CN104711306B - 利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，包括下列步骤：瓜尔胶粉首先与β‑甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶充分混合；然后加入柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲溶液配制瓜尔胶与三种酶的混合液；瓜尔胶溶胀后，控制酶解温度及时间进行酶解。本发明实现了三种复合酶同时酶解，省略了单一酶依次降解后的纯化步骤，节约了生产时间和成本，提高了效率。实现了瓜尔胶高浓度下的酶解，并获得了低聚半乳甘露糖酶解液,节约了后续生产低聚半乳甘露糖时脱水、干燥的成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用复合酶法制备瓜儿胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，属于生物技术领域。
背景技术
瓜尔胶为大分子天然亲水胶体，由瓜尔豆胚乳部分加工而成。主要成分为半乳甘露聚糖，是一种天然的增稠剂和品质改良剂。外观为白色或微黄色的自由流动粉末，能溶于冷水或热水，遇水后形成胶状物质，达到迅速增稠的功效。半乳甘露聚糖的线性主链由通过β-(1-4)糖苷键连接在一起的甘露糖组成，α-(1-6)糖苷键形成连接半乳糖单元的分支点。低聚半乳甘露糖是半乳甘露聚糖的不完全降解产物，由2-10个半乳糖和甘露糖分子通过糖苷键聚合而成的低聚糖的总称，半乳糖和甘露糖的摩尔比约为1∶2。低聚半乳甘露糖不能被人体消化吸收，热量低，基本不增加血糖和血脂，但能显著增进人体肠道内以双歧杆菌和乳酸杆菌为代表的有益菌的增殖，具有调理肠道、提高免疫力的作用，具有膳食纤维的功效，是一种功能性益生元产品。
当前，利用瓜儿胶为原料，酶切降解制备低聚半乳甘露糖的方法存在如下问题。一是现有方法对瓜尔胶的酶解主要是采用β-甘露聚糖酶，但采用单一酶水解瓜尔胶的效率不高。虽然现有一些技术采用了复合酶降解植物多糖的方法，但由于每种酶分别进行降解，时间较长，酶解效率较低。二是在瓜尔胶酶解过程中，由于瓜尔胶溶液黏度过高，目前普遍采用的酶解瓜尔胶时的浓度为0.3-2％，得到的低聚糖的浓度较低，在进一步制备低聚半乳甘露糖粉剂时需要进行脱水干燥处理，这不仅增加了产物即低聚半乳甘露糖后续脱水、干燥的成本，也严重影响了工业化生产的效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种高浓度的瓜尔胶溶液复合酶解获得低聚半乳甘露糖酶解液的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
瓜尔胶粉首先与β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶充分混合，然后加入柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲溶液配制瓜尔胶与三种酶的混合液，瓜尔胶溶胀后，控制酶解温度及时间进行降解。
以上所述瓜尔胶粉与β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶的混和比例为：每克瓜尔胶粉加入β-甘露聚糖酶50～70U，内切葡聚糖酶1000～3000U，纤维二糖酶1000～2000U。
本发明提供的缓冲溶液为0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，pH值为6.0～6.6。
加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制的瓜尔胶溶液浓度为8～12％，溶胀时间为30～90min；溶胀温度为22-30℃。
溶胀完成后进入酶解阶段，本发明提供两种酶解方式。
一、瓜尔胶溶胀后采用单一温度酶解方式：酶解温度为50～55℃，时间为6～10h。
二、溶胀后采用温度梯度酶解方式，具体为：
(1)将温度从溶胀温度升高到35-40℃，酶解1.5-2.5h；
(2)将温度升高到48-53℃，酶解3-4h；升温过程中每3-5分钟升高1-2摄氏度，并且每升高1-2摄氏度保持10分钟；
(3)将温度升高到55℃，酶解2-3h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF)和高效液相色谱法(HPLC)测定酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比。MALDI-TOF质谱仪的参数设置：氮激光器波长337nm，采用延时引出和反射的工作方式，加速电压19.5kV，反射电压20kV，延时引出电压14.5～16.5kV，延时时间50～200ns，正离子检测。
HPLC参数设置：色谱柱NH2Column(416mm×250mm)，柱温30℃，流速1mL/min,进样量为20μL，流动相乙腈∶水＝75∶25。
通过测定，低聚半乳甘露糖占酶解液糖类质量组成成分的95％以上，单糖为0，聚合度为 2-10的低聚糖占95％～99％。
本发明所述的复合酶解方法的有益效果是：
1、瓜尔胶粉首先与β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶充分混合,避免了瓜尔胶溶胀后加入酶，因黏度过高而导致的混合不均。
2、实现β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶三种酶同时酶解，省略了每种酶依次降解后的纯化步骤，节约了生产时间和成本，提高了效率。
3、β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶三种酶的酶切特点各异，互为补充。酶解液糖类组成成分中，单糖为0，保证了低聚半乳甘露糖实现其益生元的有益效果；聚合度为2-10的低聚糖占95％～99.9％，说明了瓜尔胶的充分降解。
4、低聚半乳甘露糖作为供人食用的植物膳食纤维，柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲溶液，无毒副作用，食用安全。
5、本发明提供的两种酶解方式，酶解效果都超过95％以上，都能保证每种酶的酶解效果。第一种操作简单，第二种酶解方式的酶解效果更好，可达99.9％。
现有技术中都是酶解低浓度的瓜尔胶或其他生物胶，普遍认为高浓度的胶溶液在酶解时的效果不佳，本发明实现瓜尔胶高浓度下的酶解，并获得高浓度的低聚半乳甘露糖酶解液，节约了后续生产低聚半乳甘露糖粉剂时的脱水、干燥的成本。
具体实施方式
实施例1
瓜尔胶粉8g与β-甘露聚糖酶400U、内切葡聚糖酶8000U、纤维二糖酶8000U充分混合；然后加入0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL，调pH值为6.0；将溶液升温到22 ℃，溶胀30min。然后将溶液升温到50℃，酶解6h；酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表1，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的95.7％。
表1 实施例1中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
实施例2
瓜尔胶粉10g与β-甘露聚糖酶600U、内切葡聚糖酶20000U、纤维二糖酶15000U充分混合；然后加入0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL，调pH值为6.3；将溶液升温到 26℃，溶胀60min；然后将溶液升温到52.5℃，酶解8h；酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表2，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的96.4％。
表2 实施例2中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
实施例3
瓜尔胶粉12g与β-甘露聚糖酶840U、内切葡聚糖酶36000U、纤维二糖酶24000U充分混合；然后加入0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL，调pH值为6.6；将溶液升温到 30℃，溶胀90min。然后将溶液升温到55℃，酶解10h；酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表3，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的98.4％。
表3 实施例3中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
实施例4
瓜尔胶粉8g与β-甘露聚糖酶400U、内切葡聚糖酶8000U、纤维二糖酶8000U充分混合；然后加入0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL，调pH值为6.0；将溶液升温到 22℃，溶胀30min；
溶胀后采用温度梯度酶解方式，具体为：
(1)将温度从溶胀温度升高到35℃，酶解1.5h；
(2)将温度升高到48℃，酶解3h；升温过程中每3分钟升高1摄氏度，并且每升高1摄氏度保持10分钟；
(3)将温度升高到55℃，酶解2h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表4，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的99.1％。
表4 实施例4中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
| 单糖 | 二糖 | 三糖 | 四糖 | 五糖 | 六糖 | 七糖 | 八糖 | 九糖 | 十糖 | 十一糖 | 十二糖 |
| 0 | 21.3 | 7.8 | 22.5 | 6.9 | 18.8 | 15.1 | 2.2 | 2.9 | 1.6 | 0.6 | 0.3 |
实施例5
瓜尔胶粉10g与β-甘露聚糖酶600U、内切葡聚糖酶20000U、纤维二糖酶15000U充分混合；然后加入0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL，调pH值为6.3；将溶液升温到 26℃，溶胀60min；
溶胀后采用温度梯度酶解方式，具体为：
(1)将温度从溶胀温度升高到38℃，酶解2h；
(2)将温度升高到50℃，酶解.5h；升温过程中每4分钟升高2摄氏度，并且每升高2摄氏度保持10分钟；
(3)将温度升高到55℃，酶解2.5h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表5，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的99.3％。
表5 实施例5中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
| 单糖 | 二糖 | 三糖 | 四糖 | 五糖 | 六糖 | 七糖 | 八糖 | 九糖 | 十糖 | 十一糖 | 十二糖 |
| 0 | 22.5 | 8.3 | 23.5 | 6.4 | 18.4 | 14.7 | 1.9 | 2.4 | 1.2 | 0.4 | 0.3 |
实施例6
瓜尔胶粉12g与β-甘露聚糖酶840U、内切葡聚糖酶36000U、纤维二糖酶24000U充分混合；然后加入0.1mol/mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液定容至100mL，调pH值为6.6；将溶液升温到 30℃，溶胀90min。
溶胀后采用温度梯度酶解方式，具体为：
(1)将温度从溶胀温度升高到40℃，酶解2.5h；
(2)将温度升高到53℃，酶解4h；升温过程中每5分钟升高2摄氏度，并且每升高2摄氏度保持10分钟；
(3)将温度升高到55℃，酶解3h。
酶解结束后，即得到低聚半乳甘露糖酶解液。通过MALDI-TOF和HPLC方法测得该实施例酶解液中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比如表6，聚合度2-10的低聚半乳甘露糖占酶解液糖类组成成分的99.4％。
表6 实施例6中不同聚合度低聚半乳甘露糖的质量百分比
| 单糖 | 二糖 | 三糖 | 四糖 | 五糖 | 六糖 | 七糖 | 八糖 | 九糖 | 十糖 | 十一糖 | 十二糖 |
| 0 | 26.4 | 10.3 | 26.7 | 5.2 | 14.7 | 13.0 | 1.3 | 1.1 | 0.7 | 0.4 | 0.2 |
Claims (6)
1.一种利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，包括下列步骤：瓜尔胶粉首先与β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶充分混合；然后加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制瓜尔胶与三种酶的混合液；瓜尔胶溶胀后，控制酶解温度及时间进行降解。
2.如权利要求1所述的利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，瓜尔胶粉与β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶的混和比例为：每克瓜尔胶粉加入β-甘露聚糖酶50～70U，内切葡聚糖酶1000～3000U，纤维二糖酶1000～2000U。
3.如权利要求1所述的利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液浓度为0.1mol/mL，pH值为6.0～6.6。
4.如权利要求1所述的利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，瓜尔胶溶液浓度为8～12％，溶胀时间为30～90min，溶胀温度为22-30℃。
5.如权利要求1所述的利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，瓜尔胶溶胀后采用单一温度酶解方式：酶解温度为50～55℃，时间为6～10h。
6.如权利要求1所述的利用复合酶法制备瓜尔胶低聚半乳甘露糖酶解液的方法，其特征在于，溶胀后采用温度梯度酶解方式，具体为：
（1）将温度从溶胀温度升高到35-40℃，酶解1.5-2.5h；
（2）将温度升高到48-53℃，酶解3-4h；升温过程中每3-5分钟升高1-2摄氏度，并且每升高1-2摄氏度保持10分钟；
（3）将温度升高到55℃，酶解2-3h。
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