CN104711234A - 一种制备漆酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的斜面培养基的固体菌种接种至液体种子培养基制备种子液；（2）将种子液接种至发酵培养基，发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为100～250mL，在25～35℃、摇床150～350rpm培养7～20天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。本发明利用一种食用菌虎皮香菇通过液体深层发酵高产食品级的漆酶。本发明虎皮香菇发酵液中漆酶的酶活高，发酵液中漆酶酶活最高可达462.59U/mL。

Description

一种制备漆酶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地涉及利用一株虎皮香菇（Lentinus tigrinus）液体深层发酵生产漆酶的方法。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属铜蓝氧化酶（blue copper oxidases）家族中的同一小族。漆酶按其来源可以分为漆树漆酶（rhuslaccase）和真菌漆酶（fungal laccase）两大类，植物漆酶与木质素的生物合成密切相关，真菌漆酶具有多种生理生化功能，如形态发生，真菌与植物寄主相互作用，应激防御以及木质素降解等。据统计漆酶的催化底物多达250多种，主要有酚类、芳胺、羧酸、金属有机化合物以及一些甾类激素和生物色素。由于作用底物广泛，漆酶在食品工业、废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、有机合成、木材加工、免疫检测等诸多领域有广泛应用。

己经发现了有多种产漆酶的侧耳类真菌，如糙皮侧耳、刺芹侧耳、环柄侧耳等，但漆酶酶活普遍不高。发明专利申请CN200910083514.7“一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株”，其生产菌株为血红密孔菌，漆酶发酵酶活为300U/mL；发明专利申请CN101942421B“一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法”，漆酶发酵酶活为500U/mL；发明专利申请CN200810198678.X“一种产漆酶的灵芝菌株”，漆酶发酵酶活为8620U/mL，是目前酶活较高的菌株。上述发明的菌种不属于食用菌。

虎皮香菇，属伞菌目，侧耳科，香菇属，生于阔叶树腐木上，易于进行固体栽培和液体深层发酵培养，具有生长迅速，产物产量高，是一种食用真菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用食用菌制备漆酶的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的斜面培养基的固体菌种接种至液体种子培养基，在25～35℃，摇床150～200rpm，培养2～5天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为2%～14%的接种量接种至发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为100～250mL，在25～35℃、摇床150～350rpm培养7～20天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

步骤（1）优选为：将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的斜面培养基的固体菌种接种至液体种子培养基，在28～32℃，摇床150～200rpm，培养3～4天，制备种子液。

步骤（2）优选为：将种子液按体积比为6%～14%的接种量接种至发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为150～200mL，在28～32℃，摇床150～200rpm，培养9～15天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液。

斜面培养基优选为：葡萄糖5～40g/L，蛋白胨2.5～20g/L，酵母粉0.5～5g/L，琼脂10～20g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳10～200g，水1L，煮沸30～60min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

液体种子培养基为：玉米粉10～50g/L、豆粕粉5～35g/L、α-淀粉酶20～80U/L、KH₂PO₄0.5～6g/L、MgSO₄·7H₂O0.2～5g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

液体种子培养基较好的是：玉米粉25～35g/L、豆粕粉10～20g/L、α-淀粉酶30～65U/L、KH₂PO₄2～4g/L、MgSO₄·7H₂O1～2g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

发酵培养基为：碳源20～100g/L，氮源5～60g/L，KH₂PO₄1～5g/L，MgSO₄·7H₂O0.25～3g/L，CuSO₄·5H₂O0.5～2mmol/L，其余为水。

碳源选自以下一种或几种：葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糊精、麦芽糖或玉米粉。

氮源选自以下一种或几种：酵母浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、低温黄豆饼粉、磷酸二氢铵或硫酸铵。

最优的发酵培养基为：果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氢铵1g/L，KH₂PO₄₂g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，CuSO₄·5H₂O1mmol/L，其余为水。

本发明利用一种食用菌虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301，通过液体深层发酵高产食品级的漆酶。本发明虎皮香菇发酵液中漆酶的酶活高，发酵液中漆酶酶活最高可达462.59U/mL。且漆酶反应的适应条件较广，在温度40～60℃范围内活性稳定，在40℃时酶活最高，最适pH为4.4～4.8，酶活均在90%以上，最适pH为4.6。

附图说明

图1为虎皮香菇平板培养照片。

图2为虎皮香菇菌丝体照片。

图3为纯化后的漆酶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

试验中所用的主要试剂和仪器如下：玉米粉——梅河口市兴达米业有限责任公司；低温黄豆饼粉——山东万得福实业集团有限公司；α-淀粉酶——北京索莱宝科技有限公司；果糖——河北华旭制药有限责任公司；胰蛋白胨——北京双旋微生物培养基制品厂；2,2'-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸钠)（ABTS）——SIGMA公司；紫外可见分光光度计——TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；低温恒温循环器——ILB-008-01型，施都凯仪器设备（上海）有限公司。

本发明所用食用菌虎皮香菇（Lentinus tigrinus）于2013年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，并已存活，建议的分类命名为虎皮香菇（Lentinus tigrinus），保藏编号CGMCCNo.8301，虎皮香菇平板培养照片见图1，虎皮香菇菌丝体照片见图2。

实施例1

斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉2g/L，琼脂15g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳100g，水1L，煮沸45min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

实施例2

斜面培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉3g/L，琼脂15g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳10g，水1L，煮沸60min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

实施例3

斜面培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉5g/L，琼脂15g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳100g，水1L，煮沸50min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

实施例4

斜面培养基：葡萄糖25g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉0.5g/L，琼脂20g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳150g，水1L，煮沸40min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

实施例5

斜面培养基：葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉2g/L，琼脂10g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳200g，水1L，煮沸30min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

实施例6

液体种子培养基：玉米粉30g/L、豆粕粉15g/L、α-淀粉酶45U/L、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

实施例7

液体种子培养基：玉米粉25g/L、豆粕粉20g/L、α-淀粉酶30U/L、KH₂PO₄4g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

实施例8

液体种子培养基：玉米粉35g/L、豆粕粉10g/L、α-淀粉酶65U/L、KH₂PO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O2g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

实施例9

液体种子培养基：玉米粉10g/L、豆粕粉35g/L、α-淀粉酶20U/L、KH₂PO₄6g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

实施例10

液体种子培养基：玉米粉50g/L、豆粕粉5g/L、α-淀粉酶80U/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O5g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

实施例11

发酵培养基:果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氢铵1g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，CuSO₄·5H₂O1mmol/L，其余为水。

实施例12

发酵培养基为：葡萄糖60g/L，蛋白胨8g/L，硫酸铵2g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，CuSO₄·5H₂O0.5mmol/L，其余为水。

实施例13

发酵培养基为：木糖80g/L，玉米粉20g/L，酵母浸膏60g/L，KH₂PO₄4g/L，MgSO₄·7H₂O3g/L，CuSO₄·5H₂O2mmol/L，其余为水。

实施例14

发酵培养基为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，CuSO₄·5H₂O1mmol/L，其余为水。

实施例15

发酵培养基为：麦芽糊精20g/L，低温黄豆饼粉5g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，CuSO₄·5H₂O2mmol/L，其余为水。

实施例16

一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的实施例1制备的斜面培养基的固体菌种接种至实施例6制备的液体种子培养基，在30℃，摇床150rpm，培养3天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为6%的接种量接种至实施例11制备的发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为150mL，在30℃、摇床1-4天150rpm，4-11天200rpm，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

发酵液中漆酶酶活为462.59U/mL。

实施例17

一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的实施例2制备的斜面培养基的固体菌种接种至实施例7制备的液体种子培养基，在28℃，摇床200rpm，培养4天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为10%的接种量接种至实施例12制备的发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为150mL，在28℃、摇床150rpm培养15天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

发酵液中漆酶酶活为202.11U/mL。

实施例18

一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的实施例3制备的斜面培养基的固体菌种接种至实施例8制备的液体种子培养基，在32℃，摇床180rpm，培养3天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为14%的接种量接种至实施例13制备的发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为200mL，在32℃、摇床200rpm培养20天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

发酵液中漆酶酶活为165.10U/mL。

实施例19

一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的实施例4制备的斜面培养基的固体菌种接种至实施例9制备的液体种子培养基，在25℃，摇床150rpm，培养5天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为10%的接种量接种至实施例14制备的发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为100mL，在25℃、摇床150rpm培养9天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

发酵液中漆酶酶活为321.73U/mL。

实施例20

一种制备漆酶的方法，包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的实施例5制备的斜面培养基的固体菌种接种至实施例10制备的液体种子培养基，在35℃，摇床200rpm，培养2天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为2%的接种量接种至实施例15制备的发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为250mL，在35℃、摇床350rpm培养7天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

发酵液中漆酶酶活为200.15U/mL。

实施例21

漆酶酶活测定方法

本发明中漆酶活的测定是以ABTS为底物来测定的。一个酶活单位（U）的定义是：在下述的测定条件下，每分钟催化1μmol底物的酶量。

酶活计算公式为

$U=\frac{V\×\mathrm{\ΔOD}\×{10}^3\×n}{{\mathrm{\ϵ}}_{420}\×v\×t\×L}$                                           式（1）

式（1）中，U为酶活（U/mL）；V为反应总体积（mL）；ΔOD为420nm吸光度的变化；n为酶液的稀释倍数；ε₄₂₀=36000M^-1cm^-1为氧化型ABTS的摩尔吸光系数；v为酶液体积（mL）；t为反应时间（min）；L为比色皿的光径（cm）。

本发明中酶活测定条件为：控制分光光度计样品池温度为漆酶的最适反应温度40℃，反应体系为3mL，向光径为1cm的比色皿中加入2.7mL浓度为0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液（pH4.6）和0.2mL浓度为0.5mmol/L的ABTS，盖上比色皿的盖子上下振荡混合均匀，再加入0.1mL稀释至适宜倍数的酶液，混匀后迅速放入样品池，测定最初反应3min内反应液在420nm处吸光度的变化，以加热煮沸5min的酶液作对照。

实施例22漆酶纯化

将实施例17得到的漆酶粗酶液在10000×g下离心10min，去除菌丝体，取100mL上清液，加入硫酸铵至60%饱和度，4℃下静置过夜，用截留分子量为30KDa的透析袋进行透析除盐，透析液过0.22μm的膜，取10mL透析液进行DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析，收集有活性的洗脱液，即可获得高纯度的漆酶。纯化后的漆酶电泳图如图3，图3中1为Marker蛋白，2为纯化后的漆酶。

Claims (10)

1.一种制备漆酶的方法，其特征是包括如下步骤：

（1）将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的斜面培养基的固体菌种接种至液体种子培养基，在25～35℃，摇床150～200rpm，培养2～5天，制备种子液；

（2）将种子液按体积比为2%～14%的接种量接种至发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为100～250mL，在25～35℃、摇床150～350rpm培养7～20天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液；

（3）将菌丝体发酵液于10000×g离心10min，取上清液即为漆酶粗酶液。

2.根据权利要求1所述的一种制备漆酶的方法，其特征是所述步骤（1）为：将接种虎皮香菇（Lentinus tigrinus）保藏编号：CGMCC No.8301的斜面培养基的固体菌种接种至液体种子培养基，在28～32℃，摇床150～200rpm，培养3～4天，制备种子液。

3.根据权利要求1所述的一种制备漆酶的方法，其特征是所述步骤（2）为：将种子液按体积比为6%～14%的接种量接种至发酵培养基，所述发酵培养基是在500mL三角瓶中的装液量为150～200mL，在28～32℃，摇床150～200rpm，培养9～15天，得到虎皮香菇菌丝体发酵液。

4.根据权利要求1或2的一种制备漆酶的方法，其特征是所述斜面培养基为：葡萄糖5～40g/L，蛋白胨2.5～20g/L，酵母粉0.5～5g/L，琼脂10～20g/L，其余为花生壳浸出液；所述的花生壳浸出液的制备方法为：花生壳10～200g，水1L，煮沸30～60min，过滤，滤液即是花生壳浸出液。

5.根据权利要求1或2的一种制备漆酶的方法，其特征是所述液体种子培养基为：玉米粉10～50g/L、豆粕粉5～35g/L、α-淀粉酶20～80U/L、KH₂PO₄0.5～6g/L、MgSO₄·7H₂O0.2～5g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

6.根据权利要求5所述的一种制备漆酶的方法，其特征是所述液体种子培养基为：玉米粉25～35g/L、豆粕粉10～20g/L、α-淀粉酶30～65U/L、KH₂PO₄2～4g/L、MgSO₄·7H₂O1～2g/L，其余为水，pH自然，0.1MPa灭菌25min。

7.根据权利要求1或3的一种制备漆酶的方法，其特征是所述发酵培养基为：碳源20～100g/L，氮源5～60g/L，KH₂PO₄1～5g/L，MgSO₄·7H₂O0.25～3g/L，CuSO₄·5H₂O0.5～2mmol/L，其余为水。

8.根据权利要求7所述的一种制备漆酶的方法，其特征是所述碳源选自以下一种或几种：葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糊精、麦芽糖或玉米粉。

9.根据权利要求7所述的一种制备漆酶的方法，其特征是所述氮源选自以下一种或几种：酵母浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、低温黄豆饼粉、磷酸二氢铵或硫酸铵。

10.根据权利要求7所述的1或3的一种制备漆酶的方法，其特征是所述发酵培养基为：果糖48g/L，玉米粉12g/L，胰蛋白胨9g/L，磷酸二氢铵1g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，CuSO₄·5H₂O1mmol/L，其余为水。