相關申請案之交叉參考 本申請案主張2016年2月26日提出申請之美國臨時申請案第62/300,142號之優先權權益，該臨時申請案之全部內容以引用方式併入本文中。 政府權利 本發明係在政府支持下在由國立衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)之國家癌症研究院(National Cancer Institute，NCI)授予之許可號R01 CA120206及U01 CA168856下作出。政府具有本發明之某些權利。 可較易於藉由參照結合附圖及實例(其形成本發明之一部分)瞭解之下列詳細闡述來理解本發明。應理解，該等發明並不限於本文所闡述及/或展示之具體方法、分析、套組、條件或參數，且本文所用之術語係用於僅藉由實例方式來闡述特定實施例且並不意欲限制所主張發明。 本文件中所引用或闡述之每一專利、專利申請案及公開案之全部揭示內容皆以引用方式併入本文中。 應理解，除非另外指示，否則上文及本發明通篇採用之下列術語及縮寫具有下列含義。 在本發明中，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個參考物，且所提及之特定數值至少包含該特定值。因此，舉例而言，在提及「試劑」時係提及一或多種該等試劑及其為熟習此項技術者已知之等效物等。另外，在指示某一要素「可為」 X、Y或Z時，該用法預計在所有情況下並不排除用於該要素之其他選擇。 在值藉由使用先行詞「約」表示為近似值時，應理解，特定值形成另一實施例。如本文中所使用，「約X」 (其中X係某一數值)較佳地係指所列舉值±10% (包含此二者)。舉例而言，片語「約8」可係指7.2至8.8 (包含此二者)之值；作為另一實例，片語「約8%」可係指7.2%至8.8% (包含此二者)之值。在存在之情形下，所有範圍皆係包含性且可組合。舉例而言，在列舉範圍「1至5」時，所列舉範圍應解釋為視情況包含範圍「1至4」、「1至3」、「1-2」、「1-2及4-5」、「1-3及5」及諸如此類。另外，在明確提供替代之列表時，此一列表亦可包含可排除任一替代之實施例。舉例而言，在闡述範圍「1至5」時，此一闡述可支持排除1、2、3、4或5中之任一者之情況；因此，所述「1至5」可支持「1及3-5但非2」或簡單地「其中不包含2」。 如本文中所使用，術語「治療」或「療法」 (以及其不同詞語形式)包含預防性(例如防禦性)、治癒性、姑息性或抗增殖性治療。該預防性、治癒性、姑息性或抗增殖性治療可為完全或部分治療。舉例而言，完全消除不期望症狀或部分消除一或多種不期望症狀代表如本文所涵蓋之「治療」。 本發明尤其係關於檢測肝細胞癌之方法、分析及套組；以及將個體在患有肝細胞癌之較高及較低風險分類之間分層之方法；及治療懷疑患有肝細胞癌或處於患有肝細胞癌之風險下之個體及管控該個體之治療之方法。除非另外指定，否則針對本發明之一態樣(例如結合本發明方法、套組及分析中之任一者)所揭示之步驟、試劑及因子(例如生物標記物)可結合本發明之任一其他態樣來採用。 儘管先前工作已試圖藉由評價一或多種生物因子來解決關於肝細胞癌之高靈敏度、早期預測物之需要，但皆未能接近對個體、尤其無症狀個體是否患有該病狀作出臨床相關測定所需之靈敏度。本發明者已發現，某些因子組合藉由賦予先前無法獲得之高準確度來滿足此需要。重要的是，所鑑別組合可利用個體地尚未代表肝細胞癌之準確檢測物之因子，可省略在傳統上已視為代表疾病之指示物之因子，或二者皆可。本發明所揭示標的物之該等及其他特徵更全面闡述於本文中。 本文提供檢測個體之肝細胞癌或測定個體患有肝細胞癌之可能性之方法，其包括：自來自個體之生物流體去除IgG及IgM蛋白質；量測生物流體中之一或多種生物標記物之量；確定個體之年齡及性別；及使用所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出來測定個體中肝細胞癌之不存在或存在。 在發現本發明所揭示標的物之過程期間，發明者觀察到，不可能鑑別來自個體之生物流體內之蛋白質之某些糖型(包含含有岩藻醣之糖型)。發明者測得，一些材料存在個體試樣中，該材料在用於鑑別糖型之分析中產生非特異性信號，且最終發現主要混擾材料係IgM。進一步發現，去除IgM及IgG可去除污染信號且允許以先前不可能之方式來準確分析特定蛋白質糖型。已令人吃驚地測得，去除IgM亦及IgG之步驟及用於達成該等步驟之試劑代表根據本發明方法、分析及套組之肝細胞癌之早期檢測製程之臨床基本態樣。在一些實施例中，藉由將生物流體與蛋白質A/G (發現蛋白質A/G之有效性大於其他測試策略)一起培育來去除IgG，且藉由使生物流體通過過濾器來去除IgM。過濾器可為(例如) 1000 kD過濾器、900 kD過濾器、800 kD過濾器、500 kD過濾器、450 kD過濾器、400 kD過濾器、350 kD過濾器、300 kD過濾器、250 kD過濾器、200 kD過濾器、175 kD過濾器、150 kD過濾器、125 kD過濾器、100 kD過濾器、an 80 kD過濾器、75 kD過濾器、70 kD過濾器、60 kD過濾器、50 kD過濾器、40 kD過濾器、30 kD過濾器、25 kD過濾器、20 kD過濾器、15 kD過濾器或10 kD過濾器。過濾可(例如)藉由重力或離心來達成。或者，可藉由使用聚乙二醇進行沈澱來去除IgG及IgM。根據該等實施例，可將血清與聚乙二醇一起培育且然後實施離心，其中所得上清液代表量測所關注生物標記物之各別量之材料。 可根據本發明使用任何生物流體。舉例而言，生物流體可為全血、血清、血漿、尿液、唾液、淚液、黏液或該等流體中之兩者或更多者之組合。 在自生物流體去除IgG及IgM後，量測生物流體中之一或多種生物標記物之量。生物流體中之生物標記物之「量」可係指生物流體中之其濃度(如以ng/mL形式所表示)，或在岩藻醣基化醣蛋白生物標記物之情形下，可係指相對於試樣中之非岩藻醣基化生物標記物之量在生物試樣中岩藻醣基化生物標記物之量。在一些實施例中，可以相對於試樣中之生物標記物總量之百分比形式來表示岩藻醣基化生物標記物之量。 先前工作已鑑別出50種以上在已知患有肝細胞癌、肝硬化或二者之個體中展現增加之岩藻醣基化之醣蛋白(Comunale, M. A.等人，J Proteome Res. 2006 Feb;5(2):308-15)。各種公開研究已評價個別岩藻醣基化醣蛋白用作用於肝細胞癌之標記物之能力，該等岩藻醣基化醣蛋白包含胎球蛋白A (亦稱為α-2-HS-醣蛋白) (Comunale, MA等人，J. Proteome Res. 2009；8；595-602)、激肽原(Wang, M等人， Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009；18；1914-1921)、α-1抗胰蛋白酶(
id
.)、原血紅素結合素(Comunale, MA等人， 2009)、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(Comunale, MA等人， Proteomics Clin. Appl. 2013；7；690-700)、GP73 (Drake, RR等人，Mol Cell Proteomics. 2006；5；1957-67)及LRAGG (凝集素反應性抗α-半乳糖IgG) (Mehta, AS等人，J Virol. 2008；82；1259-1270)。在該等醣蛋白中，最高表現者包含(例如)原血紅素結合素(AUROC = 0.87)及胎球蛋白-A (AUROC = 0.90)。本發明者測得，某些因子組合(其可稱為組，一些因子係岩藻醣基化醣蛋白)可用於鑑別肝細胞癌之存在且其準確度遠大於在評價任一個別醣蛋白或其他個別因子時。出人意料地，某些在個別評價時用作肝細胞癌之最佳指示物之醣蛋白對包含尤其評價該等蛋白質之因子(例如一或多種其他岩藻醣基化醣蛋白)的組僅具有中等貢獻或甚至具有負貢獻。因此，發現鑑別肝細胞癌之個別指示物之先前工作不能用於預測彼等指示物對用於鑑別患有肝細胞癌之個體之因子組的貢獻。 根據本發明方法，量測各別量之生物標記物可為以下中之一或多者：鹼性磷酸酶、GP-73、原血紅素結合素、HBsAg、肝炎B病毒顆粒、α-酸-醣蛋白、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶His-Pro-less、α-1-抗胰蛋白酶、血清轉鐵蛋白、血漿銅藍蛋白、α-2-巨球蛋白、胎球蛋白-A/α-2-HS-醣蛋白、α-胎兒蛋白、觸珠蛋白、纖維蛋白原γ鏈前體、免疫球蛋白(包含(例如) IgA、IgD、IgE)、APO-D、激肽原、富組胺酸醣蛋白、補體因子1前體、補體因子I重鏈、補體因子I輕鏈、補體C1s、補體因子B前體、補體因子B Ba片段、補體因子B Bb片段、補體C3前體、補體C3β鏈、補體C3α鏈、C3a過敏毒素、補體C3bα'鏈、補體C3c片段、補體C3dg片段、補體C3g片段、補體C3d片段、補體C3f片段、補體C5、補體C5β鏈、補體C5α鏈、C5a過敏毒素、補體C5α'鏈、補體C7、B-2-醣蛋白、維他命D結合蛋白、內源性-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H2、α-1B-醣蛋白、血管緊張素原前體、管緊張素-1、管緊張素-2、管緊張素n-3、GARP蛋白、β-2-醣蛋白、叢生蛋白(Apo J)、整聯蛋白-8前體醣蛋白、整聯蛋白α-8重鏈、整聯蛋白α-8輕鏈、肝炎C病毒顆粒、elf-5、激肽原、HSP33-同系物、賴胺醯基肽鏈內切酶及含有富白胺酸重複單元之蛋白質32前體。在一些實施例中，根據本發明方法來量測該等醣蛋白之糖型。舉例而言，可量測該等醣蛋白之N-連接醣基化形式(例如生物標記物之岩藻醣基化N-連接糖型)，且特定而言，可量測核心岩藻醣基化N-連接糖型。其他生物標記物可為丙胺酸胺基轉移酶、天門冬胺酸胺基轉移酶、膽紅素、白蛋白、血小板計數或白血球計數中之一或多者。另外，根據本發明，任一上文所提及因子之量之隨時間變化可代表「生物標記物」。 在某些實施例中，量測各別量之生物標記物係以下中之一或多者：α-胎兒蛋白、岩藻醣基化胎球蛋白-A、岩藻醣基化原血紅素結合素、岩藻醣基化激肽原、岩藻醣基化α-1-抗胰蛋白酶、天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及鹼性磷酸酶(ALK)。在一態樣中，本發明方法包括量測α-胎兒蛋白、岩藻醣基化激肽原、ALK及AST。在另一態樣中，本發明方法包括量測α-胎兒蛋白、岩藻醣基化激肽原、ALK、AST及岩藻醣基化α-1-抗胰蛋白酶。在另一態樣中，本發明方法包括量測α-胎兒蛋白、岩藻醣基化激肽原、ALK、AST及岩藻醣基化胎球蛋白-A。本發明方法可或者包括量測α-胎兒蛋白、岩藻醣基化激肽原、ALK、AST、岩藻醣基化胎球蛋白-A及岩藻醣基化α-1-抗胰蛋白酶。根據本發明方法量測之生物標記物之其他組合包含：α-胎兒蛋白及岩藻醣基化胎球蛋白-A；α-胎兒蛋白及岩藻醣基化原血紅素結合素；α-胎兒蛋白及岩藻醣基化激肽原；α-胎兒蛋白、岩藻醣基化胎球蛋白-A及岩藻醣基化原血紅素結合素；α-胎兒蛋白、岩藻醣基化胎球蛋白-A及岩藻醣基化激肽原；α-胎兒蛋白、岩藻醣基化α-1抗胰蛋白酶及岩藻醣基化激肽原；以及α-胎兒蛋白、岩藻醣基化α-1抗胰蛋白酶、岩藻醣基化胎球蛋白A及岩藻醣基化激肽原。 可根據本發明方法使用用於測定生物標記物之各別量之任一可接受製程。可使用習用技術(例如免疫分析)檢測總蛋白質生物標記物(例如總α-胎兒蛋白)。在生物標記物發生醣基化時，檢測試劑可直接標記醣基部分，例如經由碳水化合物特異性化學物質或染料或經由經標記凝集素、經標記碳水化合物結合蛋白或經標記抗體。檢測試劑可為二級試劑，例如藉由首先捕獲靶分析物且然後使捕獲試劑-靶複合物與經標記二級試劑接觸。在一些實施例中，可藉由在可量化地檢測醣基化之前分離醣基部分與蛋白質來進行檢測及量化。在其他實施例中，可在可量化地檢測醣基化之前自生物流體分離醣蛋白。該等方式及其他方式闡述於2012年4月10日提出申請之美國公開案第2012/0196277號中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。在使用凝集素檢測醣基化蛋白質時，凝集素可為野生型，或可為對所關注特定聚糖擁有增強之結合親和力之重組凝集素。舉例而言，2012年2月3日提出申請之美國公開案第2015/0198610號(以引用方式併入本文中)揭示各種特徵在於對核心岩藻醣基部分具有增強之結合之重組橙黃網胞盤菌(
Aleuria aurantia
)凝集素，該等凝集素已知以較大程度存在於患有肝細胞癌之個體之醣蛋白上(與不患有該疾病之個體之醣蛋白相比)。 可使用動力學基於AST及ALT之各別酶促活性之分析且使用比色、分光光度、化學發光、層析、螢光或UV吸光度、放射化學及電化學檢測技術來測定ALT及AST之各別量。熟習此項技術者熟知該等分析及技術。 根據本發明方法，確定個體之年齡及性別。可視需要以年、月或日形式來表示個體年齡。先前已展示，年齡及性別代表患有肝細胞癌個體之相關因素(參見Wang, M.等人， Proceedings. IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine 2012；Wang, M.等人，BMC Medical Genomics, 2013, 6增刊3: S9)。 在量測特定生物標記物之各別量且確定個體之年齡及性別後，使用所確定年齡及性別及生物標記物之各別量測量之函數之最佳化輸出來測定肝細胞癌之不存在或存在。舉例而言，該函數可包括所確定年齡及性別及生物標記物之量測量之各別最佳化加權係數。可使用適當統計學方法來鑑別年齡、性別及生物標記物量之最佳化函數。舉例而言，可針對每一期望因子組(亦即生物標記物、年齡及性別)使用邏輯式回歸以生成邏輯式回歸算法。為判斷每一回歸之適合度，可導出以下之一或多者：AIC、R
2
、Dxy、似然比測試、皮爾森擬合優度(Pearson’s goodness-of-fit)、對數似然性、偏差統計學、τ-a、NRI及顯性驗證之ROC曲線下面積(AUC) (參見Steyerberg, E. (2009), 「Clinical Prediction Models」, Springer-Verlag New York)。自該等準則及測試，可選擇具有最高適合度之邏輯式回歸模式以進行進一步評估。視情況，為避免過度擬合，可應用留一法交叉驗證、引導程序驗證及三摺疊交叉驗證中之一或多者以驗證候選模型。 年齡、性別及生物標記物量之最佳化函數得到表示個體患有肝細胞癌之機率之值。根據本發明方法，該值可揭示個體患有臨床相關確定度之肝細胞癌。舉例而言，確定度可為約50%或更高、60%或更高、70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、約91%或更高、約92%或更高、約93%或更高、約94%或更高、約95%或更高、約96%或更高、約97%或更高或約98%或更高。因此，可使用本發明方法來測定個體是否患有極高確定度之肝細胞癌。 如本文中所使用，「檢測肝細胞癌」或「測定肝細胞癌之不存在或存在」可涵蓋檢測個體中通常不可藉由在本發明時已存在之方法檢測之類型或階段的肝細胞癌。舉例而言，可使用本發明所揭示方法、分析及套組來測定個體是否患有早期肝細胞癌、α胎兒蛋白陰性(AFP
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)肝細胞癌或早期肝細胞癌及α胎兒蛋白陰性(AFP
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)肝細胞癌(亦即早期及AFP
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HCC)。 「α胎兒蛋白陰性(AFP
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)肝細胞癌」係指特徵並不在於AFP含量自不患肝病之個體中所發現之AFP含量顯著變化之疾病。舉例而言，在來自個體之生物試樣中之AFP量小於約20 ng/mL時，則個體可視為AFP
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。 顯著地，本發明中(例如在表3A及3B中)所提供之數據顯示，本發明所揭示方法、分析及套組能夠提供可藉此檢測個體之早期及/或α胎兒蛋白陰性肝細胞癌之系統。適當治療可如下所述。本發明標的物之此態樣之高臨床顯著性程度對於熟習此項技術者顯而易見，尤其考慮到早期肝細胞癌可治癒(而晚期疾病通常僅適用於姑息性護理)。不同於本發明所揭示標的物，用於檢測肝細胞癌之先前系統不能檢測早期肝細胞癌、α胎兒蛋白陰性(AFP
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)肝細胞癌或早期肝細胞癌及α胎兒蛋白陰性(AFP
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)肝細胞癌。 因此，本發明亦提供包含治療或推薦治療個體之(具體而言)早期肝細胞癌、α胎兒蛋白陰性肝細胞癌或早期肝細胞癌+ α胎兒蛋白陰性肝細胞癌之方法。該等方法可輔助本發明所揭示方法來檢測肝細胞癌，或可為使用本發明所揭示分析及套組之結果。可由開業醫師鑑別針對早期肝細胞癌、α胎兒蛋白陰性肝細胞癌或早期肝細胞癌+ α胎兒蛋白陰性肝細胞癌進行特定調整之適當治療。
一
實例性方法可包括：自來自懷疑患有早期肝細胞癌、AFP陰性肝細胞癌或二者之個體之生物流體去除IgG及IgM蛋白質；量測生物流體中之一或多種生物標記物之量；確定個體之年齡及性別；使用所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出來測定個體中早期肝細胞癌、AFP陰性肝細胞癌或二者之不存在或存在；及倘若測得在個體中存在早期肝細胞癌、AFP陰性肝細胞癌或二者，則治療個體或推薦治療個體，其中特定選擇該治療以用於治療早期肝細胞癌、AFP陰性肝細胞癌或二者。可根據先前所揭示用於檢測肝細胞癌之不存在或存在之方法之相應態樣來實施該等方法中涉及以下各項之態樣：自生物流體去除IgG及IgM蛋白質，量測生物流體中之一或多種生物標記物之量，確定個體之年齡及性別，及使用所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出測定之疾病不存在或存在。 亦揭示用於檢測個體之肝細胞癌之分析，其包括：量測生物流體中之一或多種生物標記物之量，其中在量測步驟之前該分析利用試劑自個體之生物流體去除IgG及IgM蛋白質；確定個體之年齡及性別；及使用所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出來測定個體中肝細胞癌之不存在或存在。 用於自生物流體去除IgG之試劑可為蛋白質A/G。在其他實施例中，該試劑可為蛋白質L。如本文關於本發明所揭示分析、方法及套組所使用，用於去除IgM之「試劑」可為實驗室設備或機械系統之物件。舉例而言，用於去除IgM之試劑可為基於分子量之過濾器或過濾系統。舉例而言，可藉由基於重力或離心之過濾來實施過濾。在其他實施例中，用於去除IgG及IgM之試劑可為聚乙二醇，其非限制性實例包含PEG-400、PEG-3350、PEG-4000、PEG-6000及PEG-8000。 可根據本發明分析使用各種不同分析形式中之任一者以定量檢測一或多種生物標記物。免疫分析係一種較佳分析，且包含(但不限於) ELISA、放射免疫分析、競爭分析、西方印漬、珠粒團聚分析、側向流動免疫分析、免疫層析測試條、浸漬片、遷移形式免疫分析及諸如此類。熟習此項技術者已知其他適宜免疫分析。亦使用顯微術。在一些實施例中，層析代表所選分析形式。高效液相層析(HPLC)尤佳。在一些實施例中，質譜係較佳分析。在一些實施例中，使用凝膠電泳與密度測定之組合作為分析形式。 分析之一般形式可涉及使適當試劑與含有所關注分析物(亦即生物標記物，其可與發現於試樣中之其他組份區別開來)之測試試樣接觸。試樣可為來自個體之生物流體，或可為源自生物流體之單獨試樣。在使分析物與試劑相互作用後，可洗滌系統且然後直接檢測或藉助二級試劑進行檢測。 在一些實施例中，將用於檢測生物標記物之試劑固定於固體載體上。在其他較佳實施例中，將測試試樣或自測試試樣分離或純化之分子(例如轉譯後修飾多肽)固定於固體載體上。用於純化來自試樣之生物分子(例如細胞、組織或生物流體)之技術在業內已眾所周知。所選技術可隨所檢驗組織或試樣而變化，但業內熟知使適當純化程序與測試試樣源相匹配。 適宜固體載體之實例包含(但不限於)玻璃、塑膠、金屬、乳膠、橡膠、陶瓷、聚合物(例如聚丙烯、聚二氟亞乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯及聚丙烯醯胺)、右旋糖酐、纖維素、硝基纖維素、pvdf、耐綸、澱粉酶及諸如此類。固體載體可為平坦、凹陷或凸出、球形、圓柱形及諸如此類之形式，且可為顆粒、珠粒、膜、絲條、沈澱物、凝膠、薄片、容器、孔、毛細管、膜、板、載玻片及諸如此類。固體載體可為磁性或管柱。 可根據上文針對本發明方法所闡述用於檢測個體之肝細胞癌之任一態樣來實施本發明分析之其他態樣，包含以下步驟：量測生物流體中之一或多種生物標記物之量，確定個體之年齡及性別；及使用所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出來測定個體中肝細胞癌之不存在或存在。 本發明亦係關於用於檢測個體之肝細胞癌之套組，其包括：用於自來自個體之生物流體去除IgG蛋白質之試劑及用於自生物流體去除IgM蛋白質之試劑；用於分別量測生物流體中之一或多種生物標記物之試劑；及使用隨所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物而變化之最佳化輸出來測定個體中肝細胞癌之不存在或存在的說明書。 用於自生物流體去除IgG之試劑可為蛋白質A/G。在其他實施例中，該試劑可為蛋白質L。用於自生物流體去除IgM之試劑可為基於分子量之過濾器，例如1000 kD過濾器、900 kD過濾器、800 kD過濾器、500 kD過濾器、450 kD過濾器、400 kD過濾器、350 kD過濾器、300 kD過濾器、250 kD過濾器、200 kD過濾器、175 kD過濾器、150 kD過濾器、125 kD過濾器、100 kD過濾、an 80 kD過濾器、75 kD過濾器、70 kD過濾器、60 kD過濾器、50 kD過濾器、40 kD過濾器、30 kD過濾器、25 kD過濾器、20 kD過濾器、15 kD過濾器或10 kD過濾器。過濾可(例如)藉由重力或離心來達成。 在某些實施例中，用於去除IgG之試劑及用於去除IgM之試劑可相同。此種類之一實例性實施例係聚乙二醇。 在生物標記物係多肽(例如醣蛋白)時，用於量測生物流體中之一或多種生物標記物之試劑可利用多肽含有一或多種轉譯後修飾(例如醣基化)之事實。可藉由檢測某一多肽-部分複合物來檢測轉譯後修飾。在另一較佳實施例中，可藉由分離多肽及部分且檢測該部分來檢測轉譯後修飾。可使用特異性識別該部分、特定種類部分或部與多肽之複合物之試劑來檢測多肽-部分複合物。熟習此項技術者應明瞭適宜檢測試劑，其非限制性實例闡述於下文中。該試劑可包括多個分子，每一分子對不同靶部分具有特異性，由此產生多個試劑-靶相互作用。 用於檢測生物標記物之試劑可為抗體。舉例而言，任一特異性結合至所關注靶部分之抗體可用於本發明套組中。可使用單株及/或多珠抗體(不論係何種來源所產生)及重組抗體，例如單鏈抗體及噬菌體展示抗體以及嵌合及人類化抗體。亦可使用抗體之抗原結合片段，例如Fab或Fv。 在一些實施例中，用於檢測生物標記物之試劑係特異性識別醣蛋白之抗體。較佳地，抗體特異性識別碳水化合物部分(包含單醣及多醣)。在一些情況下，抗體特異性識別岩藻醣部分(例如核心岩藻醣基部分)。已闡述能夠特異性識別岩藻醣之抗體。例如參見Roy SS等人， (2002) Ann. Bot. 89:293-9；及Srikrishna G等人，(1998) Glycobiology 8:799-811。或者，抗體亦可募集至不同部分(包含岩藻醣)且用於本發明中。募集及純化抗體之方法在業內已眾所周知。另外，可藉由業內已知之任一數量技術來製備單株抗體，包含最初由Kohler及Milstein (1975) Nature 256:495-497研發之技術。 亦可使用擁有碳水化合物識別結構域之其他蛋白質作為用於檢測生物標記物之試劑。已闡述具有碳水化合物識別結構域之蛋白質，例如參見Bouyain S等人，(2002) J. Biol. Chem. 277:22566-72 (識別岩藻醣之黑腹果蠅(
Drosophila melanogaster
)蛋白CG2958)。
在一
尤佳實施例中，使用凝集素作為用於檢測生物標記物之試劑。可來自任一有機體(包含植物、動物、酵母、細菌、原生動物及諸如此類)獲得凝集素。純化凝集素市面有售，例如參見Sigma-Aldrich目錄(St. Louis, MO)。藉由熟習此項技術者熟知之方式，凝集素亦可自其天然來源分離，或以重組方式表現並純化。凝集素可但未必對特定碳水化合物部分具有特異性。已闡述岩藻醣特異性凝集素。例如參見Mansour MH等人(2005) Immunobiology. 210:335-48；Amano K等人 (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:2277-9；Loris R等人(2003) J. Mol. Biol. 331:861-70；及Ishida H等人(2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:1002-8。2012年2月3日提出申請之美國公開案第2015/0198610號(其以引用方式併入本文中)揭示特徵在於對核心岩藻醣基部分具有增強之結合之各種重組橙黃網胞盤菌凝集素。預計將來所鑑別或研發之凝集素適於用作用於檢測本發明之一或多種生物標記物之試劑。 具有凝集素樣結構域之蛋白質亦適於用作用於檢測一或多種生物標記物之試劑。業內已知具有凝集素樣結構域之蛋白質。例如參見Drickamer K (1999) Curr. Opin. Struct. Biol. 9:585-90。 亦可使用關於凝集素之基於核酸之替代物。該等試劑(稱為適配體)利用單鏈核酸之巨大構象撓性。自隨機化短核酸之較大集合，藉由迭代選擇來分離對諸多非核酸配體具有高親和力之個別分子。結合聚糖之「萊克塔姆(lectamer)」試劑之優點在於，浸出DNA不可能混擾或干擾下游分析。萊克塔姆可在均勻結合條件(pH、離子強度)下發揮作用。可以各種衍生形式(例如末端生物素化)來製備合成核酸。靶聚糖並不受限於現有凝集素特異性，從而顯著擴展現有分級分離及分析能力。 可使用可檢測部分直接標記用於檢測生物標記物之試劑。或者，使用特異性識別經可檢測部分標記之一級試劑之二級試劑。二級試劑可為任一分子，例如抗體。使用可檢測部分標記二級試劑。涵蓋用於本發明中之可檢測部分包含(但不限於)放射性同位素、螢光染料(例如螢光黃、藻紅蛋白、Cy-3、Cy5、別藻藍蛋白、DAPI、德克薩斯紅(Texas red)、玫瑰紅、俄勒岡綠(Oregon green)、螢蝦黃及諸如此類)、綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、青色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、角海葵(Cerianthus)橙色螢光蛋白、鹼性磷酸酶、β-內醯胺酶、氯黴素乙醯基轉移酶、腺苷去胺酶、胺基醣苷磷酸轉移酶(neor、G418r)、二氫葉酸還原酶、潮黴素-B-磷酸轉移酶、胸苷激酶、lacZ (編碼α-半乳糖苷酶)及黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、胎盤鹼性磷酸酶、分泌型胚胎鹼性磷酸酶或螢火蟲或細菌螢光素酶。使用酶標籤以及其同族受質。對於與實踐本發明有關之其他標準程序而言，熟習此項技術者知曉可使用之其他標記。在一些實施例中，使試劑或二級試劑偶合至生物素，且與具有可檢測部分標籤之抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)接觸。 在一些實施例中，可直接標記及檢測藉由轉譯後修飾附接至多肽生物標記物之部分，由此無需特異性識別特定部分之經標記試劑之需要且無需任何經標記二級試劑。出於本發明目的，生物標記物之檢測涵蓋檢測藉由轉譯後修飾附接至生物標記物之部分。在一些實施例中，可使藉由轉譯後修飾附接至生物標記物之部分與生物標記物分離且直接標記及檢測。舉例而言且並不加以限制，可使用業內已知之各種方法直接標記碳水化合物及碳水化合物部分。碳水化合物及碳水化合物部分標記套組市面有售。亦可對碳水化合物及碳水化合物部分實施生物素化且使用抗生物素蛋白-或鏈黴抗生物素蛋白偶聯之可檢測部分(例如本文所闡述者)進行標記。可直接標記寡醣之試劑之非限制性實例包含2-胺基苯甲醯胺及2-胺基苯甲酸。 可藉由業內適宜之任一方式來分離轉譯後附接部分與多肽生物標記物，包含以化學方式(例如藉由使用肼或酸(例如氫氟酸或三氟甲烷磺酸)進行處理)、以酶促方式(例如藉由使用N-醣苷酶(例如PNGase F)、O-醣苷酶、內切糖苷酶或外切糖苷酶進行處理)或藉由物理方式。存在用於去除轉譯後修飾(包含去醣基化)之市售套組。化學鹼(例如肼)或引起β-消除之化學試劑反應亦可用於去醣基化反應中。其他技術及試劑為熟習此項技術者所瞭解，且涵蓋於本發明範圍內。 在一些實施例中，在標記或檢測之前純化經分離之先前轉譯後附接部分。可使用業內已知之固相或液相萃取技術來純化經分離部分以用於進一步分析 如上所述，可使用習用技術(例如免疫分析)來檢測總蛋白質生物標記物(例如總α-胎兒蛋白)，且實踐該等技術所需之試劑可包含於本發明套組中。此同樣適用於使用比色、分光光度、化學發光、層析、螢光或UV吸光度、放射化學及電化學檢測技術之基於AST及ALT之各別酶促活性之動力學分析。 本發明套組包含用於使用所確定年齡及性別及生物流體中生物標記物之量測量之函數之最佳化輸出測定個體中肝細胞癌之不存在或存在的說明書。該函數可根據上文針對個體之檢測肝細胞癌之本發明方法所提供之闡述來提供。本發明亦提供可如何產生所確定年齡及性別及生物標記物之量測量之適當函數之具體實例。 本文亦提供將個體分配至具有較高或較低肝細胞癌機率之組之方法，其包括自來自個體之生物流體去除IgG及IgM蛋白質；量測生物流體中之一或多種生物標記物之量；確定個體之年齡及性別；及基於所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出將個體分配至具有較高或較低肝細胞癌機率之組。 如上文根據本發明所揭示檢測個體之肝細胞癌之方法所提供，年齡、性別及生物標記物量之最佳化函數得到伴隨個體患有肝細胞癌之機率之值。該值可揭示，個體患有約90%或更高、約91%或更高、約92%或更高、約93%或更高、約94%或更高、約95%或更高、約96%或更高、約97%或更高或約98%或更高之確定度之肝細胞癌。根據將個體分配至具有較高或較低肝細胞癌機率之組之本發明方法，可針對最佳化函數所得到之值是否應確保將個體分配至具有較高或較低肝細胞癌機率之組而作出臨床適當決定。舉例而言，在由年齡、性別及生物標記物量之最佳化函數得到之值指示個體患有肝細胞癌且與該函數有關之確定度在臨床上顯著時，可將個體分配至「較高機率」組。舉例而言，確定度可為至少50%更高、至少60%更高、至少65%更高、至少70%更高、至少75%更高、至少80%或更高、至少82%或更高、至少84%或更高、至少85%或更高、至少86%或更高、至少88%或更高或至少90%或較高。技術熟練之病理學家(與生物統計學家、生物資訊專家及諸如此類聯合)可應用適當統計學方法來確定由年齡、性別及生物標記物量之特定最佳化函數得到之值是否可保證將個體分配至具有較高或較低肝細胞癌機率之組。 本發明亦提供管控懷疑患有肝細胞癌之個體之治療之方法，其包括：自來自個體之生物流體去除IgG及IgM蛋白質；量測生物流體中之一或多種生物標記物之量；確定個體之年齡及性別；及基於所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之函數之最佳化輸出來治療個體，其中在基於該函數之輸出確定個體患有疾病時針對肝細胞癌來治療個體。 在應用適當統計學評價後，在所確定年齡及性別及個體之生物流體中之所量測生物標記物之最佳化函數的輸出指示在個體中存在肝細胞癌時，可根據本發明方法對個體實施治療。在個體無症狀時，本發明方法有利地允許開始考慮個體之肝細胞癌之早期之治療方案。可根據公認醫學實踐來治療早期肝細胞癌。在根據本發明方法確定個體未患肝細胞癌時，可治療個體之可適用之任一替代或前體病狀。舉例而言，在個體懷疑患有肝細胞癌時，個體可能已經已知顯示或隨後發現患有(例如因藉由肝細胞癌之陰性診斷所誘發之測試)常見風險因素中之任一者，例如酒精中毒、肝炎B或肝炎C、黃麴毒素、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎、血色素沉著症、威爾森氏症(Wilson's disease)、類型2糖尿病、NASH (非酒精性脂肪性肝炎)或血友病。可根據如由熟習此項技術者所確定之適當措施來治療代表肝細胞癌之風險因素之任一或多種病狀。另外，若測得個體並未患有肝細胞癌，則可詢問個體以用於週期性監測，該週期性監測可包含在一或多個將來時刻測試個體之肝細胞癌。出於本發明方法之目的，「治療」可涵蓋對個體實施週期性監測以證實在最初確定個體並不患有肝細胞癌後個體是否發生肝細胞癌。舉例而言，根據本發明方法，基於所確定年齡及性別及生物流體中之所量測生物標記物之最佳化函數之輸出確定個體並未患有肝細胞癌，可測試個體之一或多種額外發作以測定個體是否隨後發生肝細胞癌。額外測試可發生於(例如)在肝細胞癌之初始陰性診斷之後兩個月、三個月、6個月、8個月、一年、18個月、兩年、30個月或三年，且舉例而言每三個月、每6個月、每一年、每18個月、每兩年、每30個月、每三年、每４年或每5年實施，直至發現個體患有肝細胞癌為止。額外測試可根據檢測個體之肝細胞癌之本發明方法來進行。
實例
陳述下列實例以向熟習此項技術者提供可如何研發及評估本文所主張方法、套組及分析之完整揭示內容及說明，且該等實例僅意欲例示本發明且並不意欲限制發明者所認為其發明之範圍。已努力確保數值(例如量)之準確性，但應慮及一些誤差及偏差。
實例 1 - 臨床數據之分析及 HCC 預測物之鑑別
使用來自兩個臨床小組之數據來研發本發明預測物：一個小組係由115名HCC患者及93名肝硬化患者(肝功能測試數據可用於此小組)組成，且另一小組係由66名HCC患者、38名肝硬化患者(肝功能測試數據不可用於此小組)組成。 採用24種特徵選擇算法來探究每一潛在組組份(血清生物標記物；患者人口統計學因素)及組合。所應用之特徵選擇算法包含：相關性特徵選擇過濾(cfs過濾)、卡方過濾(Chi-squared filter)、基於一致性之過濾、線性相關性過濾、等級相關性過濾、資訊增益過濾、資訊比率過濾、系統不確定性、窮盡搜尋算法、向前貪婪搜尋、向後貪婪搜尋、爬山搜尋、oneR算法、隨機森林過濾、具有3個相鄰者(neighbor)之減壓過濾、具有5個相鄰者之減壓過濾、逐步邏輯式回歸、逐步懲罰邏輯式回歸、懲罰svm、bestglm (bic)、bestglm (aic)、穩健邏輯式回歸、用於GLM之貝氏分數多項式(Bayesian fractional polynomial for GLM，glmBfp)及貝氏模型平均法(Bayesian Model Average，BMA)。隨後，對預測物之子組(其係由24種特徵選擇算法所提供)應用邏輯式回歸。存在21種選自特徵選擇算法及購物籃分析之子組特徵。為此，將全部預測物及AFP添加至所論述子組中，且自此構建23種邏輯式回歸算法。為判斷每一回歸之適合度，發明者導出AIC、R
2
、Dxy、似然比測試、皮爾森擬合優度、對數似然性、偏差統計學、τ-a、NRI及顯性驗證之ROC曲線下面積(AUROC)。自該等準則及測試，選擇4種具有最高適合度之邏輯式回歸模式以進行進一步評估。為避免過度擬合，應用留一法交叉驗證、引導程序驗證及三摺疊交叉驗證以驗證4種候選模型。 評價以下14種生物標記物、臨床及人口統計學變量：丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、膽紅素(BIL)、白蛋白(ALB)、血小板(PLT)、鹼性磷酸酶(ALK)、白血球(WBC)、α-胎兒蛋白(AFP)、岩藻醣基化A1AT、岩藻醣基化低分子量(LMW)激肽原、岩藻醣基化胎球蛋白A、岩藻醣基化原血紅素結合素、年齡及性別。AFP值分佈於寬範圍中(1 ng/ml至347,000 ng/ml)且實施對數轉變以用於進一步分析。因剩餘因素之數據分佈不影響統計學分析及算法探究，故使用原始數據形式。 初步分析指示，AFP、ALK、AST、年齡及雄性性別與HCC機率正有關。在HCC組中具有高雄性比率，其中勝算比為1.75，
2
=5.36，df=1，p=0.02056。已發現，包含AFP會得到用於區分HCC之超高AUROC值。在不存在岩藻醣基化生物標記物下使用AFP時，AUROC值自0.8016 (僅AFP)變化至0.9066 (包含4種其他因素(年齡、性別、ALK、ALT))。增加變量數量不會使AUROC發生改變以超過此值，從而表明需要包含新生物標記物以驅動檢測。 為此
，
評估含有各種生物標記物之組。AFP、岩藻醣基化低分子量(LMW)激肽原、岩藻醣基化A1AT、年齡及性別之組合得到0.9405之AUROC。添加AST及ALK會使AUROC增加至0.9835。刪除岩藻醣基化A1AT會將AUROC適當減小至0.9826。該由岩藻醣基化LMW激肽原、AFP、AST、ALK、年齡及性別組成之後一最小組產生下文之算法A，且用於生成圖1A-1C中所展示之患者子組數據(藉由早期及AFP陰性疾病)。
算法 A 圖1A-1C繪示由岩藻醣基化低分子量激肽原、α-胎兒蛋白、天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALK)、年齡及性別組成之組之評估結果。在HCC及肝硬化患者之一至三個不同小組內評估該組。三個患者小組分別具有下表1中所闡述之特性：
表 1
在用於生成圖1中數據之群體中，HCC病因係61% HCV、6% HBV及33%其他，且肝硬化病因係48% HCV、10% HBV及42%其他。 圖1A匯總用於區分以下疾病之接受者操作特徵曲線下面積(AUROC)之數據：患有HCC之所有患者(N=115)與患有肝硬化(N=93)之所有患者；早期HCC (N=69)與肝硬化(N=93)；AFP陰性HCC (N=39)與AFP陰性肝硬化(N=84)；以及早期及AFP陰性HCC (N=29)與AFP陰性肝硬化(N=84)。95%置信區間(CI)在所有情形下皆不重疊。圖1B匯總用於區分相同研究中之相同各別患者組之90%特異度截止值下之靈敏度值，且圖1C匯總用於區分相同研究中之相同各別患者組之95%特異度截止值下之靈敏度值。 如上所述，將AST及ALK納入研發模型中會將AUC自0.9405增加至0.9835。納入該兩種臨床變量出人意料地補償包含一種岩藻醣基化生物標記物(在此情形下係岩藻醣基化A1AT)之需要：在將AST及ALK添加至方程式中且自算法去除岩藻醣基化A1AT時，AUC保持於0.9826，從而表明高度預測性基本模型納入年齡、性別、激肽原、ALK及AST。 先前工作將岩藻醣基化胎球蛋白-A及岩藻醣基化原血紅素結合素鑑別為肝細胞癌之極良好個別指示物(Comunale, MA,等人，J. Proteome Res. 2009；8；595-602)。針對該等個別岩藻醣基化生物標記物對亦包含年齡、性別及AFP (log)之組之貢獻實施評價。採用下文所展示之算法B來測試包含岩藻醣基化胎球蛋白-A及岩藻醣基化原血紅素結合素之組：
算法 B 使用
另一
算法實施相同組成員(組4，展示於下表2中)之單獨測試，且得到0.8461之AUC。在原血紅素結合素由激肽原代替時(表2中之組5b)，AUC增加至0.8661。 包含年齡、α胎兒蛋白及其他指定生物標記物之組之評價結果之匯總提供於下表2中。
表 2
下表3A及3B提供下列患者在所指示固定特異度以及正(LR+)及負(LR‒)似然比下用於根據1號組(如上表2中所展示)進行區分之AUROC (95%置信區間)、靈敏度(95%置信區間)：(1) HCC (N = 115)與肝硬化(N = 93)；(2)早期HCC (UNOS T1/2；N = 69)與肝硬化(N = 93)；(3) AFP陰性HCC (＜ 20 ng/mL；N = 39)與AFP陰性肝硬化(＜ 20 ng/mL；N = 84)；及(4)早期(UNOS T1/2)及AFP陰性HCC (＜ 20 ng/mL；N = 29)與AFP陰性肝硬化(＜ 20 ng/mL；N = 84)。[HCC病因(%) = HCV (61)；HBV (6)；其他(33)；HCC性別(M/F%) = 73/27；肝硬化病因(%) = HCV (48)；HBV (10)；其他(42)；肝硬化性別(M/F%) = 51/49]。該等數據係使用直接自算法A獲得之HCC組評分(P值)所獲得。
表 3A 表 3B
下表4A及4B提供下列患者在所指示固定特異度下用於根據11號組(如上表2中所展示)進行區分之AUROC (95%置信區間)及靈敏度(95%置信區間)：(1) HCC (N = 115)與肝硬化(N = 93)；(2)早期HCC (UNOS T1/2；N = 69)與肝硬化(N = 93)；(3) AFP陰性HCC (＜ 20 ng/mL；N = 39)與AFP陰性肝硬化(＜ 20 ng/mL；N = 84)；及(4)早期(UNOS T1/2)及AFP陰性HCC (＜ 20 ng/mL；N = 29)與AFP陰性肝硬化(＜ 20 ng/mL；N = 84)。[HCC病因(%) = HCV (61)；HBV (6)；其他(33)；HCC性別(M/F%) = 73/27；肝硬化病因(%) = HCV (48)；HBV (10)；其他(42)；肝硬化性別(M/F%) = 51/49]。該等數據係使用算法A (只是AST值由ALT值代替)及三摺疊交叉驗證所獲得。
表 4A 表 4B
在整體評審數據後，出人意料地，有助於最高表現組之變量往往係作為以個體計之肝細胞癌指示物最低效之變量。舉例而言，原血紅素結合素在單獨使用時得到最高AUC值(在患者組b中為0.8695)，且A1AT (患者組a)、AFP (患者組a)及激肽原(患者組a)在單獨使用時得到最低AUC值(分別為0.7395、0.8346及0.8192)，但後者較含有原血紅素結合素者有助於較高表現組。自該等數據得出，不可能基於生物標記物測定肝細胞癌之存在之個別能力來預測特定生物標記物對組之貢獻。 該數據亦揭示所測試組允許檢測早期肝細胞癌、AFP陰性肝細胞癌及早期肝細胞癌+ AFP陰性肝細胞癌之能力。
實例 2 - 作為分析污染物之 IgG 及 IgM 之鑑別
用於檢測肝細胞癌之基於板之分析通常受阻於異嗜性抗體及可能其他凝集素結合污染物之存在。該等污染物已知會引起假陽性結果。實施研究以鑑別存在於彼等肝硬化及肝癌患者之血清中之污染性凝集素反應性因子。如下文所闡述，本發明之發明者將IgM鑑別為污染性凝集素反應性因子，且在凝集素-ELISA之前自血清去除IgM時，可檢測到特定蛋白質相關性凝集素反應性信號。將此方法用於兩個獨立試樣組中以驗證方法且亦驗證岩藻醣基化糖型作為肝細胞癌之生物標記物之性能。
方法
自每一測試個體之血液獲得血清試樣，且獲得患者群體之人口統計學及臨床資訊。在研究中招募連續HCC患者及在年齡、性別及民族/種族上與HCC患者匹配之肝硬化患者。藉由組織病理學(包含所有T1病灶)及(若組織病理學不可用)藉由兩種成像方式(超音波、磁共振成像或電腦化斷層攝影術，其展示＞ 2 cm之血管增強團塊)來診斷HCC。肝硬化之診斷係基於肝功能代償不全或門靜脈高血壓之肝組織學或臨床、實驗室及成像證據。每一肝硬化患者具有正常超音波，且若血清AFP升高，則在招募之前三個月內之肝MRI及在招募之後6個月時之另一MRI未展示肝團塊。在招募之後追蹤肝硬化對照12個月之中值時間(範圍：7-18個月)，且無人發生HCC。使用用於HCC之器官分享聯合網絡改進之TNM分期系統來測定腫瘤分期。將早期HCC定義為T1 (直徑＜ 2 cm之單一病灶)及T2 (直徑介於2 cm與5 cm之間之單一病灶；或＜ 3個病灶，每一病灶之直徑＜ 3 cm)病灶，此符合用於美國之肝移植之準則。自每一個體抽取20-ml血樣，旋轉，等分，且將所得血清儲存於-80℃下直至測試。在開始HCC治療之前抽取血樣。使用市售免疫分析利用增強之化學發光來測試AFP。
凝集素 FLISA
簡言之，為去除捕獲抗體(小鼠抗人類AAT或兔抗胎球蛋白，AbD Serotec, Raleigh, NC)之岩藻醣基化，將抗體與10 mM過碘酸鈉一起在4℃下培育1小時。添加等體積乙二醇且使用pH 9.5碳酸鈉緩衝液使經氧化抗體達到10 µg/mL之濃度。向板中添加抗體(5 µg/孔)且在培育後使用0.1% Tween 20/PBS 7.4洗滌並使用3% BSA/PBS阻斷過夜。對於分析而言，在95 µl Heterophilic Blocking Tubes ™(Scantibodies Laboratory, Inc., Santee, CA)中稀釋5 µl血清且在室溫下培育1小時。隨後，將試樣添加至板中保持2小時且在凝集素培育緩衝液(10 mM pH 8.0 Tris、0.15 M NaCl、0.1% Tween 20)中洗滌5次，然後使用生物素偶聯至橙黃網胞盤菌(AAL)凝集素(Vector實驗室，Burlingame, CA)檢測岩藻醣基化蛋白質。使用IRDye™ 800偶聯之鏈黴抗生物素蛋白檢測所結合凝集素且使用Odyssey®紅外成像系統(LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE)量測信號強度。在所有情形下，將信號強度與使用在商業上購買之人類血清(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)檢測之信號進行比較。應注意，凝集素-FLISA檢測存在於來自每一患者試樣之等量捕獲分子上之岩藻醣基化之量，且係以獨立於任一給定患者中之蛋白質總量之方式來實施。
污染因素之蛋白組學鑑別 凝集素 - 西方印漬
使用經蛋白質A/G塗覆之瓊脂糖珠粒使血清消耗IgG且使用經單株抗A1AT (AbD Serotec, Raleigh, NC)塗覆之磁Dynabeads® (Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA)對A1AT實施免疫沈澱。隨後，洗脫A1AT且經由SDS-PAGE進行解析。使用生物素偶聯之橙黃網胞盤菌凝集素(AAL)檢測岩藻醣基化A1AT。使用IRDye™ 800偶聯之鏈黴抗生物素蛋白觀察所結合AAL且使用Odyssey®紅外成像系統(LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE)量測信號強度。隨後，使用多珠抗A1AT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)檢測A1AT且使用IRDye™ 700偶聯之抗兔抗體檢測所結合抗體。 在40名患者(20名患有肝肝硬化且20名患有肝肝硬化及HCC)之小試樣組之先前分析中，凝集素-ELISA方法不能特異性檢測給定蛋白質之改變之岩藻醣基化。舉例而言，針對岩藻醣基化α-1-抗胰島素(A1AT)實施凝集素ELISA。在此方法中，將已經修飾以去除固有岩藻醣基化之A1AT之抗體塗覆至96孔板之底部。添加使用蛋白質A/G消耗IgG之血清，且使用重組橙黃網胞盤菌凝集素(AAL)檢測所捕獲A1AT之岩藻醣基化程度。在使用HCC血清進行此一分析時，觀察到凝集素反應性信號。然而，不可能使用非岩藻醣基化A1AT獲得此信號，即使在非岩藻醣基化A1AT已結合至捕獲抗體時。另外，使用非特異性抗體(例如AFP陰性患者中之AFP)會產生相同非特異性信號。試樣在分析之前之胰蛋白酶消解證實，信號係基於蛋白質。
作為潛在污染物之 IgM 之鑑別
為視圖鑑別發現於血清中之非特異性凝集素反應性材料，在96孔板中針對A1AT實施凝集素ELISA。使用與正常凝集素ELISA相同之條件將板與血清一起培育，但在添加凝集素之前，將試樣與SDS裂解緩衝液一起培育，且經由SDS-PAGE及使用結合岩藻醣之凝集素藉由膠質考馬斯亮藍染色(colloidal coomassie brilliant blue staining)之凝集素印漬或藉由針對人類A1AT之存在進行印漬來檢驗試樣。觀察到強凝集素染色且具有約80 kD之帶，且觀察到50 kD之較弱帶。儘管在使用膠質考馬斯亮藍進行染色及藉由使用A1AT抗體進行染色亦觀察到50 kD帶，但經由使用膠質考馬斯亮藍進行染色或藉由A1AT凝集素印漬觀察不到約80 kD帶。此表明，該等試樣中之非特異性凝集素反應性材料係高度岩藻醣基化之80 kD醣蛋白。隨後，在ELISA捕獲後收集以相同方式處理之孔且在使用胰蛋白酶消解後以蛋白組學方式進行檢驗。該等試樣中所鑑別之醣蛋白之列表展示於下表5中，且觀察以下兩種大小類似於凝集素印漬中所觀察者之主要蛋白質：補體B及IgM重鏈。
表 5
隨後，使用抗補體B及抗IgM抗體重複上述相同凝集素ELISA實驗。儘管在使用抗補體B抗體之捕獲材料中並無染色，但免疫印漬展示，發現於該等試樣中之80 kD凝集素反應性材料係IgM重鏈。80kD帶代表指示整個IgM分子之IgM重鏈。總而言之，每一IgM分子具有10條重鏈。 為自血清試樣去除自然IgM，研發一定方法以在凝集素-ELISA分析之前自血清去除此材料。最初，使用蛋白質L，但得到不滿意結果。隨後使用涉及以下步驟之方法：將血清與20 µl Pierce™蛋白質A/G Plus (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)一起培育一小時，隨後在100 kD旋轉過濾器中過濾混合物以在凝集素ELISA之前自血清去除IgG及IgM。在使用此方法時，自血清有效去除IgG及IgM，如藉由免疫印漬或藉由凝集素印漬所測定。隨後，在使用此方法去除IgM及IgG之後，可使用非岩藻醣基化A1AT阻斷凝集素反應性A1AT信號，從而證實以下發現：存在IgG及IgM可造成該等試樣中所觀察之污染信號。 使用凝集素-ELISA方法先前已失敗之小試樣組檢驗擬使用之此方法分析A1AT之岩藻醣基化糖型的能力。此組係由20名肝硬化患者及20名肝硬化背景之HCC患者組成。重要的是，在此組中，測定據展示凝集素反應性A1AT之凝集素-西方印漬數且用作用於凝集素-ELISA之黃金標準(Comunale, MA,等人，Proteomics Clin. Appl. 2013；7；690-700)且允許在使用及不使用過濾之凝集素-ELISA之性能之間進行對比。使用非過濾方法，肝硬化試樣之平均值為3.2 (±2.0)且HCC試樣為2.9 (±1.8)。在該等試樣中之凝集素反應性信號之間並無統計學差異(p=0.74)。此分析之AUROC為0.578。與之相比，使用本發明過濾方法，凝集素ELISA在肝硬化試樣中得到1.4 (±0.75)之平均值且在HCC試樣中為2.4 (±1.1)。此差異係統計學差異(P=0.0016)。在在過濾之前及過濾之後比較試樣時，在過濾之前及之後之肝硬化試樣之間具有統計學差異(p=0.0005)，但在過濾之前及之後於HCC試樣之間並無統計學差異(p=0.5249)。 在過濾之後HCC試樣與肝硬化試樣之間之對比的AUROC為0.788，此與藉由凝集素-西方印漬所觀察者幾乎相同(Comunale等人，2013)。重要的是，在凝集素-西方印漬與過濾後凝集素-ELISA之間具有高關聯程度。重要的是，對於過濾後凝集素-ELISA為陽性之每一試樣藉由凝集素-西方印漬展示為陽性，且藉由過濾後凝集素-ELISA展示為陰性之每一試樣藉由凝集素-西方印漬展示為陰性。 隨後使用此分析來評價80份獨立試樣中岩藻醣基化α-1抗胰蛋白酶及岩藻醣基化激肽原之存在。使用過濾凝集素-ELISA及非過濾凝集素-ELISA檢驗試樣。儘管非過濾分析在HCC試樣與對照試樣之間未獲得差異，但過濾分析獲得統計學顯著之差異。
用於去除 IgG 及 IgM 污染物之替代程序 。
研發替代方法以去除IgG及IgM，藉此將血清PEG-8000一起培育，離心，且在凝集素ELISA中分析上清液。舉例而言，為分析岩藻醣基化A1AT或岩藻醣基化胎球蛋白A，將2 µL血清添加至8 µL PBS中且隨後添加6 µL 40% PEG-8000水溶液直至最終PEG-8000濃度為15%。藉由抽取至移液管中並自移液管排出10-20次且然後簡單渦旋來混合試樣。接下來，在振盪機器上以1000-1500 rpm培育試樣30分鐘，且然後在緩慢振盪及4℃下繼續培育過夜。次日早上，在14,000 rpm及4℃下離心試樣，且將上清液迅速轉移至新管中，然後實施凝集素ELISA。使用類似於用於去除免疫球蛋白之原始程序之方法(例如藉由免疫浸漬或藉由凝集素印漬)來證實IgG及IgM去除效率。
2
=5.36，df=1，p=0.02056。已發現，包含AFP會得到用於區分HCC之超高AUROC值。在不存在岩藻醣基化生物標記物下使用AFP時，AUROC值自0.8016 (僅AFP)變化至0.9066 (包含4種其他因素(年齡、性別、ALK、ALT))。增加變量數量不會使AUROC發生改變以超過此值，從而表明需要包含新生物標記物以驅動檢測。 為此，
評估含有各種生物標記物之組。AFP、岩藻醣基化低分子量(LMW)激肽原、岩藻醣基化A1AT、年齡及性別之組合得到0.9405之AUROC。添加AST及ALK會使AUROC增加至0.9835。刪除岩藻醣基化A1AT會將AUROC適當減小至0.9826。該由岩藻醣基化LMW激肽原、AFP、AST、ALK、年齡及性別組成之後一最小組產生下文之算法A，且用於生成圖1A-1C中所展示之患者子組數據(藉由早期及AFP陰性疾病)。 算法 A 
圖1A-1C繪示由岩藻醣基化低分子量激肽原、α-胎兒蛋白、天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALK)、年齡及性別組成之組之評估結果。在HCC及肝硬化患者之一至三個不同小組內評估該組。三個患者小組分別具有下表1中所闡述之特性：表 1 
使用另一
算法實施相同組成員(組4，展示於下表2中)之單獨測試，且得到0.8461之AUC。在原血紅素結合素由激肽原代替時(表2中之組5b)，AUC增加至0.8661。 包含年齡、α胎兒蛋白及其他指定生物標記物之組之評價結果之匯總提供於下表2中。表 2 
