CN104711247B

CN104711247B - 一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法

Info

Publication number: CN104711247B
Application number: CN201510105655.XA
Authority: CN
Inventors: 周光宏; 梅林�
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2035-03-10
Also published as: CN104711247A

Abstract

本发明公开了一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，包括：乳酸菌接种到培养基上进行培养，菌液进行中空纤维膜过滤浓缩得到浓缩菌液，往浓缩菌液中注入新鲜的培养基再进行培养，制得的菌液中空纤维膜过滤浓缩2～3次，获得单位菌落数达到10¹¹cfu/ml以上的浓缩菌液，往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，进行喷雾干燥，制得微囊化乳酸菌发酵剂。本发明将中空纤维膜与生物反应器组合，进行乳酸菌高密度培养和浓缩，实现在线连续过滤浓缩培养，避免了菌体转移带来的污染，然后偶联低温喷雾干燥，对已浓缩的高密度菌体进行有效保护，获得单位活菌数1×10¹¹～1×10¹²cfu/ml乳酸菌发酵剂。

Description

一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法

技术领域

本发明属于食品领域，涉及一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，尤其涉及一种中空纤维浓缩培养结合低温喷雾制备高活力乳酸菌发酵剂的方法。

背景技术

乳酸菌是发酵食品最常用的发酵剂，也是目前商业上使用最广泛的发酵剂。传统液体发酵剂需要多次活化和扩培，工艺繁琐、容易增加噬菌体污染机会，不能满足生产需求，直投式发酵剂正逐步替代传统液体发酵剂。

高密度培养和菌体的富集浓缩是直投式发酵菌剂制备过程中重要的环节，单位活菌数达到10¹¹cfu/ml是保证直投式发酵剂活力的关键技术指标。传统的高密度培养方法包括缓冲盐法、化学中和法、膜渗析法和细胞循环培养法，这些方法在一定范围内可以解除部分代谢产物的反馈抑制作用。但是，但由于制备工艺的缺陷，如工艺环节无法密闭偶联、或者温度过高、过低，这都造成发酵剂单位体积菌密度高，而单位体积的活菌数较低，这对于大规模的工业化生产来说仍是难以满足生产需求的。因此，如何获得单位活菌数高的高活力发酵剂技术是提高直投式发酵剂品质的更高要求。

另外，在直投式发酵剂制备过程中，高密度培养和浓缩技术之后，需要对高密度菌体进行干燥。目前直投式发酵剂干燥的方法主要采用喷雾干燥和冷冻干燥，喷雾干燥常用的是高温喷雾干燥，由于出口温度较高，使得一些耐热性较差的菌株在喷雾干燥中损伤，而低温冷冻干燥方式由于温度过低，对菌株产生低温胁迫，同样造成浓缩过的高密度菌体活力降低，严重影响了直投式发酵剂的单位菌活力，满足不了直投式发酵剂的生产需求。

目前已报道的直投式发酵剂的制备工艺，还未见将中空纤维浓缩偶联低温喷雾干燥技术制备直投式发酵剂的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种中空纤维浓缩结合低温喷雾干燥制备高活力乳酸菌发酵剂的方法，可以获得单位活菌数可达10¹¹～10¹²cfu/mL的乳酸菌发酵剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，包括“乳酸菌高密度培养+中空纤维浓缩进行在线连续过滤浓缩培养+低温喷雾干燥方法”制备微囊化乳酸菌发酵剂；具体包括以下步骤：

(1)、乳酸菌接种到培养基上进行培养，乳酸菌的接种量为1～2％(v/v体积百分比)，培养温度为37～42℃，pH6.2～6.4，培养至单位菌落数达到10⁷cfu/mL以上；

(2)、将步骤(1)制得的菌液进行中空纤维膜过滤浓缩得到浓缩菌液，过滤除去代谢产生的对乳酸菌生长具有反馈抑制的乳酸、醋酸第物质，浓缩温度为25℃±5℃，中空纤维膜孔径为0.1μm，膜过滤压力为0.04～0.06MPa，膜过滤流速250～350L/(h·m²)；

(3)、往步骤(2)制得的浓缩菌液中注入新鲜灭菌的培养基，新鲜培养基的体积为步骤(1)中培养基体积的1/3～1/2，培养温度为37～42℃，pH6.2～6.4，培养至单位菌落数达到10⁹cfu/mL以上；

(4)、步骤(3)制得的菌液按照步骤(2)中空纤维膜过滤浓缩方法过滤浓缩2～3次，获得单位菌落数达到10¹¹cfu/mL以上的浓缩菌液；

(5)、往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为：1.5～2.5％明胶、2.5～3.5％蔗糖、1.5～2.5％乳清蛋白(w/v，即质量/菌液体积)；进行喷雾干燥，喷雾条件为：进风口温度为60～65℃，进样速度为17～18mL/min，制得微囊化乳酸菌发酵剂。

本发明中，所述的乳酸菌为本领域常规所述的乳酸菌；按照培养的具体乳酸菌菌种进行调整培养基。乳酸菌在生物反应器中进行培养。所述的乳酸菌采用沙克乳杆菌(Lactobacillussakei subsp.Sakei)时，所述的培养基为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸铜0.25g/L，吐温801mL/L，麦芽糖20g/L，缓冲体系为0.05mol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH6.2～6.4)。

步骤(2)中，对菌液浓缩之前，需首先对中空纤维膜进行清洗杀菌，杀菌合格后，再对菌液进行浓缩培养，浓缩过程中中空纤维膜处于无菌状态。清洗杀菌的步骤为：酸洗、水洗至中性、碱洗、水洗至中性、酸洗、水洗至中性；具体为：

(a)、使用柠檬酸配制的pH为1～3的酸清洗液循环酸洗2次；

(b)、使用无菌水循环水洗至中性；

(c)、使用碳酸钠配制的pH为10～12的碱清洗液循环碱洗2次；

(d)、使用无菌水循环水洗至中性；

(e)、使用柠檬酸配制的pH为1～3的酸清洗液循环酸洗2次；

(f)、使用无菌水循环水洗至中性，取最后一次水洗后的溶液待用。

中空纤维膜的清洗杀菌后，将待用溶液吸取200μL涂布到平板计数琼脂培养基上，置于37℃下培养24h后计数，无菌落生长，表明杀菌效果良好，可使用。

所述的中空纤维膜优选为PVDF中空纤维膜。

步骤(5)中，壁材在浓缩菌液中的浓度分别优选为：2％明胶、3％蔗糖、2％乳清蛋白。

本发明所述的微囊化乳酸菌发酵剂中单位活菌数达到1×10¹¹～1×10¹²cfu/mL，所述的微囊化乳酸菌发酵剂的体积粒径大小为5～60μm。

本发明的有益效果：

本发明方法将中空纤维膜与生物反应器组合，进行乳酸菌高密度培养和浓缩，然后偶联低温喷雾干燥，制备高效直投式乳酸菌发酵剂的工艺技术。本发明方法由于采用了中空纤维浓缩技术可以实现在线连续过滤浓缩培养，避免了菌体转移带来的污染，同时采用低温喷雾干燥技术，对已浓缩的高密度菌体进行有效保护，将核心物质包裹在一个微小的胶囊中，与环境隔离，减少外界环境的影响，保持其高效活力，获得单位活菌数可达1×10¹¹～1×10¹²cfu/mL。

本发明方法制得的微囊化乳酸菌发酵剂的体积粒径大小为5～60μm，微囊粒径大小符合制粒要求。避免了当微胶囊粒径小于5μm时，因布朗运动加剧而不容易收集；当粒径大于300μm时，其表面摩擦系数会突然下降而失去微胶囊作用。

附图说明

图1是本发明方法的工艺流程图；

图2是本发明乳酸菌发酵剂的显微结构(bar＝50μm)；

图3是本发明乳酸菌发酵剂的显微结构(bar＝5μm)；

图4是本发明乳酸菌发酵剂的显微结构(bar＝2μm)；

图5是本发明乳酸菌发酵剂的微囊粒径分析。

具体实施方式

通过具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明。

如图1所示，一种高活力微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)、培养基为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸铜0.25g/L，吐温80 1mL/L，麦芽糖20g/L，缓冲体系为0.05mol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH6.2～6.4)；

将培养基投入到生物反应器内，接种1％(v/v)沙克乳杆菌(Lactobacillus sakeisubsp.Sakei)(市售)到培养基上进行培养，培养温度为37℃，pH6.2～6.4，培养至单位菌落数10⁷cfu/mL以上；

(2)、对中空纤维浓缩装置的PVDF中空纤维膜进行清洗杀菌，清洗杀菌的步骤为：

(a)、使用柠檬酸配制的pH为2的酸清洗液，利用水泵循环酸洗2次；

(b)、使用无菌水，利用水泵循环水洗3次至中性；

(c)、使用碳酸钠配制的pH为12的碱清洗液，利用水泵循环碱洗2次；

(d)、使用无菌水，利用水泵循环水洗3次至中性；

(e)、使用柠檬酸配制的pH为2的酸清洗液，利用水泵循环酸洗2次；

(f)、使用无菌水，利用水泵循环水洗3次至中性，吸取最后一次水洗后的溶液200μL涂布到平板计数琼脂培养基上，置于37℃下培养24h后计数，无菌落生长，表明杀菌效果良好，可使用；

将步骤(1)制得的菌液输至清洗杀菌后的中空纤维膜浓缩装置，在无菌状态下，利用真空泵进行中空纤维膜过滤浓缩，过滤除去代谢产生的对乳酸菌生长具有反馈抑制的乳酸、醋酸第物质，浓缩温度为25℃±5℃，中空纤维膜孔径为0.1μm，膜过滤压力0.06MPa，膜过滤流速250L/(h·m²)；

(3)、步骤(2)制得的浓缩菌液经中空纤维膜浓缩装置的浓水出口返回生物反应器，往浓缩菌液中注入新鲜灭菌的培养基，培养基同步骤(1)，新鲜培养基的体积为步骤(1)中培养基体积的1/2，培养温度为37℃，pH6.2～6.4，培养至单位菌落数达到2.84×10⁹cfu/mL；

(4)、步骤(3)获得的菌液按照步骤(2)中空纤维膜过滤浓缩方法过滤浓缩2次，每次过滤浓缩之后不再进行培养，获得单位菌落数达到7.49×10¹¹cfu/mL的浓缩菌液；

(5)、往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为：2％明胶、3％蔗糖、2％乳清蛋白；送入低温喷雾干燥器进行喷雾干燥，喷雾条件为：进风口温度为60℃，进样速度为18mL/min，制得微囊化乳酸菌发酵剂，经平板计数法检测微囊化乳酸菌发酵剂中单位活菌数为4.19×10¹¹cfu/mL。

如图2-5，通过马尔文粒径分析仪(Mastersizer 2000)分析和电镜分析可知，微囊化乳酸菌发酵剂中菌体表面积的平均粒径为11.685μm；体积粒径大小为5～60μm，体积平均粒径为28.125μm，90％的粒径大小分布在56.071μm以内，50％的粒径分布在18.493μm，10％的粒径分布在5.347μm以内，获得微囊粒径大小符合制粒要求，避免了当微胶囊粒径小5μm时，因布朗运动加剧而不容易收集；当粒径大于300μm时，其表面摩擦系数会突然下降而失去微胶囊作用。

Claims

1.一种微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、乳酸菌接种到培养基上进行培养，乳酸菌的接种量为1～2％，为体积百分比，培养温度为37～42℃，pH6.2～6.4，培养至单位菌落数达到10⁷cfu/mL以上；

(2)、将步骤(1)制得的菌液进行中空纤维膜过滤浓缩得到浓缩菌液，浓缩温度为25℃±5℃，中空纤维膜孔径为0.1μm，膜过滤压力为0.04～0.06MPa，膜过滤流速250～350L/(h·m²)；

(5)、往浓缩菌液中加入明胶、蔗糖和乳清蛋白作为壁材，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为：1.5～2.5％明胶、2.5～3.5％蔗糖、1.5～2.5％乳清蛋白，为质量体积比；进行喷雾干燥，喷雾条件为：进风口温度为60～65℃，进样速度为17～18mL/min，制得微囊化乳酸菌发酵剂；所述的微囊化乳酸菌发酵剂中单位活菌数为1×10¹¹～1×10¹²cfu/mL，所述的微囊化乳酸菌发酵剂的体积粒径大小为5～60μm。

2.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中，对菌液浓缩之前，对中空纤维膜进行清洗杀菌，清洗杀菌的步骤为：酸洗、水洗至中性、碱洗、水洗至中性、酸洗、水洗至中性；具体为：

(a)、使用柠檬酸配制的pH为1～3的酸清洗液循环酸洗2次；

(b)、使用无菌水循环水洗至中性；

(c)、使用碳酸钠配制的pH为10～12的碱清洗液循环碱洗2次；

(d)、使用无菌水循环水洗至中性；

(e)、使用柠檬酸配制的pH为1～3的酸清洗液循环酸洗2次；

(f)、使用无菌水循环水洗至中性。

3.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于所述的中空纤维膜为PVDF中空纤维膜。

4.根据权利要求1所述的微囊化乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于步骤(5)中，壁材在浓缩菌液中的浓度分别为：2％明胶、3％蔗糖、2％乳清蛋白。