CN104718455A - 肾癌血液生物标志物(Biomarker)的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肾癌血液生物标志物的检测方法及试剂盒。具体地说,本发明涉及一种对肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A全部进行检测的方法及试剂盒,这些检测结果能由医师之类的医疗专家有效地用来判断肾癌罹患与否、肾癌发展程度、肾癌治疗经过,尤其是能够有效地适用于肾癌的早期诊断、肾细胞癌类型中占大多数的透明细胞型肾细胞癌的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及一种肾癌血液生物标志物的检测方法及试剂盒。
背景技术
肾脏在身体中扮演着过滤装置的角色,能够从血液中去除废物、多余水分及盐分。肾癌通常表示发生在肾脏的实质部(肾脏中制造尿的细胞集聚而成的部分,其由髓质与皮质构成)的肾细胞癌(renal cell carcinoma)。典型地,肾细胞癌通常以发生在一侧肾脏的单一肿瘤为典型例,但有时候也会侵犯到两侧肾脏。
肾细胞癌可以分类为透明细胞型肾细胞癌(clear cell RCC)、乳头状肾细胞癌(papillary RCC)、嫌色性肾细胞癌(chromophobe RCC)、髓质性肾细胞癌(medullaryRCC)、未分类肾细胞癌(unclassified RCC)、肾盂移行细胞癌(kidney transitional cellcarcinoma,TCC)、肾嗜酸细胞癌(ranal oncocytoma)等,其中,透明细胞型肾细胞癌占66~75%,乳头状肾细胞癌占15%左右,嫌色性肾细胞癌占5%左右。
肾细胞癌可以根据Roboson分期体系如下分类,局限于实质部内的肿瘤称为第一期,浸润到肾皮膜外或者局限于肾筋膜内的肿瘤称为第二期,转移到肾脏周围血管或淋巴结时称为第三期,侵犯到肾脏周围的其它脏器或者发生远距转移时称为第四期。第一期还根据肿瘤大小而如下区分,肿瘤大小低于4cm时称为Ia,4cm以上时称为Ib,第三期则对侵犯到肾静脉或下腔静脉等肾脏周围血管者称为Ⅲ/a期,如果转移到肾脏周围淋巴结则称为Ⅲ/a期。
肾癌主要发生在60~70岁的老年层并且呈现出持续增加的趋势,在韩国的男性癌症病人中以2.0%占据第10位,在韩国女性癌症病人中以1.2%占据第15位。肾癌在肿瘤大小较小时几乎没有任何症状,肿瘤生长到一定大小而成为推挤脏器的程度时才会出现症状。最常见的症状是血尿,但也仅呈现在60%左右的患者。因此,常常出现诊断过迟的情形而在第一次诊断出来时大约有30%的患者已经处于转移状态,并且根据转移的部分而出现呼吸困难、咳嗽、头痛之类的症状。
大多数情况下,诊断肾癌时利用X-ray、CT摄影、超声波及组织分析之类的方法。这些方法难以区分各种形式的肾癌,需时较长,劳动力的投入较多。
本发明的技术方案则把能够适用于肾癌早期诊断及非侵入性诊断的3种肾癌血液生物标志物NNMT(Nicotinamide N-methyltransferase)、LCP1(L-Plastin)及NM23A(Non-metastatic cells 1protein)加以组合·利用而得以提高肾癌诊断能力。
解决的技术课题
本发明的目的是提供一种肾癌血液生物标志物的检测方法。
本发明的另一个目的是提供一种肾癌血液生物标志物的检测试剂盒(kit)。
本发明的其它目的或具体目的将在后述说明中得到阐述。
解决课题的技术方案
本发明提供一种肾癌血液生物标志物的检测方法。
本发明人利用取自肾癌患者100人与正常人90人的共190个血液试剂进行了预备实验并且得知患者群的NNMT、LCP1及NM23A的血中浓度高于正常人群,从而得以确认这些蛋白质具有作为肾癌血液生物标志物的可能性,把上述3种肾癌血液生物标志物组合后通过ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线分析法对肾癌诊断能力进行评估时,发现这些标志物的诊断能力得到了提升。具体地说,3种血液生物标志物中诊断能力最强的NNMT(在NNMT、LCP1及NM23A等3种标志物中NNMT的诊断能力最高,请参考下列实施例)的准确度(AUC)为0.927,特异度为95%时灵敏度为69%,但是把3种血液生物标志物组合后适用逐步逻辑回归分析法(stepwise logistic regression analysis)时,准确度为0.9333,特异度为95%时灵敏度为77%,适用下列实施例中的计分法(scoring method)时,AUC为0.948,特异度为95%时灵敏度为89%。
更进一步,以使用该190个血液试剂的预备实验的结果为基础,本发明人根据基于上述计分法的上述3种肾癌血液生物标志物的组合对30个正常人血液试剂与29个患者血液试剂实际进行盲试(blind test)实验并且在其结果发现能够把正常人30人中的29人识别成正常人而能够把患者29人中的28人识别成患者(亦即,灵敏度96.67%=29/30×100(%)、特异度96.55%=28/29×100(%))。
本发明的肾癌血液生物标志物的检测方法是以该实验结果为基础提供的,具体地说,其包括下列步骤:步骤(a),让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于各个肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A的结合分子反应,让存在于上述试剂的肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A各自和特异于它的结合分子形成结合体;及步骤(b),检测上述结合体。
在上述内容中,NNMT(nicotinamide-N-methyltransferase)是一种参与到烟酰胺(nicotinamide)的甲基化转移(N-methylation)的酶并且由总共264个氨基酸组成,其分子量为29.6KDa。其基因序列被揭示为GeneBank Accession number:NM_006169,其氨基酸序列被揭示为GeneBank Accession number:NP_006160.1。
在上述内容中,LCP-1(L-Plastin)是肌动蛋白结合蛋白系列的一种,其具有L型与T型等两种形态,其中的L型被认为只在hemopoietic cell表达,总共由627个氨基酸组成,分子量为70.8KDa。其基因序列被揭示为GeneBank Accession number:NM_002298.4,其氨基酸序列被揭示为GeneBank Accession number:NP_002289.1。
而且,在上述内容中,NM23A是被认为在肿瘤转移较为活泼时mRNA量减少的基因的蛋白质NM23的A型异构体。总共由152个氨基酸组成,分子量为16.9KDa。其基因序列被揭示为GeneBank Accession number:NM_198175.1,其氨基酸序列被揭示为GeneBank Accession number:NP_000260.1。
能够凭借本发明的检测方法把血液中的肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A全部予以定量,这些定量值则由医师之类的医疗专家用来判断肾癌罹患与否、肾癌发展程度及/或肾癌治疗经过。
尤其是,本发明的检测方法能够把肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A全部检测,因此即使如下列实施例所述地应用于肾癌初期阶段的第一期患者也能呈现出96%的特异度(把正常人120人中的115人识别成正常人,96%=115/120×100)及95%的灵敏度(把第一期的患者59人中的56人识别成患者),从而能够非常有效地适用于肾癌的早期诊断(作为参考,作为单一生物标志物而具有最强诊断能力的NNMT也只呈现出86%的特异度与92%的灵敏度),而且对肾细胞癌类型中占大多数的透明细胞型肾细胞癌也呈现出96%的灵敏度而能够非常有效地适用于透明细胞型肾细胞癌的诊断(作为参考,作为单一生物标志物而具有最强诊断能力的NNMT也只呈现出93%的灵敏度)。
在本说明书中,“血液的加工试剂”指的是血浆或血清。
在本说明书中,“肾癌血液生物标志物”指的是其在肾癌患者的血中浓度高于正常人而能够有效地区分正常人与肾癌患者的NNMT、LCP1或NM23A。
在本说明书中,“特异于肾癌血液生物标志物的结合分子”指的是实际上不和其它蛋白质结合而只和肾癌血液生物标志物特异地结合并且能够检测出该特异性结合的任何分子,具体地说,其为抗体或适体,其中以抗体较佳。在此,“实际上”所指的是虽然程度较轻但可以形成非特异结合体,该非特异性结合可以如后所述地在检测特异结合之前先利用清洗溶液予以清洗·清除。
在本说明书中,“抗体”指的是能够与本发明的肾癌血液生物标志物特异地结合的任何形态者。因此除了包括单克隆抗体、多克隆抗体或多重特异抗体(亦即,诸如双特异性抗体之类的能够识别两个以上的抗原或两个以上的表位(epitope)的抗体)以外,还包括具有与本发明的肾癌血液生物标志物特异地结合的能力的抗体的片段、重组抗体、化学修饰的抗体。在此,抗体的片段例包括Fab、F(ab')2、scFv(利用适当的连接子把重链或轻链的Fv加以连接的抗体)、Fv、Fab/c(具备1个Fab与完整Fc的抗体)、利用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶之类的切蛋白酶(protein cuttingenzyme)处理抗体后得到的抗体片段。上述抗体的球蛋白(globulin)类型只要能够与本发明的肾癌血液生物标志物特异地结合就不会特别加以限制,其球蛋白类型可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的任何一个。
在本发明的方法中,与肾癌血液生物标志物特异地结合的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体,该多克隆抗体或单克隆抗体的制备方法是本领域的公知技术。例如,多克隆抗体能以本发明的肾癌血液生物标志物作为抗原对鸟类(例如鸡等)、哺乳动物(例如兔、羊、马、鼠等)等动物予以免疫化并且利用硫酸铵沉淀分级法、离子交换色谱法、亲和色谱法等本领域的公知方法从免疫后动物的血液回收所需抗体而得到,单克隆抗体则从以肾癌血液生物标志物为抗原予以免疫化的动物取得脾脏细胞、淋巴结细胞等抗体生成细胞并将其和作为永生化细胞的骨髓瘤细胞融合制成杂种细胞后,把从其杂种细胞或其培养液生产出来的抗体回收后得到。关于多克隆抗体或单克隆抗体制备方法的更详细内容可以参阅文献[Kohler andMilstein,European Journal of Immunology,6:511-519,1976]、美国专利第4,816,56号、文献[Clackson et al,Nature,352:624-628,1991]、文献[Marks et al,J.Mol.Biol.,222:58,1-597,1991]、文献[Harlow,E.andLane,D.,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,NewYork,1999]、文献[Zola,H.,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRCPress,Inc.,Boca Raton,Florida,1984]、文献[Coligan,CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY,1991]等,这些文献被视为本说明书的一部分。
在本发明的方法中,针对肾癌标志物与抗体的结合体进行检测的步骤可以通过ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法、三明治免疫分析法、荧光免疫分析法、辐射免疫分析法、发光免疫分析法等本领域的各种公知·惯用免疫学分析方法实现。
例如,ELISA法可以使用与酶结合的二抗,此时酶可以是过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase)、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化脢、乳酸脱氢酶、淀粉酶等,荧光免疫分析法可以使用与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、四甲若丹明异硫氰酸盐、置换若丹明异硫氰酸盐、二氯三嗪异硫氰酸盐(dichlorotriazin isothiocyanate)、Alexa或AlexaFluoro之类的荧光性物质或者和荧光端结合的抗体,辐射免疫测量法可以使用与氚、碘(1 31I,125I,123I,121I)、磷(32P)、硫(35S)、金属类(例如68Ga、67Ga、68Ge、54Mn、99Mo、99Tc、133Xe等)之类的辐射性同位素结合的抗体。在发光免疫分析法方面,荧光素酶方法、发光氨过氧化物酶方法之类的方法能够与二氧环丁烷化合物之类的发光性物质一起使用。
更具体地的内容可以参阅文献[Enzyme Immunoassay,E.T.Maggio,ed.,CRCPress,Boca Raton,Florida,1980]、文献[Gaastra,W.,Enzymelinked immunosorbentassay(ELISA)、in Methods in Molecular Biology,Vol.1,Walker,J.M.ed.,HumanaPress,NJ,1984]、文献[Ed Harlow and David Lane,Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999],这些文献也被视为本说明书的一部分。
在较佳实施形态中,本发明的方法由三明治免疫分析法进行。本发明的方法由三明治免疫分析法进行时,上述(a)步骤的形成肾癌血液生物标志物与特异于它的结合分子的结合体的步骤包括下列步骤:步骤(a-i),把作为捕获抗体(capturingantibody)而特异于肾癌血液生物标志物的抗体固定到支撑体的表面;及步骤(a-ii),在固定了上述捕获抗体的支撑体上处理血液试剂或其加工试剂而诱导形成上述捕获抗体与肾癌血液生物标志物的结合体。上述步骤(b)的结合体检测步骤则包括下列步骤:(b-i)在上述试剂处理后,针对结合了标记或酶的检测抗体(detectionantibody)进行处理,该标记或酶则为信号的测量作业给予中介或者使信号的测量变成可能;及步骤(b-ii),对上述标记或酶所中介或提供的信号进行测量。
在上述内容中,支撑体可以是诸如微球体(microsphere)(树脂颗粒(bead)、磁颗粒等)、粒子(金属微粒子、金胶体(Colloid)等)、基板(微量滴定板、玻璃基板、硅基板、树脂质基板、电极基板、膜等),但不限定于此。支撑体的材料可以使用(i)玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、镁橄榄石(forsterite)、二氧化硅之类的无机材料,或者(ii)聚乙烯、聚乙烯醇缩醛(polyvinyl acetal)、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、酚醛树脂、脲醛树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、硅树脂、聚苯醚、聚砜、聚乙二醇、琼脂糖、丙烯酰胺、纤维素硝酸酯、尼龙、胶乳之类的有机材料。
在上述内容中,把上述捕获抗体固定到支撑体的方法有下列几种,通过吸附(例如涂层)方式直接固定,利用可结合到蛋白质与支撑体的连接子等物间接固定。
把上述捕获抗体吸附到支撑体后使用时,可以利用pH为9.5的0.06M碳酸盐缓冲溶液或碳酸氩盐缓冲溶液稀释上述捕获抗体并且让该稀释液与支撑体在一定温度下接触一定时间而实现该吸附。只要能够实现足够的吸附,就不会限制所需时间与温度,例如,在4℃实现吸附时可以进行72小时,在37℃实现吸附时可以进行2小时。吸附后可以利用蒸馏水或乙醇等物清洗,可以涂敷PBS之类的溶液中所含牛血清白蛋白(BSA)之类的封闭剂。涂敷了封闭剂后,也可以使用蒸馏水或不含封闭剂的缓冲溶液等加以清洗。
吸附到支撑体的捕获抗体在支撑体处理血液试剂或其加工试剂时会和该试剂中的肾癌血液生物标志物形成结合体。优选地,形成了结合体后,为了清除非特异地结合的抗体或污染物质等而使用Tween 20之类的清洗用缓冲液或蒸馏水之类的清洗剂加以清洗。
在上述内容中,标记可以是生物素(biotin)之类的化学物质、异硫氰酸荧光素、四甲若丹明异硫氰酸盐之类的荧光物质、碘(131I,125I,123I,121I)、磷(32P)、硫(35S)之类的辐射能物质等,上述酶可以是过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化脢,乳酸脱氢酶、淀粉酶、荧光素酶等促进发色反应、荧光反应、发光反应之类的反应的酶。更具体的内容请参阅文献[Ed Harlow and David Lane,Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999]等,该文献也被视为本说明书的一部分。
优选地,上述标记或酶可以和抗体进行共价结合。
在上述内容中,检测抗体可以举例为识别抗体(捕获抗体)的Fc部分者,该检测抗体可以把Fc部分对鸟类、哺乳动物之类的动物予以免疫化后从该动物的血液加以分离·提炼后得到。
在上述内容中,信号的测量方法可以使用本领域的公知方法得到,例如,标记使用生物素时可以利用结合到信号的抗生物素蛋白(avidin)或抗生蛋白链菌素(streptavidin)测量信号,使用酶时则可以添加该酶的底物后测量信号。例如,酶使用荧光素酶时则使用虫荧光素。
优选地,在上述内容中,在上述(a-ii)步骤诱导了肾癌血液生物标志物与捕获抗体的结合后,及/或(b-1)处理了检测抗体后,还包括下列步骤,为了清除非特异地结合的抗体等物或者清除污染物质等物而如前所述地使用Tween 20之类的清洗缓冲液或蒸馏水等清洗剂清洗的步骤。
在较佳实施形态中,本发明的方法可以由ELISA法进行。由ELISA法进行时,上述(a)步骤的形成肾癌血液生物标志物和特异于它的结合分子的结合体的步骤包括下列步骤:步骤(a-i),把血液试剂或其加工试剂固定到支撑体的表面;及步骤(a-ii),作为一抗把针对肾癌血液生物标志物的抗体进行处理。上述步骤(b)的结合体检测步骤则包括下列步骤:步骤(b-i),在上述一抗处理后,对结合了酶的二抗进行处理;及步骤(b-ii),测量上述酶的活性。
对于在上述支撑体上固定(例如涂敷)试剂的方法,前面所说明的内容依然有效。
在上述内容中,酶如前所述地可以使用促进发色反应、荧光反应、发光反应等的酶。
在上述内容中,如同针对上述检测抗体所进行的说明一样地,二抗可以把一抗作为抗原使用而在哺乳动物等予以免疫化并且从该动物的血液分离·提炼后得到。
在上述内容中,测量酶活性的步骤可以通过添加该酶的底物并测量其反应程度而得以实现。
在本发明的方法的其它实施形态中,特异于上述肾癌血液生物标志物的结合分子可以不使用抗体而使用和本发明的肾癌血液生物标志物特异地结合的适体(aptamer)。适体是寡核苷酸(oligonucleotide)或肽(peptide)分子,适体的一般内容可以参阅文献[Bock LC et al.,Nature 355(6360):5646(1992)]、文献[Hoppe-Seyler F,Butz K"Peptide aptamers:powerful new tools for molecular medicine".J Mol Med.78(8):42630(2000)]、文献[Cohen BA,Colas P,Brent R."An artificial cell-cycleinhibitor isolated from a combinatorial library".Proc Natl Acad Sci USA.95(24):142727(1998)]等。
另一方面,本发明还涉及一种肾癌血液生物标志物的检测试剂盒。
本发明的试剂盒的特征在于,(a)包括特异于肾癌血液生物标志物NNMT的结合分子、特异于肾癌血液生物标志物LCP1的结合分子及特异于肾癌血液生物标志物NM23A的结合分子,(b)包括说明书,该说明书教导了把利用这些肾癌血液生物标志物检测到的NNMT、LCP1及NM23A的血中浓度应用于肾癌诊断的方法。
上述本发明的试剂盒中特异于肾癌血液生物标志物的分子是抗体或适体,其中以抗体较佳。
在上述本发明的试剂盒中,作为上述特异于肾癌血液生物标志物的分子,抗体能够以固定到支撑体的形态或者和支撑体分离的形态被包含在本发明的试剂盒。抗体以和支撑体分离的形态被包含时,本发明的试剂盒可以进一步包含支撑体。在此,支撑体可以是微球体、粒子、基板等,以微球体较佳,如果是微球体中的树脂颗粒则更佳。
在上述本发明的试剂盒中,能以下列形态另行包含二抗或检测抗体,该二抗或检测抗体和让信号的测量变成可能的标记或酶呈结合的形态、或者和该标记或酶呈分离的形态,以分离的形态被包含时本发明的试剂盒能够进一步包含标记或酶。
在上述本发明的试剂盒中,还能包括其它清洗缓冲液、试剂或抗体稀释液、酶底物、终止液等。
上述说明书所教导的方法,亦即把利用肾癌血液生物标志物检测到的NNMT、LCP1及NM23A的血中浓度应用于肾癌诊断的方法具有各种方法,例如,把NNMT的浓度值、LCP1的浓度值及NM23A的浓度值直接和逻辑回归运算出来的值的截止值(cut-off value)进行比较,如果是截止值以上的值则将受检人区分为肾癌患者,如果是截止值以下的值则区分为正常人;或者,也可以对利用诸如下列实施例的计分法(scoring method)得到的结果值和截止值进行比较,如果是截止值以上的值则将受检人区分为肾癌患者,如果是截止值以下的值则区分为正常人。在此,截止值是一种能够把受检人区分成患者或正常人的值,可以根据特异度、灵敏度之类的诊断尺度设定成任何值。例如,可以设定成通过ROC曲线分析呈现出95%的特异度的值,或者设定成ROC曲线上AUC成为最大时的值(亦即,在ROC曲线上的一个位置画出水平及垂直的虚拟直线时,该虚拟直线所围起来的面积成为最大面积的该位置上的值)等。
另一方面,本发明涉及一种肾癌血液生物标志物LCP1的检测方法,本发明的检测方法包括下列步骤:步骤(a),让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于肾癌血液生物标志物LCP1的结合分子进行反应,从而形成存在于上述试剂的肾癌血液生物标志物LCP1和特异于它的结合分子的结合体;及步骤(b),检测上述结合体。
另一方面,本发明涉及一种肾癌血液生物标志物NM23A的检测方法,发明的检测方法包括下列步骤:步骤(a),让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于肾癌血液生物标志物NM23A的结合分子进行反应,从而形成存在于上述试剂的肾癌血液生物标志物NM23A和特异于它的结合分子的结合体;及步骤(b),检测上述结合体。
上述肾癌血液生物标志物LCP1及NM23A虽然在组织试剂中被认为肾癌生物标志物(韩国公开专利第10-2009-0014979号),但是在血液却没有被认为生物标志物。
对于上述肾癌血液生物标志物LCP1或NM23A的检测方法的具体内容,可以直接适用前述内容。
有益效果
本发明可以具有下列优点。
本发明提供一种肾癌血液生物标志物的检测方法与检测试剂盒。
本发明的肾癌血液生物标志物的检测方法与检测试剂盒可以实现血液中的肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A的定量,从而能够提供让医师之类的医疗专家用来判断肾癌罹患与否、肾癌发展程度及/或肾癌治疗经过的有用信息。尤其是,本发明的检测方法及检测试剂盒能够有效地适用于肾癌的早期诊断、肾细胞癌类型中占大多数的透明细胞型肾细胞癌的诊断。
附图说明
图1示出了肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A的血中浓度的平均值在正常人群与肾癌群的比较结果。
图2示出了肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A各自的ROC曲线与这些标志物组合(适用了逐步逻辑回归分析法(stepwise logistic regression analysis)的标志物组合与适用了计分法的标志物组合)的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明。但,本发明的范围并不局限于该实施例及实验例。
<实施例>针对组合标志物的肾癌诊断能力的分析
<1>实验方法
<1-1>血液试剂的取得及处理
所有的血液试剂取样均在书面同意下根据延世大学医科大学的临床试验审查委员会(IRB)所批准的程序进行。肾癌患者的试剂从通过影像学诊断方法与细胞病理学方法被诊断为患者的129人中得到。肾癌患者群的平均年龄为55.9岁,根据肾癌类型区分时,透明细胞型肾细胞癌(clear renal cell carcinoma,clear RCC)患者为89人、乳头状肾细胞癌(papillary RCC)患者为6人、嫌色性肾细胞癌(chromophobeRCC)患者为7人、肾盂移行细胞癌(kidney transitional cell carcinoma,TCC)患者为8人、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)患者为1人、未分类肾细胞癌(unclassified RCC)患者为3人。其余者则是被判定为肾嗜酸细胞癌(ranal oncocytoma)所导致的良性肿瘤或肾癌阴性患者为6人、良性肿瘤(benign)患者为9人。根据肾癌发展阶段区分肾癌患者129人时,患者59人为Ia/Ib期、患者13人为Ⅱ期、患者29人为Ⅲa/Ⅲb期、患者2人为Ⅳ期、其余患者则没有归类。
正常人试剂则从到延世大学医科大学诊断学科受诊的120人中取得,此时正常人群的平均年龄为25岁。血浆试剂则收集了15个月,取自肾癌患者100人与正常人90人的初期试剂用于分析标志物的诊断能力的预备实验(training group sample study),后期取得的患者28人与正常人30人的试剂则用来进行测试实验,该测试实验针对通过预备实验得到的标志物的诊断能力进行有效性检查。
下列[表1]整理了试剂的整体内容。
表1
TCC:Transitional Cell Carcinoma of the Kidney
利用含有4mg K2EDTA的5ml灭菌真空取血管取得了血液试剂,和抗凝固剂混合后以2,500rpm的速度实行离心分离10分钟,把清液层的血浆加以分离并且在-80℃的温度下一直保管到实验之前。
<1-2>颗粒与抗体的结合
作为标准试剂(calibrator),针对再组合蛋白质的制备、抗体制备、以及检测抗体与生物素(biotin)结合的实验均按照文献[Journal of Proteome Research 2010,9:3710-3719]上记载的方法实行。再组合蛋白质方面,各自利用NNMT(GeneBankaccession number:NM_006169)、LCP1(GeneBank accession number:NM_002298.4)与NM23A(GeneBank accession number:NM_198175.1)的全长cDNA进行了制备。
与抗体的颗粒(Bead;Luminex Corp.)的结合则利用下列方法实现。首先,把anti-NNMT IgG结合到颗粒编号63,把anti-LCP1IgG结合到颗粒编号17,把anti-NM23A IgG结合到颗粒编号33。抗体与carboxy-coated颗粒的结合则按照制造厂商(Luminex Corp.)的实验方案(protocol)进行。具体地说,通过离心分离法以除盐水清洗了1×106个颗粒两次,通过涡流(Vortexing)与音波处理方式在8μl的磷酸钠缓冲溶液(pH 6.2)上进行悬浮(suspension)。把4μl的N-hydroxysulfosuccinimide(sulfo-NHS;Thermo Scientific)与4μl的1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride(EDC;Sigma)添加到颗粒后通过涡流(Vortexing)予以混合。在常温下放置20分钟后利用50μl的结合溶液(50mM MES)清洗两次,然后添加同一溶液20μl后进行悬浮。把稀释的10μg的抗体(1mg/ml)添加到含有颗粒的溶液,利用结合溶液把总量调整到100μl。在常温下旋转培养2小时地与抗体结合,然后利用200μl的保管/结合溶液(PBS containing 0.1%BSA,0.05%Tween 20,0.05%sodium azide)清洗两次。利用血球计(hemocytometer)算出和100μl保管溶液内的抗体结合的颗粒量,然后保管在2~8℃的暗室。
<2-3>Multiplexed microsphere immunoassay
所有的分析全部通过基于颗粒的三明治免疫分析法(bead-basedsandwich immunoassay)进行,该分析法则利用结合了捕获(capturing)抗体的颗粒、结合了生物素的检测抗体(biotin-labeled detectionantibody)、结合了藻红蛋白(phycoerythrin)的抗生蛋白链菌素(streptavidin)(Invitrigen)。该分析则利用渗透膜板(fiterplate)(Millipore Corporation,Billerica,MA)进行,该渗透膜板事先在常温下处理了定量测量用缓冲液(100mM Tris HCl pH7.4,150mM NaCl,1%BSA,2mM EDTA,2%PEG 4000,1.2%Synperonic F68,0.1%sodiumazide,0.2mg/ml rabbit IgG)。在所有的培养步骤中均以400rpm的速度予以晃动,溶液的添加与清洗则利用真空吸入器(vacuummanifold)(Millipore)进行。用来定量计算的标准物质使用了再组合蛋白质,牛血清则作为人血清样本的类似体而当做标准物质的稀释剂使用。
在进行多重定量测量(multiplexed assay)之前,先进行了基于各个单一标志物的测量,添加结合了颗粒的各捕获抗体对(pair)后测量了标准曲线(calibration curve)的变化。如果检测到测量值的变化,则引进了针对各抗体对的非特定结合的封闭条件(blocking condition)把数值加以调整地予以优化。把含有1000个捕获抗体复合颗粒的20ul定量测量用缓冲液添加到渗透膜板,还添加了20μl的血清样本或标准物质。培养30分钟后,然后进一步培养了30分钟。利用的清洗/PE溶液(50mM Tris HCl pH7.4,150mM NaCl,1%BSA,0.1%sodium azide,0.05%Tween 20)清洗后,进一步培养含有结合了藻红蛋白的抗生蛋白链菌素(4ug/ml)的PE溶液30分钟。之后,没有清洗地添加PE溶液50ul,在利用Luminex100system(LuminexCorp.)确认结果之前先将颗粒充分均匀地混和。使用MasterPlex CT software(Ver.1.0;MiraiBio,Inc.)确认结果并且进行了线性回归曲线分析。
<1-4>资料分析
利用MedCalc software(Ver.9.6.4.0;http://www.medcalc.be)进行了统计分析。为了得到校正曲线(calibration curve)而使用了线性回归分析,为了评估校正曲线的线性性而使用了皮尔逊相关系数(R2)。使用Wilcoxon paired sample test检查了正常人血浆的标志物浓度与肾癌患者血浆的标志物浓度差异的显著性(p<0.0001)。对于3种标志物组合的诊断能力,则进行逐步逻辑回归分析并且比较了各标志物的诊断能力。进行ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线分析算出了特异度、灵敏度及准确度(AUC)。为了提高3种标志物组合的诊断能力而引进了计分法(scoring method)。除了有关确定各标志物基准值(criterion)的事项以外,计分法基本上按照文献[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,7677-682]所记载的方法进行。
基准值定议成各标志物的ROC曲线中准确度(AUC)成为最大值之处。各标志物的血浆浓度在该基准值以下时给予0分(0≤基准值),超过基准值时给予1分(>基准值),从而使得给予3种标志物的组合的总分为0分到3分。
<2>实验结果
<2-1>各个单一标志物的诊断能力分析结果
在总共利用了190个试剂(正常人试剂90个及患者试剂100个)的预备实验中,测量各单一标志物的血浆浓度并且将其平均值显示在[图1]。请参考[图1],NNMT的血浆浓度在正常人试剂中的平均值为68pg/ml,在肾癌患者试剂中的平均值为420pg/ml,肾癌患者试剂大约高6.2倍左右;LCP1则各为10385pg/ml、13789pg/ml,肾癌患者试剂大约高1.3倍左右;NM23A则各为780pg/ml、3442pg/ml,肾癌患者试剂大约高4.4倍左右。
通过ROC曲线分析方式评估诊断能力时,在95%的特异度下,NNMT呈现出69%的灵敏度,LCP1呈现出39%的灵敏度,NM23A则呈现出48%的灵敏度。
<2-2>组合标志物的诊断能力的分析结果
在总共利用了190个试剂(正常人试剂90个及患者试剂100个)的预备实验中,适用逐步逻辑回归分析法(stepwise logistic regressionanalysis)计算了组合标志物的诊断能力。为了计算诊断能力而进行了ROC曲线分析,其结果如下,准确度(AUC)为0.933,在95%的特异度下灵敏度为77%。与NNMT或其余2个标志物的诊断能力比较时,准确度(AUC)及特异度为95%时的灵敏度全部有所提升。利用190个试剂进行预备实验的结果为,单一标志物中诊断能力最强的NNMT的诊断能力不过是准确度0.927、特异度为95%时的灵敏度为69%。
下面在总共利用了190个试剂(正常人试剂90个及患者试剂100个)的预备实验通过计分法(scoringmethod)评估了组合标志物的诊断能力。总共利用190个试剂制作各标志物的ROC曲线并且把ROC曲线中各标志物的AUC成为最大值的位置定义为基准值(criterion),NNMT的基准值确定为147pg/ml,LCP1与NM23A各自确定为12974pg/ml、1230pg/ml。然后,当各标志物的血浆浓度超过上述基准点时给予1分,基准点以下则给予0分,从而对3种标志物的组合最多给予3分的总分而最低给予0分的总分。在此,用来判断肾癌的截止值(cut-off value)为1。
在这种情形下,对于3种标志物的组合的AUC为0.948,特异度为95%时灵敏度为89%。
对于30个正常人试剂与29个患者试剂以上述3种标志物组合的计分法进行实际盲试(blind test)实验的结果如下,把正常人30人中的29人识别成正常人而把患者29人中的28人识别成患者(亦即,灵敏度96.67%=29/30×100(%)、特异度96.55%=28/29×100(%))。
对于预备实验与盲试实验所用总共249个试剂,下列[表2]整理了各标志物与3种标志物组合的诊断能力,各ROC曲线则显示在[图2]。
表2
AUC:area under curve,+PV:positive predictive value,-PV:negative predictive value
请参考[表2]及[图2],相比于各标志物诊断能力,标志物组合的准确度(AUC)及95%特异度时的灵敏度全部有所提升。
<2-3>对于肾癌类型及肾癌发展阶段的诊断能力的评估
对于总共249个试剂,[表3]及[表4]各自给出了基于肾癌类型的NNMT与标志物组合的诊断能力评估结果、基于肾癌发展阶段的NNMT与标志物组合的诊断能力评估结果。
表3
表4
请参考[表3],对于肾细胞癌类型中占大多数的透明细胞型肾细胞癌,NNMT的灵敏度为93%,标志物组合所呈现出的灵敏度则为96%。请参考[表4],在初期步骤(第Ⅰ期),NNMT呈现出92%的灵敏度,标志物组合则呈现出95%的灵敏度。
该结果显示,把NNMT、LCP1及NM23A组合在一起后使用时,在肾癌类型中占大多数的透明肾细胞癌的诊断与肾癌的早期诊断上能够更加有效地使用。
Claims (14)
1.一种肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,其包括下列步骤:
步骤(a),让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于各个肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A的结合分子反应,让存在于上述试剂的肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A各自和特异于它的结合分子形成结合体;及
步骤(b),检测上述结合体。
2.根据权利要求1所述的肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,上述血液加工试剂是血浆或血清。
3.根据权利要求1所述的肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,特异于上述肾癌血液生物标志物的结合分子是抗体。
4.根据权利要求1所述的肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,上述步骤(a)的形成肾癌血液生物标志物和特异于它的结合分子的结合体的步骤包括下列步骤:
步骤(a-i),把作为捕获抗体(capturing antibody)而特异于肾癌血液生物标志物的抗体固定到支撑体的表面;及
步骤(a-ii),在固定了上述捕获抗体的支撑体上处理血液试剂或其加工试剂而诱导形成上述捕获抗体与肾癌血液生物标志物的结合体;
上述步骤(b)的结合体检测步骤包括下列步骤:
步骤(b-i),在上述试剂处理后,针对结合了标记或酶的检测抗体(detectionantibody)进行处理,该标记或酶则为信号的测量作业给予中介或者使信号的测量变成可能;及
步骤(b-ii),对上述标记或酶所中介或提供的信号进行测量。
5.根据权利要求4所述的肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,上述支撑体为微球体(microsphere),该微球体为树脂颗粒。
6.根据权利要求4所述的肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,中介或者使信号的测量变成可能的上述标记为生物素。
7.根据权利要求1所述的肾癌血液生物标志物的检测方法,其特征在于,上述步骤(a)的形成肾癌血液生物标志物和特异于它的结合分子的结合体的步骤包括下列步骤:
步骤(a-i),把血液试剂或其加工试剂结合到支撑体的表面;及步骤(a-ii),作为一抗把针对肾癌血液生物标志物的抗体进行处理;
上述步骤(b)的的结合体的检测步骤则包括下列步骤:
步骤(b-i),在上述一抗处理后,对结合了酶的二抗进行处理;及
步骤(b-ii),测量上述酶的活性。
8.一种肾癌血液生物标志物检测试剂盒,其特征在于,
(a)包括特异于肾癌血液生物标志物NNMT的结合分子、特异于肾癌血液生物标志物LCP1的结合分子及特异于肾癌血液生物标志物NM23A的结合分子;
(b)包括说明书,该说明书教导了把利用这些肾癌血液生物标志物检测到的NNMT、LCP1及NM23A的血中浓度应用于肾癌诊断的方法。
9.根据权利要求8所述的肾癌血液生物标志物检测试剂盒,其特征在于,特异于上述肾癌血液生物标志物的结合分子为抗体。
10.根据权利要求8所述的肾癌血液生物标志物检测试剂盒,其特征在于,上述试剂盒还包括支撑体,该支撑体固定了抗体或者没有固定抗体。
11.根据权利要求8所述的肾癌血液生物标志物检测试剂盒,其特征在于,上述试剂盒还包括二抗或检测抗体,该二抗或检测抗体以下形态被包含,亦即,该二抗或检测抗体和让信号的测量变成可能的标记或酶呈结合的形态,或者和该标记或酶呈分离的形态。
12.根据权利要求1所述的肾癌血液生物标志物检测试剂盒,其特征在于,上述试剂盒还包括清洗缓冲液、试剂稀释液、酶底物、终止液。
13.一种肾癌血液生物标志物LCP1的检测方法,其特征在于,
其包括下列步骤:
步骤(a),让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于肾癌血液生物标志物LCP1的结合分子进行反应,从而形成存在于上述试剂的肾癌血液生物标志物LCP1和特异于它的结合分子的结合体;及步骤(b),检测上述结合体。
14.一种肾癌血液生物标志物NM23A的检测方法,其特征在于,
其包括下列步骤:
步骤(a),让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于肾癌血液生物标志物NM23A的结合分子进行反应,从而形成存在于上述试剂的肾癌血液生物标志物NM23A和特异于它的结合分子的结合体;及
步骤(b),检测上述结合体。
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