CN104711246A - 青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。该果胶酶经过菌种活化、制备种子液、发酵培养、粗提酶液等步骤获得。将该粗酶液按烟草薄片：果胶酶=1：1~10的比例，40~50℃，酶解2~6h用于处理烟草薄片。本发明的总体技术路线是：将特定菌种首先混合发酵，筛选优化最佳发酵条件，获得最高果胶酶酶活的粗酶液，将粗酶液用于处理烟草薄片降低其果胶酶含量，获得最佳降解效果。本发明所得粗酶液的酶活最高可达3880U/mL，用于烟草薄片处理后，可将烟草薄片中果胶酶含量由2.07%降低到1.48%，能较好的改善烟草的吸食品质。
Description
技术领域
本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。
背景技术
果胶酶是一种由多种组分组成的复合酶，各组分能够协同完成果胶的降解，在食品加工、饲料加工、纺织、造纸、环境保护等方面具有较为广泛的用途。果胶酶的生产已有40多年的历史，主要有固态发酵法和液体发酵法两种生产方式。许多微生物都具有产生果胶酶的能力，现有技术中，果胶酶生产产酶菌株主要是真菌，并且以曲霉属菌种应用较为广泛。一般而言，固态发酵法所产果胶酶酶活较高，但是存在设备放大困难，自动化程度偏低，工艺参数不易控制等缺陷；而液体发酵虽然酶活存在一定程度的降低，但是由于能够连续自动化生产，且容易扩大生产规模，而且发酵过程易控制，因而已成为果胶酶生产的主要生产方式。
果胶酶的工业化生产始于二十世纪五十年代，主要生产国有德国、法国、意大利、丹麦、荷兰、日本等。我国对于果胶酶的研究起始于上世纪八十年代早期，近年虽然在发酵菌株选育、发酵工艺、应用工艺改良等方面取得了长足的进步，但是随着对于高产量、高质量的果胶酶需求，现有的果胶酶生产工艺仍需进一步优化完善。
近年来，多菌混合发酵技术得到了长足进步。一般而言，多菌种作为一个生物混合体系，各菌种之间具有生长代谢协调的作用，因而多菌种混合发酵比单菌种发酵产酶具有更多优势。但是由于微生物代谢产物的复杂性、多样性，加上不同微生物发酵之间的竞争、抑制作用也错综复杂，因而针对不同的微生物组合常需探讨不同的最优发酵条件组合。
造纸法烟草薄片（Paper-Process Reconstituted Tobacco）是一种烟草资源再生利用的产品。它是利用一些烟草废弃料、边角料，如烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，经过浸提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香工艺过程，制成烟叶薄片，用作卷烟填充物。造纸法烟草薄片，不仅在改善烟叶产品结构强度、燃烧性能及降低卷烟的烟气烟碱和焦油量等方面具有优势，同时还能降低烟叶单耗，节约生产成本，可以说是烟草工业近年最重要的成果之一。而近年来，生物技术与造纸法烟草薄片技术在生产中的结合应用，不仅发挥了造纸法烟草薄片的工艺优势，而且利用生物技术有选择地改变烟草化学成分，明显改善了烟草薄片的品质。
研究表明，烟草原料中的纤维素、木质素、果胶和蛋白质在高温下均会产生芳烃类化合物。其中果胶是一种胶体性物质，沉积在初生细胞壁和胞间层，并与纤维素、半纤维素、木质素以及一些蛋白质相互交联。果胶在热解过程中主要生成甲醇等有害物质。果胶的去除不仅能够减少这类物质的生成，而且还能够改变烟草细胞结构，让细胞变的更松散透气，有利于提高烟草燃烧能力，减少热解的发生。
现有技术中，针对烟草薄片中果胶类物质的降解主要是采用传统的果胶酶进行的。但是由于烟草薄片中果胶结构的复杂性和多样性，而现有技术中的果胶酶普遍存在对于烟草薄片中果胶降解针对性不强、降解不够充分、降解过程难以控制的缺陷，因而急需探讨新的果胶酶及其在烟草薄片加工中的应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种采用特定菌株混菌发酵生产的果胶酶，同时该果胶酶可以用于烟草薄片加工过程中用于降解烟草薄片中的果胶，从而改善烟草品质。
本发明的技术方案具体如下。
青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶，采用如下步骤获得：
（1）菌种活化，将微生物菌种分别从保藏培养基上挑取，接种到活化培养基中，培养；
所述微生物菌种包括：中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为CICC 40923的微紫青霉(Penicillium janthinellum)，简称青霉，和中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为CICC32295的异常毕赤酵母(Pichia anomala)，简称毕赤酵母；
所述青霉的活化培养基为PDA培养基，菌种活化时采用划线法接种，培养4d；
所述毕赤酵母的活化培养基为PDA培养基，菌种活化时采用划线法接种，培养3d；
（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种分别接种到种子培养基中，制备种子液；
制备青霉种子液所用青霉种子培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，FeSO4 0.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，pH自然，装液量100/ 250mL锥形瓶，30℃、160 r/min摇床培养48h；
制备毕赤酵母种子液所用毕赤酵母种子培养基配方为：PYD培养基，即20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，pH自然，30℃、160 r/min摇床培养48h有白色沉淀形成时即可作为种子液接种使用；
（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液混合发酵培养，具体步骤为：首先将青霉种子液接种到发酵培养基中，30℃、160 r/min摇床培养24~72h，优选培养48h；然后接种进入毕赤酵母种子液，30℃、160 r/min摇床培养48h；
所述发酵培养基配方为：橘皮粉30~50g/L、蛋白胨3~5g/L，KH2PO4 0.5~1.5 g/L，pH5； 优选配方为橘皮粉40g/L、蛋白胨5.0g/L，KH2PO41g/L，pH5；
青霉种子液接种进入发酵培养基的接种量按4%体积分数计算；
毕赤酵母种子液接种进入发酵培养基的接种量按5%体积分数计算；
（4）粗提酶液，液体发酵液经离心滤去菌体，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为本发明所提供的果胶酶成品。
所述青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶用于烟草薄片加工过程中，将所得粗酶液，按料液比，烟草薄片：果胶酶=1：1~10比例，40~50℃，酶解2~6h处理，优选处理条件为，烟草薄片：果胶酶=1：5比例，45℃，酶解6h处理。
本发明的总体技术路线是：将特定菌种首先混合发酵，筛选优化最佳发酵条件，获得最高果胶酶酶活的粗酶液，然后将粗酶液直接用于处理烟草薄片处理降低其果胶酶含量，通过优化处理工艺，获得最佳降解效果，从而改善烟草品质。
在一系列工作基础上，本发明采用特定菌种混合发酵所得粗酶液的酶活最高可达3880U/mL，具有较好的应用潜力。进一步用于烟草薄片处理后，可将烟草薄片中果胶酶含量由2.07%降低到1.48%，降解率达到28.49%，将处理后烟草薄片用于卷烟后，进一步的感官抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟的香气质更好，香气量充足，刺激性减轻且余味纯净舒适，卷烟的吸食品质得到了较好的改善和提升。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
本实施例主要对于青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶过程及相关培养基的优化过程简要介绍如下。
青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶，采用如下步骤获得：
（1）菌种活化，将微生物菌种分别从保藏培养基上挑取，接种到活化培养基中，培养；
所述微生物菌种包括：中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为CICC 40923的微紫青霉(Penicillium janthinellum)，简称青霉，和中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为CICC32295的异常毕赤酵母(Pichia anomala)，简称毕赤酵母；这两种菌种均从相应的保藏单位购买获得；
所述青霉的活化培养基为PDA培养基（马铃薯300g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃灭菌），，菌种活化时采用划线法接种，培养4d；
所述毕赤酵母的活化培养基为PDA培养基，菌种活化时采用划线法接种，培养3d。
（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种分别接种到种子培养基中，制备种子液；
制备青霉种子液所用青霉种子培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，FeSO4 0.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，pH自然，装液量100/ 250mL锥形瓶，30℃、160 r/min摇床培养48h；
具体步骤为：用打孔器在活化培养基平板上靠近菌株生长边缘的位置取两块0.5cm2的、长满新生菌丝的接种块，接种于青霉种子培养基中；摇床发酵培养结束后，加入灭菌的磁珠和适量的玻璃珠，使用磁力搅拌器搅拌2h，以使将培养物打碎，便于作为种子液接种用于进一步发酵培养扩增使用；
制备毕赤酵母种子液所用毕赤酵母种子培养基配方为：PYD培养基，即20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，pH自然，30℃、160 r/min摇床培养48h有白色沉淀形成时即可作为种子液接种使用；具体操作参考青霉种子液制备过程，亦可按照常规接种操作即可，即用接种环从活化培养基平板上刮一环新鲜毕赤酵母接种于毕赤酵母液体种子培养基中即可。
（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液混合发酵培养，具体步骤为：首先将青霉种子液接种到发酵培养基中，30℃、160 r/min摇床培养24~72h，优选培养48h；然后接种进入毕赤酵母种子液，30℃、160 r/min摇床培养48h；
所述发酵培养基配方为：橘皮粉30~50g/L、蛋白胨3~5g/L，KH2PO4 0.5~1.5 g/L，pH5； 优选配方为橘皮粉40g/L、蛋白胨5.0g/L，KH2PO41g/L，pH5；
青霉种子液接种进入发酵培养基的接种量按4%体积分数计算；
毕赤酵母种子液接种进入发酵培养基的接种量按5%体积分数计算；
（4）粗提酶液，液体发酵液经离心滤去菌体，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为本发明所提供的果胶酶成品。
发酵培养条件优化介绍
由于菌种混合发酵过程中培养基的配方及不同菌种接入时间对于发酵效果均有较大影响，以菌种接入时间为例，如果在发酵的初始阶段即接入毕赤酵母，此时青霉菌体浓度尚较低，加上营养物质的竞争消耗，青霉在与毕赤酵母的竞争中不占优势，从而使得青霉的生长受到抑制，不利于果胶酶的产生，因而对于菌种的接入时间需要详细优化。下面对于发酵培养过程中部分优化因子的获得过程简要介绍如下。
首先根据初步的单因素试验结果确定影响青霉素果胶酶产量的主要因素有碳源、氮源、无机盐、接入毕赤酵母时间4个影响因素，然后对这4个影响因素设计3水平进行正交实验，以果胶酶活力为指标，具体的影响因素及相应水平设计表如下所示。
具体试验结果及方差统计结果如下表所示。
对上表分析进行数据拟合可以得出，最佳的发酵培养基配方为：橘皮粉40g/L、蛋白胨5.0g/L，KH2PO41g/L，pH5，在青霉发酵培养48h后再接种毕赤酵母的发酵效果较好。进一步以此配方进行验证，结果表明最高酶活可达3880.0U/mL，因而具有较好的应用潜力。需要说明的是，青霉发酵过程中种子液接种量按4%的体积分数计算，毕赤酵母的接种量按5%的体积分数计算。
酶活测定方法
本发明中酶活测定参照Miller(1959)方法。具体为：
A．取0.4mL l%果胶溶液于试管中，加入1.0mL pH5的0.04mol/L Na2HPO4-0.02mol/L柠檬酸缓冲液，45℃水浴平衡5min；
B．加入0.1mL适当稀释的酶液，45℃反应30min（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）；
C．加入3.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴5min；
D．冷却，定容至15mL，于分光光度计540 nm 波长下测吸光度，得到反应体系中半乳糖醛酸的量。
酶活力单位：1mL酶液在45℃、pH5.0的条件下，每min分解底物产生lμg半乳糖醛酸的酶量定义为1单位聚半乳糖醛酸酶(PG)酶活，以U/mL表示。
酶活力计算公式：U= (C实验-C对照)*N*1000*(V总/V酶)/t；
其中，N—酶液稀释倍数，V总—反应总体积，V酶—酶液体积，t—反应时间（min）。
DNS法标准曲线的绘制：配置1mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液。取1 mg /mL 半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，补水至1 mL，加DNS 试剂3 mL，混合后于沸水中煮7 min，冷却后定容至15mL，于分光光度计540 nm 波长下测吸光度。以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线。
实施例2
本实施例将实施例1中所制备的粗酶液用于烟草薄片降解，从而降低烟草薄片中的果胶含量，并进一步进行感官评价分析，简要介绍如下。
实施例1中青霉和毕赤酵母混菌发酵生产的果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，将所得粗酶液（理论而言，任意酶活的的粗酶液均可用于降解果胶酶，本实施例仅以酶活最高的粗酶液为例，即酶活3880.0U/mL，探讨果胶酶的降解效果和对烟草品质的改善情况）按不同料液配比进行生物降解处理。具体过程为：
将粗酶液按比例以不同料液比（烟草薄片干重质量(g)与粗酶液体积(mL)之比）的用量用小型喷雾器均匀喷施于10 g烟草薄片上，40℃~50℃条件下，酶解2~6h；酶解结束后，迅速将其处理后烟草薄片放入70℃的烘箱中烘干，使果胶酶失活，再以75℃蒸馏水反复清洗以除去可溶性糖（需要说明的是，实际制备卷烟样品时不需清洗），测定处理样品中的果胶含量；同样操作条件下，以喷洒失活酶液为对照组，最终计算果胶降解率。
为获得最佳的降解率，发明人采用正交试验设计的方法，选用L9(34)正交表对果胶降解条件（料液比、酶解温度、酶解时间）进行优化试验，各影响因素设计如下表所示。
不同组合条件下的试验结果及差异显著性分析结果如下表所示。
对上表进行分析可知，各个因素对降解率的影响由大到小依次为：反应时间>料液比>反应温度。而3 种因素对果胶降解率的最优组合是，即以粗酶液（酶活力3880U/mL）在料液比1:5、反应温度45℃、处理时间6h，在此条件下烟草薄片中果胶降解率达到最大，为29.45%。
为具体评价生物降解处理后烟草薄片对于卷烟吸食品质的改善效果，发明人以最佳酶解条件处理的烟草薄片为例，进一步进行了烟草吸食评价。简要介绍如下。
将最佳酶解条件处理后烟草薄片在80℃条件下进行适当烘干（至湿度65%）后切丝，置于恒温恒湿箱内平衡（相对湿度(60 ±5)% ，温度 (22 ±2) ℃）48 h。按烟丝重量15%（即称取0.12 g样品）与平衡后85%的配方烟丝均匀混合后手动卷烟，此即为试验组。相同条件下采用灭活酶处理的烟草薄片所制备的卷烟为对照组，以蒸馏水处理的烟草薄片所制备的卷烟为空白组。
将按国标要求所制备的各组卷烟样品（每支烟只总重0.80±0.01 g），在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)%的恒温恒湿箱中平衡24 h后依据国家现行成品烟评吸标准GB5606.4-2005对卷烟进行质量评吸鉴定和评价。
具体评价结果如下表所示。
从上述评价结果可以看出，酶解后制成的薄片添加于卷烟中，使卷烟的香气质更好，香气量充足，刺激性减轻且余味纯净舒适，卷烟的吸食品质得以改善和提升。
果胶含量和降解率的计算方法
本发明中对于烟草薄片中的果胶含量采用咔唑比色法测定，测定步骤如下：
A．样品预处理，取待测样品（酶解处理后或未处理烟草薄片），研碎，过250目筛，称取10g（精确到0.001g）样品于250mL锥形瓶中，加入150mL加热至沸腾的0.05mol/L 的HCl 溶液，装上冷凝器，于90℃水浴中加热回流1h，冷却后把滤液移入250mL容量瓶中，加入2mol/L的NaOH中和至pH=4，摇匀，收集滤液即得总果胶提取液，备用；
B．以半乳糖醛酸为标准品，咔唑比色法测定果胶含量，取步骤A中所得总果胶提取液1mL于含有6mL浓硫酸的试管中，摇匀；85℃水浴加热15min；冷却，加入0.15%咔唑无水乙醇溶液0.3mL，摇匀，暗置30min；530nm下测吸光度；
C．咔唑比色法标准曲线和公式，求得待测液果胶含量；
所述公式为：果胶（%）= C×V×K×100/(W×106) ；
其中，C：对照标准曲线求得的果胶提取稀释液的果胶含量（μg/mL)，V：果胶提取液原液体积（mL），K：果胶提取液稀释倍数，W：样品质量（g），106：质量单位换算系数；
所述咔唑比色法标准曲线的绘制方法为：首先准确称取0.1000g半乳糖醛酸标准品于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中，用pH为3的盐酸定容；然后分别取0、1、2、3、4、5、6、7mL于8个100容量瓶中，用pH为3的HCl定容，得到浓度为0、10、20、30、40、50、60、70μg/mL的标准溶液；最后以上述方法测定，然后绘制咔唑比色法的标准曲线。
本发明中果胶降解率按以下公式计算：
Ei=（C0－Ci）/C0×100%，
其中，Ei：果胶的降解率，C0：空白对照样中果胶水解生成的半乳糖醛酸的量；Ci：酶处理的烟草薄片中果胶水解生成的半乳糖醛酸的量；空白对照样和酶处理的烟草薄片中果胶含量测定均按上述咔唑比色法测定进行。
Claims (7)
1.青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶，其特征在于，该果胶酶采用如下步骤获得：
（1）菌种活化，将微生物菌种分别从保藏培养基上挑取，接种到活化培养基中，培养；
所述微生物菌种包括：中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC 40923的微紫青霉，和中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC32295的异常毕赤酵母；
（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种分别接种到种子培养基中，制备种子液；
（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液混合发酵培养，具体步骤为：首先将青霉种子液接种到发酵培养基中，30℃、160 r/min摇床培养24~72h；然后接种进入毕赤酵母种子液，30℃、160 r/min摇床培养48h；
（4）粗提酶液，液体发酵液经离心滤去菌体，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为本发明所提供的果胶酶成品。
2.如权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，步骤（1）中所述活化培养基为PDA培养基，青霉菌种活化时采用划线法接种，培养4d；毕赤酵母菌种活化时采用划线法接种，培养3d。
3.如权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，步骤（2）中制备青霉种子液所用青霉种子培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，FeSO4 0.1g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，pH自然，装液量100/ 250mL锥形瓶，30℃、160 r/min摇床培养48h；
制备毕赤酵母种子液所用毕赤酵母种子培养基配方为：PYD培养基，30℃、160 r/min摇床培养48h有白色沉淀形成时即可作为种子液接种使用。
4.如权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，所述发酵培养基配方为：橘皮粉30~50g/L、蛋白胨3~5g/L，KH2PO4 0.5~1.5 g/L，pH5。
5.如权利要求4所述青霉和酵母菌混菌发酵生产的果胶酶，其特征在于，所述发酵培养基配方为：橘皮粉40g/L、蛋白胨5.0g/L，KH2PO41g/L，pH5；
青霉种子液接种进入发酵培养基的接种量按4%体积分数计算；
毕赤酵母种子液接种进入发酵培养基的接种量按5%体积分数计算。
6.权利要求1所述青霉和酵母菌混菌发酵所产果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，其特征在于，将所得粗酶液，按料液比，即烟草薄片：果胶酶=1：1~10的比例，40~50℃，酶解2~6h。
7.如权利要求6所述果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，其特征在于，粗酶液按料液比，即烟草薄片：果胶酶=1：5的比例，45℃，酶解6h处理。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 450000 Yulin South Road, Henan, Zheng Dong, No. 16 South Road, Zhengzhou Applicant after: CHINA TOBACCO HENAN INDUSTRIAL Co.,Ltd. Applicant after: ZHENGZHOU University OF LIGHT INDUSTRY Address before: 450000 Zhengzhou agricultural road, Henan, No. 29 Applicant before: CHINA TOBACCO HENAN INDUSTRIAL Co.,Ltd. Applicant before: Zhengzhou University of Light Industry |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.16 Yulin South Road, Zhengdong New District, Zhengzhou City, Henan Province Patentee after: CHINA TOBACCO HENAN INDUSTRIAL Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: Zhengzhou University of light industry Address before: No.16 Yulin South Road, Zhengdong New District, Zhengzhou City, Henan Province Patentee before: CHINA TOBACCO HENAN INDUSTRIAL Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: ZHENGZHOU University OF LIGHT INDUSTRY |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240828 Address after: No.16 Yulin South Road, Zhengdong New District, Zhengzhou City, Henan Province Patentee after: CHINA TOBACCO HENAN INDUSTRIAL Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: No.16 Yulin South Road, Zhengdong New District, Zhengzhou City, Henan Province Patentee before: CHINA TOBACCO HENAN INDUSTRIAL Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: Zhengzhou University of light industry |
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| TR01 | Transfer of patent right |