을 전기방사하여 생분해성 나노섬유를 제조하는 과정과, 상기 생분해성 나노섬유에 생체적합성 활성성분을 부가하 는 과정을 포함하여 이루어지는 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법을 포함한다.

본 발명은 생분해성 고분자인 폴리카프로락톤(Poly(ε-caprolactone, PCL)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민 Poly(ε-caprolactone)-Poly(ethylen-glycol)(PCL-PEG-NH₂)의 블락 공중합체의 혼합물을 전기방사하여 생분해성 나노섬유를 제조함으로써 친수성 정도를 조절할 수 있고, 나노섬유를 구성하는 폴리에틸렌글리콜이 수상으로 뻗어 나오면서 이의 말단에 결합된 아민기가 노출되어 생체적합성 성장인자와의 화학적 결합이 가능하므로 나노섬유 복합체로부터 성장인자의 방출속도를 저하시킬 수 있어 장기간 사용이 가능하고, 이를 드레싱재에 적용할 경우 손상된 세포의 성장을 촉진시키는 효과를 기대할 수 있는 생분해성 나노섬유 복합체와 그의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 생분해성 나노섬유 복합체를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 생분해성 나노섬유 복합체는 도 1에 제시된 바와 같이 폴리카프로락톤(Poly(ε-caprolactone)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체의 혼합물을 전기방사함으로써 나노섬유를 구성하는 폴리에틸렌글리콜이 수상으로 뻗어 나오면서 이의 말단에 결합된 아민기가 노출되어 생체적합성 성장인자와의 화학적 결합이 가능하다. 또한 나노섬유를 구성하는 친수성 폴리에틸렌글리콜에 의하여 나노섬유의 친수성 정도를 조절할 수 있으므로 아민기의 노출이 더욱 용이해진다.

즉, 폴리카프로락톤(PCL)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜(PEG)-아민의 블락 공중합체를 사용하여 PCL-PEG-(amine) 블락 공중합체로 이루어진 나노섬유의 말단에 활성기인 아민기가 존재하게 된다. 소수성인 PCL과 친수성인 PEG가 결합된 블락 공중합체를 용융시켜 제조한 나노섬유는 습윤상태에서 친수성인 PEG가 밖으로 노출되고, PEG에 결합된 반응성 활성기인 아민기 역시 밖으로 노출된다.

상기 노출된 아민기는 형광분석법(fluorescamine assay)를 통하여 측정할 수있으며, 본 발명은 이렇게 노출된 아민기와 화학적으로 결합가능한 생체적합성 성장인자를 혼합하여 생분해성 나노섬유 복합체를 제조한 것이다.

상기 나노섬유를 구성하는 폴리카프로락톤(PCL)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜(PEG)-아민의 블락 공중합체를 99.9 : 0.1 ~ 0.1 : 99.9 중량비 범위로 혼합하여 사용할 수 있으며, 이때 폴리카프로락톤의 함량이 상기 범위 미만으로 적으면 상대적으로 유리전이온도가 낮은 폴리에틸렌 글리콜의 함량이 높아지므로 낮은 유리전이 온도에 의해 나노섬유가 방사되어 나올 때 섬유들끼리 회합하여 섬유의 굵기가 굵어지는 경향이 있고, 폴리카프로락톤의 함량이 상기 범위를 초과하여 많으면 공중합체를 혼합했을 때에 비해 점성이 크기 때문에 섬유의 굵기가 굵어지는 경향이 있으므로, 이들의 혼합비는 상기 범위로 조절하는 것이 바람직하다.

또한 상기 나노섬유는 직경이 10 ~ 1000 nm 범위인 것이 세포의 효과적인 성장을 위한 삼차원적인 구조를 형성하는 측면에서 좋은데, 나노섬유의 직경이 상기 범위 미만으로 적으면 나노섬유의 제조가 힘들고, 상기 범위를 초과하여 크면 세포가 자라기에 적합한 표면적의 형태가 되지 못하고 충분한 표면적이 되지 못한다.

또한 나노섬유는 기공(pore) 크기가 10 ~ 1000 nm 범위인 것이 산소와 영양소의 공급과 세균의 침투를 차단하는 측면에서 좋으며, 나노섬유의 기공의 크기가 상기 범위 미만으로 적으면 산소와 영양소의 공급이 원활하지 못하고, 상기 범위를 초과하여 크면 세균이 침투하기에 충분한 크기가 되기 때문에 감염의 우려가 있다.

상기 아민기가 결합가능한 작용기는 카르복시기를 포함하는 것을 사용할 수 있으며, 또한, 단백질뿐만 아니라 아민기와 반응할 수 있는 반응기를 가진 약물 역시 나노섬유의 아민기와 화학적으로 결합이 가능하다.

카르복시기를 가지는 생체적합성 활성성분으로서 당단백질이 대표적이다. 이러한 당단백질은 구체적으로 혈청알부민, 글루코사민 및 갑상선 호르몬 등의 각종 호르몬 등을 예로 들 수 있다.

또한 상기 생체적합성 활성성분은 상처치유를 돕는 성장인자들로서 구체적으로 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

상기 상피세포성장인자는 상피세포의 증식을 촉진하는 것과 더불어 상피각질화를 촉진하는 성장인자이다. 또한, 상피세포성장인자는 비상피계 세포인 섬유아세포, 혈관 평활근세포, 간세포의 증식도 촉진하며, 세포특이성과 종특이성이 낮고, 여러 가지 기능을 가지고 있다. 섬유아세포성장인자는 혈관내피세포, 섬유아세포, 수초세포, 연골세포 등의 다양한 세포증식을 촉진시키며, 또한 신경, 근원 세포, 혈관계 세포에 대해서는 분화를 유도한다[이영무, 조직공학 (83~84): 한양대학교 출판부].

상기 폴리카프로락톤(PCL)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜(PEG)-아민의 블락 공중합체로 이루어진 나노섬유와 생체적합성 활성성분은 99.999 ~ 0.001 : 90 ~ 10 중량비 범위로 이루어지는 것을 사용하는 것이 생리활성증가의 측면에서 좋으며, 이때 나노섬유의 함량이 상기 범위 미만으로 적으면 세포의 성장율에 영향을 미치지 않는 경향이 나타나고, 나노섬유의 함량이 상기 범위를 초과하여 과량이면 세포가 이상성장을 하는 경향이 나타난다.

이러한 본 발명의 나노섬유 복합체는 나노섬유와 생체적합성 성장인자가 화학적으로 결합되어 성장인자가 지속적으로 서서히 방출되므로 이를 상처치유용 드레싱재로 적용할 경우 상처 부위의 세포의 성장을 지속적으로 자극하여 상처의 치유를 촉진할 수 있다.

또한, 성장인자가 결합되어 있기 때문에 세포의 재생을 촉진시켜 상처의 치유 속도가 빨라진다.

특히 당뇨병으로 인한 족부 궤양과 심한 화상 환자들은 스스로 치유되는 속도가 느리기 때문에 성장인자가 결합된 나노섬유를 사용하게 된다면 상처 치유를 위한 최적의 환경을 조성하고 상처의 치유 속도 역시 빨라진다.

당뇨병의 증가로 인해서 족부궤양으로 고생하는 환자들도 많이 늘어났다. 이런 환자들에게 성장인자가 결합된 나노섬유를 이용한 상처 치유는 큰 효과를 나타낼 것으로 생각된다.

또한, 동맥경화로 인한 폐색혈관 확장 시술 시 생긴 혈관 상처 치료용 등으로 사용이 가능하므로 제약회사에서 사용이 가능하다.

이러한 본 발명의 생분해성 나노섬유 복합체를 제조하는 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

즉, 폴리카프로락톤(Poly(ε-caprolactone))과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체의 혼합물을 전기방사하여 아민기가 노출된 생분해성 나노섬유를 제조하고, 여기에 상기 아민기와 화학적으로 결합가능한 작용기를 가지는 생체적합성 활성성분을 혼합함으로써 생분해성 나노섬유 복합체를 얻을 수 있다.

상기 폴리카프로락톤(PCL)과, 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체는 99.9 ~ 0.1 : 0.1 ~ 99.9 중량비로 혼합하는데, 이는 상기에서 설명한 이유에 기인한다. 또한, 제조방법적 측면에서도 상기한 비율을 유지하는 것이 바람직하다.

상기 폴리카프로락톤과, 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체 혼합물을 유기용제에 1 ~ 30 중량% 농도로 용해시키는데, 농도가 너무 낮으면 섬유의 형태를 이루지 못하고 구슬모양이 있는 일정하지 못한 섬유를 얻거나 방사가 되지 않는 경향이 있고, 너무 높으면 용액의 점성이 너무 크기 때문에 섬유의 굵기가 굵어지거나 방사가 되지 않는 경향이 있기 때문이다.

상기 유기용제는 탄소수 1 ~ 5 범위의 탄화수소계 유기용제를 선택하여 단독 또는 2종이상을 혼합사용할 수 있으며, 바람직하기로는 클로로포름과 메탄올을 혼합사용하는 것이 좋다.

나노섬유를 제조하는 방법 중에서 비교적 쉬운 방법은 전기방사법이다.

전기방사법으로 제조된 나노섬유는 3차원 형태는 물론 많은 기공(pore)들을 가지고 있다. 이 기공들은 ㎛~㎚크기까지 조절이 가능하다. 또한, 나노섬유를 제조할 때, 변수들을 적절히 조절하면 원하는 크기의 섬유를 얻을 수 있다.

전기방사법은 용액(solution)에 고전압을 연결하여 전기방사기의 니들(needle)의 끝에서 용액이 표면장력을 이기고 분사되는 방법을 통해서 나노섬유를 얻게 되는 방법이다.

이때 많은 변수들에 의해서 나노섬유의 굵기와 모양에 많은 영향을 받게 되므로, 용액의 농도, 용제의 종류, 전압, 니들의 굵기, 니들의 끝부터 그라운드(ground)까지의 거리, 유속(flow rate), 온도, 습도 등이 그 변수들이다. 이 변수들을 적절히 조절하면 원하는 굵기의 나노섬유를 얻을 수 있고, 원하는 기공(pore)의 크기를 얻을 수도 있다.

본 발명에서는 상기 전기방사 시 전기방사기의 니들과 그라운드 사이의 거리가 5 ~ 30 cm 범위, 전압 0.1 ~ 30 kV 범위, 유속 0.01 ~ 100 ml/h 범위로 조절되어 이루어지는 것이 섬유의 직경이 작고 모양이 일정하며 구슬형태를 포함하는 섬유를 얻지 않을 수 있기 때문에 좋다.

그리고, 상기 아민기가 부여된 생분해성 나노섬유와 상기 아민기와 화학적으로 결합가능한 작용기를 가지는 생체적합성 활성성분을 혼합하는 과정을 포함하여 생분해성 나노섬유 복합체를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참고예 1

본 발명의 실시예에서 사용된 성분은 다음과 같다. 즉, 카프로락톤(ε-caprolactone, Mw 114.14), 폴리카프로락톤[poly(ε-caprolactone), Mw 65000]은 알드리치사(Aldrich, [St. Louis, Mo])에서 구입하였다. PEG-(amine)₂(Mw 3400)는 SunBio(Korea)에서 구입하였다. 형광아민(Fluorescamine)은 시그마사(Sigma, (St. Louis, Mo))에서 구입하였다. Oregon green^®488 phalloidin은 Invitrogen(Eugene, Oregon, USA)에서 구입하였다. Fluorescein5(6)-isothiocyanate(FITC)와 송아지 혈청 알부민(Albumin bovine serum, BSA)는 시그마사(Sigma, [St. Louis, Mo])에서 구입하였다

참고예 2

폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜 블록 공중합체(PCL-PEG diblock copolymer)는 다음의 방법으로 제조하였다. 즉, 미리 합성해 놓은 PCL(Mw 65000)을 활성화시켰다. 3g PCL을 30ml 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹였다. 그 후 0℃에서 계속 교반을 해주면서 15mg 피리딘(pyridine)과 19mg p-니트로페닐 클로로포르메이트(ρ-nitrophenyl chloroformate)를 첨가시켜 주었다(PCL, ρ-nitrophenyl chloroformate 그리고 pyridine의 몰 비는 1:2:4이다.) 상온에서 3시간 동안 더 반응을 시켜주었다. 침전 시키기 전에 유기용제(solvent)를 2/3 가량 날려주고, 반응이 끝난 PCL을 iced-diethyle ether에 침전 시키고 진공상태에서 하루밤(overnight)동안 건조시켰다. 상기 침전 반응은 한번 반복 해주었다.

0.595g PEG 과 2.29g 활성화된 PCL를 각각 디클로로메탄(dichloromethane)에 녹인다(PEG와 PCL의 몰비는 5:1이다.). PEG용액에 PCL용액을 천천히 떨어뜨려준다. 이때, 교반기(stirrer)를 빠르게 돌려서 균일하고 전체적으로 섞이게 해주었다. 상온에서 24시간 동안 반응을 시켜준 후, iced-ethanol에 침전시켜준다. 침전된 PCL-PEG는 40℃, 진공 상태에서 건조시켜주었다. 이렇게 합성한 고분자는 밀폐시켜 냉장 보관하였다. PCL-PEG diblock copolymer의 합성된 것은 400Hz NMR을 사용하여 확인하였다.

실시예 1

본 실시예는 생분해성 나노섬유를 구성하는 폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비에 따른 활성기의 존재 및 표면에 노출된 정도를 확인하기 위하여 수행되었다.

폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비를 100/0, 95/5, 90/10 및 80/20 중량비로 혼합하고, 이를 클로로포름과 메탄올 3:1(v/v)의 혼합용제에 농도가 20 %(w/v)가 되도록 녹여서 섬유제조용 용액을 제조하였다.

전기 방사법에 의한 나노섬유의 제조시 전체적인 모식은 J. Venugopal et al [J. Venugopal et al. In vitro study of smooth muscle cells on polycaprolactone and collagen nanofibrous matrices. Cell Biology International 29 (2005) 861-867]의 방법에 따랐다.

PCL(Mw 42500)과 PCL-PEG는 메탄올:클로로포름(1:3)에 녹여 주었다. 총 고분자 용액의 농도는 20~15 중량%로 해주었고, PCL과 PCL-PEG의 혼합비는 0, 5, 10 그리고 20 중량%로 변화를 주었다. 이 용액을 27G 니들이 연결되어있는 유기용매용 일회용 주사기에 2ml씩 넣어준 후, 1ml/h의 속력으로 알루미늄 호일에 방사했다. 이때, 전압은 15kV이고, 그라운드와 니들의 거리는 15cm이다[도 2 참조].

제조된 나노섬유의 형태(morphology)는 FE-SEM(S-4300, HITACHI)을 통해서 확인하였고, 나노섬유의 직경(diameter)은 영상분석(image analysis)을 통해서 측정하였다[도 3].

도 3에 의하면 혼합비율이 95/5와 90/10인 경우 약 300nm의 굵기를 갖고 비교적 일정한 모양의 나노섬유를 얻은 것을 확인할 수 있으며, 혼합비율 80/20 중량비인 경우 나노섬유의 굵기가 굵어지는데, 이는 폴리에틸렌글리콜에 의해 낮아진 유리전이온도(Tg) 때문에 나노섬유가 방사됨과 동시에 결정을 이루지 못하고 주위의 섬유들끼리 결합되기 때문이다.

상기 제조된 생분해성 나노섬유의 평균직경은 다음 도 4에 나타낸 바와 같다.

또한, 상기 제조된 생분해성 나노섬유 표면에 노출된 활성기(아민기, amine group)를 형광분석법(fluorescamine assay)에 의하여 나노섬유의 중량당 아민기의 몰을 계산하여 그 몰수의 두배가 되는 몰로 형광아민(fluorescamine)양을 PBS에 젖어있는 나노섬유에 첨가시켜 주었다. 15분 동안 반응을 시킨 후에 반응되지 않은 형광아민(fluorescamine)을 제거한 후 형광아민(fluorescamine)이 결합된 나노섬유를 녹여서 결합되어있는 형광아민(fluorescamine)을 정량하여 나노섬유에 노출된 아민기의 몰을 정량하였으며, 그 결과를 다음 도 5에 나타내었다.

도 5에 의하면 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비율이 증가할수록 나노섬유의 아민기가 수상으로 많이 뻗어 나오는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2

본 실시예는 폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비를 달리하여 제조한 생분해성 나노섬유와 생체적합성 성장인자의 화학적 결합유무를 확인하고, 기간에 따른 성장인자의 방출율을 비교하기 위하여 수행된 것이다.

상기 실시예 1에 제조된 것으로 폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비가 95/5(a), 90/10(b) 및 80/20(c) 중량비로 혼합된 생분해성 나노섬유에, BSA-FITC(bovin serum albumine-fluorescein isothiocyanate)를 형광분석법(fluorescamine assay)을 통해서 알아 본 아민 기(amine groups)의 몰수에 2배가 되는 몰수로 첨가시켜 EDAC와 HOBt로 BSA의 카르복실기를 활성화 시킨 후에 나노섬유와 상온에서 6시간 동안 접촉시킴으로써 화학적으로 결합시켜 생분해성 나노섬유 복합체를 제조하였다.

비교예 1

생분해성 고분자인 폴리카프로락톤과 상기 실시예 2에서 사용한 것과 동일한 FITC-BSA 를 95/5, 90/10 및 80/20의 중량비로 단순 혼합한 용액을 방사하여 얻은 나노섬유의 FITC-BSA의 방출거동을 관찰하였다.

실험예 1 : 나노섬유와 화학적으로 결합된 FITC - BSA 의 방출측정

아민기(Amine groups)와 결합된 단백질의 방출 정도를 알아보기 위하여 FITC-BSA를 사용하였다. 먼저 BSA에 FITC를 결합시켰다. 2mg/ml의 BSA와 0.1M 소듐 카보네이트(sodium carbonate) 52.9mg을 둥근바닥플라스크에 넣고 pH를 9로 맞춰주었다. 1mg FITC를 1ml DMSO에 녹인 FITC 스톡 솔루션(stock solution) 500㎕를 BSA에 첨가시키고 4℃의 어두운 곳에서 교반을 해주면서 하루밤동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 결합되지 않은 FITC를 제거해주기 위해서 PBS에서 3번 투석(dialysis)해주었다. FITC-BSA 용액은 동결건조해주었다.

나노섬유에 FITC-BSA를 결합(conjugation)시켜주기 위해서 먼저 FITC-BSA를 활성화(activation)시켰다. PCL-PEG의 혼합비(5, 10, 20 중량%)에 따라 각각 다른 양의 FITC-BSA와 활성기(activator)를 넣어주었다. FITC-BSA를 0.96mg, 1.5mg, 2.88mg을 각각 무게를 재서 5ml의 PBS에 녹여주었다. 각각의 FITC-BSA 용액에 FITC-BSA의 mol에 두 배가 되도록 EDAC와 HOBt를 넣어주었다. EDAC는 각각 5.2mg, 8.4mg, 16mg을 넣어주었고, HOBt는 각각 3.8mg, 5.9mg, 11mg을 넣어주었다. RT에서 살살 녹여준 후에 미리 에탄올로 적셔놓은 2mg의 나노섬유에 1ml씩 분주해주었다. 이때, 나노섬유에 넣어주는 FITC-BSA는 PCL-PEG의 혼합비에 맞게 준비해 놓은 것을 각각의 혼합비로 방사해서 얻은 나노섬유에 분주해 주었다. 나노섬유의 아민기(amine groups)와 FITC-BSA가 충분히 반응할 수 있도록 RT에서 6h 동안 천천히 교반(gentle stirring)시켰다.

반응이 끝난 후, PBS를 사용하여 3번 세척 해주면서 결합되지 않은 FITC-BSA를 제거해 준다. 이렇게 결합이 끝난 나노섬유는 12-wells culture plate에 1ml PBS와 함께 넣어 37?, 교반 배양기(shaking incubator)에서 3, 5, 7일 동안 방출 되어 나오는 FITC-BSA의 양을 형광 스펙트로포토메터(Fluorescence Spectrophotometer, F-2500, HITACHI, Japan)를 통해서 정량하였고, 공촛점전자현미경 (confocal laser scanning microscopy, FLUOVIEW - FV300, OLYMPUS, JAPAN)를 통해서 결합된 FITC-BSA를 확인하였다.

실험예 2 : 나노섬유와 물리적으로 혼합된 FITC - BSA 의 방출측정

상기 실험예 1의 나노섬유와 FITC-BSA가 화학적으로 결합된 나노섬유 복합체와는 달리, 나노섬유와 FITC-BSA가 물리적으로 혼합되어있는 경우의 방출 정도를 관찰하기 위하여 PCL에 FITC-BSA를 섞어서 방사하였다. 이때 전체 용액의 농도 는 20 중량%였다.

PCL과 FITC-BSA의 혼합비를 5, 10, 20 중량%로 만들기 위해서 각각 PCL은 48.8mg, 48.125mg, 46.4mg을 넣어주었고, FITC-BSA는 1.2mg, 1.875mg, 3.6mg을 넣어주었다. PCL/FITC-BSA 나노섬유는 1x1 cm²의 크기로 잘라서 1ml PBS와 함께 12-wells culture plate에 넣어 37?, 교반 배양기(shaking incubator)에서 1, 3, 5, 7일 동안 방출 되어 나오는 FITC-BSA의 양을 형광 스펙트로포토메터(Fluorescence Spectrophotometer, F-2500, HITACHI, Japan)를 통해서 정량하였고, 공촛점전자현미경(FLUOVIEW - FV300, OLYMPUS, JAPAN)를 통해서 결합된 FITC-BSA를 확인하였다.

즉 상기한 방법으로 실시예 2에 의하여 제조된 본 발명의 생분해성 나노섬유 복합체와 비교예 1에서 얻은 나노섬유를 비교대상으로 하여 생체와 유사한 조건에서 FITC-BSA가 방출되는 거동을 관찰하였다. 생체와 유사한 조건을 만들어 주기 위해서 pH 7.4인 PBS에 이들을 담그고 37℃ shaking incubator에서 7일 동안 관찰하였다. 제조 직후와 제조후 7일째의 공촛점전자현미경(confocal laser scanning microscope)사진을 도 6에 나타내었으며, 이들의 시간의 경과에 따른 BSA-FITC의 방출율을 형광분광계를 통해서 형광의 크기를 측정한 후 FITC-BSA의 농도별 standard를 얻어서 나노섬유에서 방출된 FITC-BSA의 방출율을 계산하여 그 결과를 도 8으로 나타내었다.

도 6에 의하면 실시예 2에 의하여 제조된 나노섬유 복합체는 나노섬유(a, b, c)의 전체에 BSA-FITC가 고루 결합되어있는 것을 확인 할 수 있다. 반면에 비교예 1에 의하여 단순히 고분자와 BSA-FITC를 혼합하여 제조한 나노섬유(d, e, f)는 불규칙적으로 BSA-FITC가 박혀있는 것을 볼 수 있다.

도 7은 BSA-FITC가 방출되는 정도를 나타낸 그래프로서, 비교예 1에 의해 제조된 나노섬유(d, e, f)는 초기에 BSA-FITC가 90% 이상 방출되는 것을 확인 할 수 있는 반면, 실시예 2에 의하여 제조된 본 발명의 생분해성 나노섬유 복합체(a, b, c)는 7일이 지나도 BSA-FITC가 20 % 이하로 방출되는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 근거로 나노섬유의 아민기와 화학적으로 결합된 생체적합성 성장인자가 지속적으로 그 결합을 유지함을 확인할 수 있으며, 이러한 생체적합성 성장인자가 방출되는 속도는 생분해성 고분자인 PCL/PEG-PCL-PEG의 분해속도에 영향을 받는다.

실험예 2 : 나노섬유의 접촉각 측정

실시예 1 에 의하여 제조된 나노섬유 위에 물방울을 떨어뜨린 후, 5초가 지났을 때의 접촉각을 측정하였다[optical bench-type contact angle measuring system (SEO3000, S.E.O. Inc., Korea 을 사용).

그 결과 PCL-PEG의 함량이 많아질수록, 나노섬유의 접촉각이 작아지는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 PEG가 친수성 고분자이기 때문에 나노섬유의 친수성을 증가시키는 결과를 얻었다.

실험예 3 : 나노섬유의 표면 노출 아민기 측정

실시예 1 에서 제조된 것으로 폴리카프로락톤과 폴리카프로락탄-폴리에틸렌 글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비가 95/5, 90/10 및 80/20으로 구성된 나노섬유의 표면 노출 아민기를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

즉, 나노섬유는 50㎕ 에탄올을 사용하여 미리 적셔주었다. 적신 나노섬유에 PBS를 1ml 씩 첨가해 준 후, 미리 첨가시킨 에탄올을 날려주었다. 0.3 mg/ml 형광아민 100㎕ 씩 각 나노섬유에 첨가시켰다. 15분 동안 교반(vortexing)을 해주면서 반응을 시킨 후, PBS를 제거하고 메탄올로 세척해 주었다.

세척한 나노섬유는 다시 디클로로메탄에 녹여서 형광분광계(LS-55B, Perkin Elmer, U.S.A.)를 사용하여 exitantion 390nm, emission 475nm에서 형광을 측정하였다. 아민기(Amine groups) mol의 표본(standard)으로써 에틸렌디아민(ethylendiamine)을 사용하였다. 상기 얻어진 결과는 도 5에 나타내었다.

실험예 4 : 생분해성 나노섬유의 분해정도 측정

나노섬유의 분해(degradation)을 보기 위하여 완전히 건조된 나노섬유를 1.5 x 1.5 cm²(n=3)의 크기로 잘랐다. 자른 나노섬유는 코니컬 튜브(conical tube)에 넣기 전에 하나하나의 무게를 측정하였다. 에탄올로 미리 적셔준 나노섬유에 1ml PBS를 넣어주고 에탄올을 날려주기 위해 10분 정도 상온에서 두었다. 그 후, 15ml의 코니컬 튜브의 뚜껑을 닫고 밀봉 필름(para-film)으로 밀봉하여 배양(incubation)하는 동안 PBS가 날아가는 것을 방지하였다. 시료는 50℃, 250 rpm, 교반 배양기(shaking incubator)에서 배양시켰다. 7, 21, 35 그리고 42일 후에 시료를 꺼내서 증류수(DW)로 3번 세척한 후, 클린벤치(cleanbench)에서 하루밤(overnight)동안 건조 시켰다. 완전히 건조된 시료의 무게를 측정하여 감소된 무게의 %를 계산하였다.

실험예 5 : 세포 생존도(cell viability)

NIH 3T3 섬유아세포(fibroblast cells)은 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 첨가가 된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양되었다. 세포 생존도(Cell viability)는 48, 24, 12 그리고 6시간 간격으로 관찰해주었다.

상기 실시예 1에서 제조된 것으로 폴리카프로락톤과 폴리카프로락탄-폴리에틸렌 글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비가 100/0, 95/5, 90/10 및 80/20으로 구성된 나노섬유를 사용하여 실험을 수행하였다.

나노섬유는 펀칭을 이용하여 6.4mm의 직경을 갖는 원모양으로 잘라주었다. 둥근 나노섬유는 70% 에탄올과 증류수를 사용하여 세척한 후, 멸균된 의료용 바셀린을 사용하여 96-웰 컬처 플레이트(96-wells culture plate)에 부착시켜주었다. 부착시킨 나노섬유 위에 세포를 심기(seeding)위해서 세포가 자라고 있는 플레이 트(plate)의 배지를 제거해 주었다. 그 후 PBS를 사용하여 2번 세척해주고, 트립신/EDTA 완충액 1ml을 첨가한 상태로 배양기(incubator)에서 약 1분 정도 배양해 주었다.

세포를 충분히 하나하나 떨어뜨려준 후, 세포계수(cell counting)를 통해서 세포 용액(cell solution)을 4.5 x 10⁴ cells/ml 의 농도로 희석시켜주었다. 이렇게 희석시킨 cell solution을 96-웰 컬처 플레이트에 100㎕씩 분주하였다. 세포심기를 한 후 48, 24, 12 그리고 6 시간 후에 WST-1 분석(assay)하였다.

각 웰에 WST-1 용액 10㎕ 씩 첨가시켜주었다. 배양기에서 2시간 동안 배양을 해준 후, 새로운 96-웰 컬처 플레이트에 상층액을 옮겨 담았다. 이 상층액은 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 네 가지 나노섬유에서 모두 높은 세포생존율을 보여주었다. 그 이유는 나노섬유를 제조하기 위해서 사용된 폴리카프로락톤과 폴리에틸렌글라이콜은 생체적합적인 합성고분자이기 때문에 세포의 생존에 독성을 미치지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6 : 세포 형태 관찰

상기 실시예 1에서 제조된 것으로 폴리카프로락톤과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비가 100/0, 95/5, 90/10 및 80/20으로 구성된 나노섬유를 사용하여 실험을 수행하였다.

즉 상기 4종류의 나노섬유를 가로x세로 1x1cm²으로 잘라준 후, 70% 에탄올과 증류수를 사용하여 세척하였다. 세척한 나노섬유는 멸균된 의료용 바셀린을 사용하여 12-웰 컬처 플레이트에 부착시켰다. 부착시킨 나노섬유 위에 세포를 심기위해서 세포가 자라고 있는 플레이트의 배지를 제거하였다. 그 후 PBS를 사용하여 2번 세척해주고, 트립신/EDTA 완충액 1ml을 첨가한 상태로 배양기에서 약 1분 정도 배양하였다. 세포를 충분히 하나하나 떨어뜨려준 후, 세포계수를 통해서 세포 용액(cell solution)을 5x10⁴ cells/ml의 농도로 각 웰에 세포를 심었다. 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양을 한 후, 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하고 증류수로 한번 세척하였다. 2.5 % 포름알데히드(in PBS)를 사용하여 40분 동안 고정시켰다. PBS와 증류수로 세척을 해서 남은 포름알데히드를 제거해 준 후, 50, 75, 95 그리고 100 % 에탄올에 1시간씩 담가두면서 탈수(dehydration) 시켜주었다.

탈수(Dehydration)가 끝나고 증류수로 세척을 해서 에탄올을 제거하고 진공에서 건조된 시료는 FE-SEM(S-4300, HITACHI)을 통해서 세포의 형태(morphology)를 관찰해 주었다. 그 결과, 나노섬유의 굵기가 비교적 균일하고 직경이 작은 PCL-PEG의 비율이 5 중량%와 10 중량%를 PCL과 섞어 방사하여 얻은 나노섬유에서 세포들의 정상적인 형태(morphology)를 관찰할 수 있었고, 0 과 20 중량%의 혼합비율에 비해 잘 뻗어 자란 결과를 얻었다.

실험예 7: F- 액틴 (cell morphology and F-actin)

상기 실시예 1에서 제조된 것으로 폴리카프로락톤과 폴리카프로락탄-폴리에 틸렌 글리콜-아민 블락 공중합체의 혼합비가 100/0, 95/5, 90/10 및 80/20으로 구성된 나노섬유를 사용하여 실험을 수행하였다.

먼저, 세포의 F-액션을 관찰하기 위해서 오레곤 그린 팔로이딘(Oregon green phalloidin)을 사용하여 염색하였다.

나노섬유는 70% 에탄올과 증류수를 사용하여 세척한 후, 12-웰 컬처 플레이트에 멸균된 바셀린을 사용하여 부착시켰다. 부착시킨 나노섬유 위에 세포를 심기 위해서 세포가 자라고 있는 플레이트의 배지를 제거하였다. 그 후 PBS를 사용하여 2번 세척해주고, 트립신/EDTA 완충용액 1ml을 첨가한 상태로 배양기에서 약 1분 정도 배양시켰다. 세포를 충분히 하나하나 떨어뜨려준 후, 세포계수를 통해서 세포 용액을 1 x 10⁵ cells/ml의 농도로 각 웰에 넣고 12시간 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. 2.5% 포름알데히드를 첨가하여 1시간 동안 고정시켰다. 고정이 끝난 후, PBS로 2번 세척한 후에 0.2 % 트리톤(triton) X-100을 첨가시켜 15분 동안 둔다. PBS로 두 번 세척해서 트리톤 X-100을 제거해 준 후, 400㎕ PBS와 5㎕ 그린 팔로이딘(green phalloidin)을 첨가하였다. 15분 후, PBS로 충분히 세척을 한다. 세척이 끝난 나노섬유는 글루마운틴(glue mauntine)을 사용하여 고정시키고 커버슬립을 덮어 건조시킨다. 건조가 끝난 후 공촛점전자현미경(confocal laser scanning microscope, FLUOVIEW - FV300, OLYMPUS, JAPAN) 을 사용하여 관찰하였다. 그 결과 SEM에서 얻은 결과와 동일한 결과를 얻었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하여 제조된 생분해성 나노섬유와 성장인자가 화학적으로 결합된 나노섬유 복합체를 드레싱재에 적용할 경우 상기 성장인자의 방출속도가 감소되므로 성장인자가 지속적으로 서서히 방출될 수 있어 드레싱재의 장기간 사용이 가능하고, 상기 성장인자로 인해 손상된 세포의 성장을 지속적으로 촉진할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

Claims

말단에 아민기가 존재하는 폴리카프로락톤-폴리에틸렌글리콜 블락 공중합체(PEG-PCL-PEG diblock copolymer)를 포함하는 생분해성 수지가, 상기 아민기와 결합가능한 작용기를 가지는 생체적합성 활성성분과 화학적으로 결합되어 이루어진 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 아민기가 결합가능한 작용기는 카르복시기를 포함하는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 생체적합성 활성성분은 카르복시기를 가지는 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 3 항에 있어서,

상기 당단백질은 혈청알부민, 글루코사민 및 갑상선 호르몬 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 생체적합성 활성성분은 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 상피성장인자(epidermal growth factor, EGF) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 나노섬유와 생체적합성 활성성분은 99.999 ~ 0.001 : 90 ~ 10 중량비 범위로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 나노섬유는 직경이 10 ~ 1000 nm 범위인 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 나노섬유는 기공(pore) 크기가 10 ~ 1000 nm 범위인 것을 특징으로 하 는 생분해성 나노섬유 복합체.
청구항 1 내지 7 항 중에서 선택된 어느 하나의 항에 의한 생분해성 나노섬유 복합체로 이루어진 생분해성 드레싱재.
폴리카프로락톤(Poly(ε-caprolactone)과 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체의 혼합물을 전기방사하여 생분해성 나노섬유를 제조하는 과정과,

상기 생분해성 나노섬유에 생체적합성 활성성분을 부가하는 과정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법.
제 9 항에 있어서,

상기 폴리카프로락톤과, 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체는 99.9 ~ 0.1 : 0.1 ~ 99.9 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법.
제 9 항에 있어서,

상기 폴리카프로락톤과, 폴리카프로락톤-폴리에틸렌 글리콜-아민의 블락 공중합체 혼합물을 유기용제에 1 ~ 30 중량% 농도로 용해시키는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법.
제 11 항에 있어서,

상기 유기용제는 탄소수 1 ~ 5 범위의 탄화수소계 유기용제인 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법.
제 9 항에 있어서,

상기 전기방사는 전기방사기의 니들과 그라운드 사이의 거리가 5 ~ 30 cm 범위, 전압 0.1 ~ 30 kV 범위, 유속 0.01 ~ 100 ml/h 범위로 조절되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 생분해성 나노섬유 복합체의 제조방법.