CN104710438A - 促进iPS细胞产生的螺环类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可提高iPS细胞诱导效率的螺环骨架小分子化合物，其为如下通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐。试验表明该类螺环化合物有效地提高了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的诱导效率，可在亚微摩尔级浓度下提高四因子诱导的MEF细胞的重编程效率并加快重编程的进程。本发明提供的高效率诱导iPS细胞的方法对iPS技术安全性的提高和iPS细胞在再生医学领域的应用有重要意义。

Description

促进iPS细胞产生的螺环类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体而言，涉及一种螺环类化合物及其制备方法，以及所述化合物作为促进iPS细胞产生的小分子调节剂，在促进iPS细胞生成及体细胞重编程作用机制研究中的用途。
背景技术
多能干细胞(Pluripotent stem cells,PSCs)具有在较长时间内自我更新并在体内或体外分化成三个胚层的所有细胞类型的能力。多能干细胞主要包括胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)、上胚层干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs)、种系干细胞(germline stem cells)以及由体细胞重编程产生的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。相比之下，已分化的组织和器官中的谱系限制性干细胞和祖细胞的自我更新和分化潜能较为有限，但它们也基本代表了细胞替代疗法和生物医学研究所需的理想的细胞类型。要将干细胞及其调控方法引用到临床，首先必须了解在体外或体内控制细胞命运和功能的分子机制并设计改进的操作方法。人源胚胎干细胞(human ESCS,hESCs)为人体各种功能细胞类型提供了潜在的无限的细胞来源。然而，迄今为止尚未成功地从体细胞核移植胚胎产生特定病人的hESCs，人源胚胎以及体细胞核移植胚胎的使用也存在伦理问题。另一个潜在的多能干细胞的来源是将已分化的体细胞重编程到多能状态。这种方法有两个应用优势：1)规避了使用胚胎源干细胞的伦理问题，2)采用患者自身的细胞而限制了免疫排斥。2006年，Takahashi和Yamanaka报道了小鼠体细胞可通过异位表达特定的转录因子（如Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）进行重编程而获得多能性，由此产生iPSCs。2007年，科学家们获得了由人源体细胞经重编程产生的iPSCs，这一研究成果进一步拓展了iPSCs在再生医学领域的应用潜能。这些iPSCs在体外及体内的总体基因表达、表观遗传学特征和发育潜能都与ESCs非常相似，这也为表观遗传重编程、开发个性化的细胞替代治疗、疾病模型和药物发现的研究工作提供了前所未有的契机。
然而，传统的iPSC技术存在诸多妨碍其实际应用的关键性弊端。首先，对体细胞的重编程需要进行永久性基因修饰，而其中所使用的外源性基因（例如，Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个重编程因子中的任一个）或是病毒转染系统都可能具有潜在的致癌性。目前，这一问题已得到部分解决，研究人员通过基于质粒、蛋白或修饰RNA的策略替代病毒转染系统，成功实现了无病毒的细胞重编程过程。然而，这些实验条件却降低了整个重编程过程的速率和效率。其次，由上述四因子诱导的重编程过程一般都包含非特异或随机的步进式过程，这使得生成iPS细胞只是诸多可能的细胞命运之一，这也是导致传统iPSC技术低效率（只有0.001%-0.005%）和慢动力学的原因。重编程过程的这种内在的随机性也可能成为iPS细胞的隐患，例如重编程过程中残存的表观遗传学记忆、引入不适当的表观遗传学变化和一些敏感基因和表观遗传异常的累积和选择（可能增强了细胞生长途径而削弱了肿瘤抑制途径）。如今，在有效生成更安全的iPSCs方面已取得了实质性的进展：研究人员已找到了一些可提高重编程效率和动力学或替代外源性重编程转录因子功能的小分子化合物。例如，研究人员发现一些可直接调控表观遗传学相关的酶和机制的小分子化合物可促进重编程，其中包括组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶和DNA甲基转移酶的抑制剂。此外，化学筛选和后续的机制研究也确定了iPS细胞生成过程中所涉及的关键信号通路，包括钙调机制、Wnt/β-catenin信号通路的激活以及TGF-β信号通路的抑制。最近，研究人员又成功地运用小分子化合物替代了重编程因子(Sox2、Klf4和c-Myc)的功能，只用Oct4一个因子将多种鼠源或人源的细胞类型转化为iPS细胞。这些研究成果不仅为产生iPSCs提供了更好的条件，也为揭示重编程的分子机制提供了一类独特方法。
相比于传统的基于蛋白和基因的方法，通过化学方法调控细胞的重编程进程更具实用性。首先，基于小分子化合物的重编程与体细胞核移植或基于转录因子的重编程（利用基因、蛋白或mRNA）存在本质区别。体细胞核移植和基于转录因子的重编程都依靠天然来源（来源于卵母细胞或在细胞中异位表达或通过其它方式引入）的主要转录因子直接作用。而合成的小分子化合物并不具有特异的DNA识别区或转录调节区，它们通过对转录和表观遗传调控进行非直接的调节来诱导重编程。其次，传统生物分子很难生产和操作，这使得它们的使用非常有限。生物分子的作用效果不稳定，基因开关只有有和无两种状态，因而不能进行微调。传统的生物分子在同一时间只能调控一个靶点，而在一个特定组织中引入多个生物分子在技术上也较难实现。相比之下，小分子化合物可被高效地传递入细胞或是靶向到特定的组织，通过作用于信号通路的节点对特定的表型进行靶向的多通路的可逆调控，通过调节剂量可使化合物达到最佳疗效，而通过进一步的结构改造也可使化合物的作用效果、安全性和稳定性得以提高。此外，小分子化合物的生产更为廉价，可根据需求缩放其生产规模。这些优势都使小分子化合物在iPSC技术的发展中占据了有利地位。重要的是，小分子化合物也为从非特异性的基于转录因子的重编程过程向真正的定向重编程过程的根本转变提供了可能。
发明内容
在干细胞生物学领域，多数活性小分子的发现来源于基于细胞表型、报告基因或生物体的高通量筛选。在对先导化合物的靶点和相关信号通路进行进一步的确定后，再从生物化学、药理学和生理需求等方面对其进行进一步的优化。基于此，本发明人利用96孔板的四因子诱导的重编程筛选体系对小分子化合物库进行了基于细胞表型的筛选。从中，本发明人发现了具有螺环结构的阳性化合物可在微摩尔级浓度下提高重编程效率并加快重编程的进程。本发明人对此类螺环骨架化合物进行了结构改造和构效关系研究，获得了一系列可在亚微摩尔级浓度下有效促进iPS细胞产生并加快重编程进程的螺环类化合物，由此完成本发明。
本发明的一个目的在于提供一种新型的螺环类化合物。
本发明的另一目的在于提供所述螺环类化合物的制备方法。
本发明的还一目的在于提供一种制备诱导多能干细胞的方法。
本发明的又一目的在于提供所述的螺环类化合物在制备用于促进iPS细胞生成的药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供所述的螺环类化合物在体细胞重编程作用机制研究中的应用。
根据本发明的一方面，本发明提供如下通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
Z为CR1或N；
R1、R2、R3和R4各自独立地为H；卤素原子；取代或未取代的氨基；氰基；取代或未取代的C1-C20烷基；取代或未取代的C2-C6烯基；取代或未取代的C2-C6炔基；取代或未取代的C3-C8环烷基；取代或未取代的C1-C14烷氧基；取代或未取代的C2-C6烯氧基；取代或未取代的C2-C6炔氧基；取代或未取代的C6-C12芳基；取代或未取代的芴基；取代或未取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基；取代或未取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂芳基；取代或未取代的苯并的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂环基；取代或未取代的苯并的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂芳基；或者取代或未取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H；取代或未取代的C1-C6烷基；取代或未取代的C2-C6烯基；取代或未取代的C2-C6炔基；卤素原子；氰基；硝基；氨基；取代或未取代的C1-C6烷氧基；取代或未取代的C2-C6烯氧基；取代或未取代的C2-C6炔氧基；苄氧基；取代或未取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；取代或未取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基；
X为-O-；-S-；-[C(R10R11)]t-，其中t为1或2；-S(O)rC(R10R11)-，其中r为0、1或2；或-OC(R10R11)-；其中，各个R10和R11各自独立地为H、C1-C4烷基、C6-C12芳基或卤素原子，优选各自独立地为H、甲基、苯基或卤素原子，更优选各自独立地为H、甲基、或卤素原子，特别优选为H；最优选地，X为-O-、-SCH2-、-OCH2-、-CH2-、-CH2CH2-、-S(=O)CH2-或-S(O2)CH2-；
Y为-C(R12R13)-或-N=NC(R14R15)-；其中，R12和R13各自独立地为H、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基羰基或羧基，并优选各自独立地为H、甲基、乙氧基羰基、甲氧基羰基或羧基；R14和R15各自独立地为H或C1-C4烷基，并优选各自独立地为H或甲基，特别优选为H；优选地，Y为-CH2-、-N=NCH2-、-CH(CH3)-、-C(CH3)2-或-CH(COOEt)-。
上述通式I所示的螺环类化合物中，优选地，R1、R2、R3和R4各自独立地为H；卤素原子；氨基；氰基；C1-C14烷基；卤代C1-C14烷基；C2-C6烯基；卤代C2-C6烯基；C2-C6炔基；取代或未取代的C3-C6环烷基；C1-C8烷氧基；卤代C1-C6烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；取代或未取代的吗啉基；取代或未取代的哌嗪基；取代或未取代的哌啶基；取代或未取代的苯基；取代或未取代的芴基；取代或未取代的嘧啶基；取代或未取代的吡唑基；取代或未取代的咪唑基；取代或未取代的噻吩基；取代或未取代的吡啶基；取代或未取代的苯并吡啶基；取代或未取代的苯并吡唑基；取代或未取代的苯并噻吩基；取代或未取代的二氮丙啶基；取代或未取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；更优选地，R1、R2、R3和R4各自独立地为H；F；Cl；Br；氨基；氰基；甲基；乙基；叔丁基；十四烷基；三氟甲基；4-溴正丁氧基、8-叠氮正辛氧基；烯丙基；环丙基；甲氧基；三氟甲氧基；吗啉基；哌嗪基；苯基；芴基；嘧啶基；吡唑基；噻吩基；吡啶基；苯并吡啶基；苯并吡唑基；苯并噻吩基；二氮丙啶基；由选自卤素、甲基、氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、卤代吡啶基、噻吩基、哌嗪基、4-甲基哌嗪基、哌啶基、C1-C4烷氧基羰基哌啶基、吗啉基和C1-C4烷氧基羰基吗啉基中的取代基取代的吗啉基、哌嗪基、苯基、芴基、嘧啶基、吡唑基、噻吩基、吡啶基、苯并吡啶基、苯并吡唑基、苯并噻吩基或二氮丙啶基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或由选自氨基或C1-C4烷氧基羰基氨基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4。
上述通式I所示的螺环类化合物中，优选地，所述R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H；取代或未取代的C1-C6烷基，更优选为未取代或由一个、两个或三个卤素原子取代的甲基；卤素原子；氰基；硝基；氨基；取代或未取代的C1-C5烷氧基；取代或未取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；或取代或未取代的二氮丙啶基；最优选地，R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H；甲基；三氟甲基；甲氧基；三氟甲氧基；苄氧基；F；Cl；Br；硝基；氨基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；由选自氨基或C1-C4烷氧基羰基氨基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或由三氟甲基取代的二氮丙啶基；
上述通式I所示的螺环类化合物中，所述取代的取代基可以为选自卤素；氨基；氰基；硝基；叠氮基；生物素；二氮丙啶基或三氟甲基取代的二氮丙啶基；C1-C6烷基；卤代C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；C1-C6烷氧基；卤代C1-C6烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；C2-C6烯氧基；C2-C6炔氧基；C1-C6烷氧基羰基；C1-C6烷氧基羰基氨基；未取代或由选自卤素、氨基、C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷氧基中的一个或多个基团取代的苯基；未取代或由选自卤素、氨基、C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷氧基、C1-C6烷氧基羰基中的一个或多个基团取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基或五元或六元杂芳基中的一个或多个取代基；未取代或由选自叠氮基、C2-C6炔基、生物素中的一个或多个基团取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；优选地，所述取代的取代基可以为选自卤素；氨基；氰基；硝基；叠氮基；乙炔基；生物素；二氮丙啶基或三氟甲基取代的二氮丙啶基；C1-C4烷基；卤代C1-C4烷基；C2-C4烯基；C1-C4烷氧基；卤代C1-C4烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；C1-C4烷氧基羰基；C1-C4烷氧基羰基氨基；未取代或由选自卤素、氨基、C1-C2烷基、卤代C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、卤代C1-C2烷氧基、C1-C4烷氧基羰基中的一个或多个基团取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基或五元或六元杂芳基中的一个或多个取代基；未取代或由选自叠氮基、C2-C6末端炔基、生物素中的一个或多个基团取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2或3；更优选地，所述取代的取代基可以为选自F；Cl；Br；甲基；三氟甲基；甲氧基；三氟甲氧基；烯丙基；氨基；叔丁氧基羰基氨基；叠氮基；苯基；吡啶基；噻吩基；哌嗪基；哌啶基；吗啉基；由选自F、Cl、Br、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、叔丁氧基羰基中的一个或多个基团取代的吡啶基、噻吩基、哌嗪基、哌啶基或吗啉基中的一个或多个取代基。
本发明中，优选地，通式I所示的螺环类化合物选自通式II所示的化合物：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、X和Y的定义与通式I中的定义相同。
上述通式I所示的螺环类化合物中，优选地，R1、R2、R3和R4中的至少两个为氢；更优选地，R2、R3和R4中的至少两个为氢，特别优选地，R2和R4为氢。
上述通式I所示的螺环类化合物中，优选地，R5、R6、R7、R8和R9中的至少两个为氢；更优选地，R5、R6、R7、R8和R9中的至少三个为氢，特别优选地，R5、R6、R8和R9为氢，还优选的是，R7为甲氧基。
本发明中，优选地，通式I所示的螺环类化合物选自通式III所示的化合物：
其中，R1、R5、R6、R7、R8、R9、X和Y的定义与通式I中的定义相同。
本发明中，优选地，通式I所示的螺环类化合物选自通式Ⅳ所示的化合物：
其中，R1、R2、R7、R8、X和Y的定义与通式I中的定义相同。
在通式Ⅳ中，优选地，R2为H；卤素原子；C1-C8烷基；卤代C1-C8烷基；C1-C8烷氧基；卤代C1-C8烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C4烯基；C2-C4炔基；噻吩基；未取代或由氨基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷氧基或C1-C4烷基哌嗪基取代的苯基或吡啶基；三氟甲基二氮丙啶基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或由C1-C4烷氧基羰基氨基、C2-C6炔基、生物素或叠氮基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；更优选地，R2为H；F；Cl；Br；甲基；叔丁基；三氟甲基；环丙基；甲氧基；三氟甲氧基；4-溴正丁氧基；8-叠氮正辛氧基；苯基；噻吩基；吡啶基；由选自氨基、甲氧基、三氟甲氧基或4-甲基哌嗪基取代的苯基。
在通式Ⅳ中，优选地，R7为H；卤素原子；C1-C4烷基；卤代C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；卤代C1-C4烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；氰基；硝基；苄氧基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；由C1-C4烷氧基羰基氨基、C2-C6炔基、生物素或叠氮基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或三氟甲基二氮丙啶基。
在通式Ⅳ中，优选地，R8为H；卤素原子；C1-C4烷基；卤代C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；卤代C1-C4烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；氰基；硝基；苄氧基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；由C1-C4烷氧基羰基氨基、C2-C6炔基、生物素或叠氮基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或三氟甲基二氮丙啶基。
本发明中，优选地，通式I所示的螺环类化合物选自下列化合物：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R12和R13的定义与通式I中的定义相同。
本发明中作如下定义：
所述的烷基包括直链或支链的烷基；
所述的烷氧基包括直链或支链的烷氧基；
所述的链烯基包括直链或支链的链烯基；
所述的卤素包括F、Cl、Br和I；
所述C3-C8环烷基指的是环上含有3-8个碳原子的环烷基，非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基；
所述的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基指的是环上含有3-8个原子且至少含有一个选自O、N、S中的杂原子的非芳香性环基，非限制性地包括氮丙啶基、二氮丙啶基、四氢呋喃基、哌嗪基、吗啉基和哌啶基；
所述的C6-C12芳基指的是环上含有6-12个碳原子且不包含杂原子的芳香性环基，非限制性地包括苯基和萘基；
所述的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂芳基指的是环上含有5或6个原子且至少含有一个选自O、N、S中的杂原子的芳香性环基，非限制性地包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、吡啶基、嘧啶基和三嗪基。
本发明的螺环类化合物最优选选自如下化合物之中：
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一
酮1和取代苯甲醛2发生羟醛缩合，得到α,β-不饱和酮3；所述反应例如可以以乙醇为溶剂，在碱性条件（例如8M NaOH溶液中）下在室温下进行；反应产物酮3可通过过滤或硅胶柱层析进行纯化。
步骤二
α,β-不饱和酮3与硫叶立德反应，得到环丙烷螺环类化合物I-1；所述硫叶立德例如为所述反应例如可以在例如无水DMSO和四氢呋喃的溶剂中在例如NaH存在下进行；
或者
α,β-不饱和酮3与重氮甲烷反应，得到二氢吡唑螺环类化合物I-2；所述反应可以在例如二氯甲烷和乙醚的溶剂中在例如-78℃的温度下进行；
或者
α,β-不饱和酮3与（R12甲基）二甲基溴化硫鎓反应，得到R12取代的环丙烷螺环类化合物I-3；所述反应在例如二氯甲烷的溶剂中在例如1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）存在下在例如回流的条件下进行；
或者
α,β-不饱和酮3与R12R13CHNO2反应，得到R12和R13取代的环丙烷螺环类化合物I-4；所述反应在例如干燥DMSO的溶剂中在例如叔丁醇钾存在下在室温下进行；
或者
环丙烷螺环类化合物4与1当量或2当量的间氯过氧苯甲酸（m-CPBA）反应，得到环丙烷螺环亚砜类化合物I-5或环丙烷螺环砜类化合物I-6；所述反应可以在例如氯仿的溶剂中进行；
或者
环丙烷螺环类化合物5与R1B(OH)2或通过Suzuki偶联反应得到环丙烷螺环类化合物I-7，其中，U为溴或氯；
反应式中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R12、R13、X和Z定义如上所述。上述酮1可以为市售化合物或者用本领域中公知的方法制备得到。例如，可以采用下面方法制备得到二氢苯并噻喃-4-酮化合物：
取代硫醇a与3-溴丙酸在碱性条件（例如在Na2CO3和NaOH溶液中）下反应得到3-苯硫基丙酸，然后3-苯硫基丙酸在浓硫酸中脱水关环得到中间体二氢苯并噻喃-4-酮。
以上反应的反应时间根据具体反应物而定。通常用TLC来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后一般采用的后处理方法包括抽滤、浓缩反应液除尽溶剂、重结晶、萃取、柱层析分离等。最终产物用核磁共振谱图来鉴定。
根据本发明的又一方面，提供根据本发明的螺环类化合物在制备用于促进iPS细胞生成的药物中的应用。
根据本发明的又一方面，提供一种药物组合物，其包含根据本发明的螺环类化合物。
根据本发明的又一方面，提供所述的螺环类化合物在体细胞重编程作用机制研究中的应用。
根据本发明的又一个方面，提供了一种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，在诱导重编程过程中，使用根据本发明的螺环类化合物对体细胞进行处理。
本发明中，优选地，使用选自Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc中的至少一种重编程因子诱导重编程。
根据本发明的再一个方面，提供了上述通式I所示的螺环类化合物作为提高iPS细胞诱导效率的小分子调节剂的用途。
本发明设计与合成的一类新型的螺环类化合物；能有效促进iPS细胞的生成并加快体细胞重编程进程，可作为促进iPS细胞生成的小分子调节剂并应用于体细胞重编程的作用机制研究。
附图说明
图1为显示添加小分子化合物CYT296的干细胞培养基提高四因子诱导iPS效率并加快iPS诱导进程的图。其中：A为显示感染后第15天96孔板内三副孔的代表性图像的照片，其中，250nM CYT296处理的孔中出现较多的Oct-GFP阳性克隆；B为显示对Oct-GFP阳性克隆的统计数据的图，在感染后第15天，250nM CYT296处理的孔中观察到70个左右Oct-GFP阳性克隆，而对照孔观察到1-3个克隆。与对照组相比，***，p<0.001；C为显示添加不同浓度CYT296的Oct4-GFP阳性克隆的统计数据的图，其中CYT296的有效浓度为250nM，***，p<0.001。阴性对照为2%DMSO处理。
图2为显示流式细胞仪检测小分子化合物CYT296提高四因子诱导iPS效率的图。其中：A为显示感染后第15天细胞消化后经流式细胞仪分析的GFP阳性细胞百分比的图；B为显示3次独立实验的统计数据的图。**，p<0.01。阴性对照为2%DMSO处理。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于这些实施例。
化合物制备实施例
在下述制备实施例中，NMR用Varian生产的Mercury-Vx300M仪器测定，NMR定标：δH7.26ppm（CDCl3）；质谱用Agilent1200Quadrupole LC/MS液质联用仪；试剂主要由上海化学试剂公司提供；TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产，型号HSGF254；化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产，型号zcx-11，200-300目。
制备实施例1(±)4-苯基-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（化合物CYT324T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT282）的合成
二氢苯并噻喃-4-酮（500mg,1.0eq,3mmol）与4-甲氧基苯甲醛（415mg,1.0eq,3mmol）溶于6mL乙醇中，室温下缓慢加入8M NaOH水溶液（1.2eq,0.45mL），室温（r.t.）搅拌2小时。过滤，固体依次用乙醇、水和乙醇洗涤，抽干得化合物CYT282（720mg，产率85%），黄色固体。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.81(s,3H),4.12(s,2H),6.93(d,J=9.0Hz,2H),7.18–7.27(m,2H),7.33–7.37(d,3H),7.77(s,1H),8.16(d,J=8.1Hz,1H).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ29.4,55.4,114.3,125.8,127.5,127.9,130.4,130.9,131.5,132.5,132.9,137.7,144.9,160.3,185.8。
步骤二：(±)4-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（CYT324T）的合成
中间体CYT282（268mg,1.0eq,0.71mmol）溶于8mL二氯甲烷中，干冰丙酮浴下缓慢滴加重氮甲烷（>10.0eq）的乙醚溶液，-78℃下反应3天。反应瓶接尾气吸收装置，水浴加热至40―50℃蒸出重氮甲烷至溶液呈无色澄清。浓缩反应液，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=25：1）得化合物CYT324T（78mg,产率25%），黄色胶状物。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.97(d,J=14.1Hz,1H),3.70(dd,J=2.1,8.1Hz,1H),3.76(s,3H),3.79(d,J=14.1Hz,1H),4.80(dd,J=8.1,17.7Hz,1H),5.08(dd,J=2.1,17.4Hz,1H),6.79(d,J=6.6Hz,2H),6.88(d,J=6.9Hz,2H),7.17–7.27(m,2H),7.40(t,J=8.1Hz,1H),8.09(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例2(±)(1R,2R)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT296）的合成
三甲基碘化亚砜（65mg,1.1eq,0.29mmol）和氢化钠（12mg,1.1eq,0.29mmol,60%）悬浮于1mL干燥二甲基亚砜（DMSO）中，氮气保护下室温搅拌30分钟。于上述溶液中逐滴滴加化合物CYT282（75mg,1.0eq,0.27mmol）的1mL干燥四氢呋喃（THF）溶液，室温搅拌过夜。反应液用水稀释，乙醚萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=25：1）得化合物CYT296（63mg，产率79%），无色胶状物。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(dd,J=4.5,7.2Hz,1H),1.95(dd,J=4.5,9.0Hz,1H),2.67(d,J=13.8Hz,1H),3,04(d,J=13.8Hz,1H),3.14(t,J=8.4Hz,1H),3.79(s,3H),6.84(d,J=8.4Hz,2H),7.16–7.25(m,4H),7.34(t,J=6.9Hz,1H),8.07(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例3(±)4-(2-甲氧基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（化合物CYT324-2T）的合成
步骤一：(Z)-3-(2-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT282-2）的合成
除了使用2-甲氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(2-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率60%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.83(s,3H),4.03(s,2H),6.93(d,J=8.4Hz,1H),6.98(t,J=7.5Hz,1H),7.22–7.29(m,3H),7.32–7.36(m,2H),7.89(s,1H),8.20(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤二：(±)4-(2-甲氧基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（CYT324-2T）的合成
除了使用中间体CYT282-2替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例1步骤二的方法，制备得(±)4-(2-甲氧基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮，反应产率63%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.08(d,J=14.1Hz,1H),3.48(d,J=14.1Hz,1H),3.68(s,3H),4.18(dd,J=2.7,9.0Hz,1H),4.82(dd,J=8.7,17.7Hz,1H),5.09(dd,J=2.7,18.0Hz,1H),6.83–6.90(m,3H),7.17–7.29(m,3H),7.38(t,J=6.6Hz,1H),8.11(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例4(±)(1R,2R)-2-(2,4-二甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT326T-D）的合成
步骤一：(Z)-3-(2,4-二甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT312）的合成
除了使用2,4-二甲氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(2,4-二甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率93%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.83(s,6H),4.06(s,2H),6.49–6.54(m,2H),7.19–7.36(m,4H),7.87(s,1H),8.18(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-2-(2,4-二甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT326T-D）
除了使用中间体CYT312替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-2-(3,5-二甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率40%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47(dd,J=4.2,7.2Hz,1H),1.85(dd,J=4.2,8.7Hz,1H),2.73(d,J=13.8Hz,1H),2.83(d,J=13.8Hz,1H),3.14(t,J=8.4Hz,1H),3.71(s,3H),3.81(s,3H),6.42-6.46(m,2H),7.01(d,J=9.0Hz,1H),7.17-7.37(m,3H),8.12(dt,J=0.6,8.1Hz,1H)。
制备实施例5(±)4-(2,4-二甲氧基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（化合物CYT354T）的合成
除了使用化合物CYT312替代化合物CYT282以外，按照上述制备实施例1步骤二的方法，制备得4-(2,4-二甲氧基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮，反应产率37%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.06(d,J=14.1Hz,1H),3.52(d,J=13.8Hz,1H),3.66(s,3H),3.79(s,3H),4.03(dd,J=2.4,8.4Hz,1H),4.80(dd,J=8.4,18.0,1H),5.05(dd,J=2.1,18.0Hz,1H),6.40–6.43(m,2H),6.77(d,J=9.0Hz,1H),7.19(t,J=8.1Hz,1H),7.25(d,J=6.6Hz,1H),7.41(t,J=7.5Hz,1H),8.10(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例6化合物CYT334的合成：(±)(1R,2S)-2-(4-三氟甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮
步骤一：(Z)-3-(4-三氟甲基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT320-4T）的合成
除了使用4-三氟甲基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-三氟甲基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率93%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.02(s,3H),7.39(d,J=8.1Hz,2H),7.48–7.56(m,5H),8.55(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(4-三氟甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT334）的合成
除了使用中间体CYT320-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(4-三氟甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率15%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(t,J=6.3Hz,1H),1.65(t,J=6.0Hz,1H),2.62(t,J=6.3Hz,1H),2.88(d,J=15.0Hz,1H),3.73(d,J=15.3Hz,1H),7.18–7.26(m,2H),7.36–7.42(m,3H),7.55(d,J=8.4Hz,2H),7.94(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例7(±)4-(4-氯苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（化合物CYT329-4T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT287-4T）的合成
除了使用4-氯苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率91%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.06(s,3H),7.22–7.41(m,6H),7.69(s,1H),8.18(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤二：(±)4-(4-氯苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（CYT329-4T）的合成
除了使用中间体CYT287-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例1步骤二的方法，制备得(±)4-(4-氯苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮，反应产率58%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.95(d,J=13.8Hz,1H),3.72(dd,J=2.1,7.8Hz,1H),3.80(d,J=14.1Hz,1H),4.81(dd,J=7.5,17.4Hz,1H),5.07(dd,J=2.1,18.0Hz,1H),6.92(d,J=8.4Hz,2H),7.19–7.28(m,4H),7.42(t,J=8.1Hz,1H),8.09(d,J=7.8Hz,1H)。
实施例8(±)4-(4-甲基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（化合物CYT308-4T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-甲基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT266-4T）和(E)-3-(4-甲基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT266-4C）的合成
除了使用4-甲基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-甲基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮CYT266-4C，反应产率30%，和(E)-3-(4-甲基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮CYT266-4T，反应产率37%。
化合物CYT266-4C：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.34(s,3H),3.96(s,2H),7.13–7.19(m,4H),7.38(s,1H),7.49–7.58(m,3H),8.59(d,J=7.5Hz,1H)。
化合物CYT266-4T：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.38(s,3H),4.11(s,2H),7.20–7.37(m,6H),7.53(s,1H),8.18(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)4-(4-甲基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（CYT308-4T）的合成
除了使用中间体CYT266-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例1步骤二的方法，制备得(±)4-(4-甲基苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮，反应产率84%。Z构型中间体CYT266-4C不能发生此反应。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.31(s,3H),3.00(d,J=14.1Hz,1H),3.72–3.77(m,2H),4.82(dd,J=8.1,18.0Hz,1H),5.10(d,J=17.7Hz,1H),6.86(d,J=7.8Hz,2H),7.08(d,J=7.8Hz,2H),7.18–7.27(m,2H),7.45(t,J=8.1Hz,1H),8.10(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例9(±)(1R,2R)-2-(4-甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT280-4T）的合成
除了使用中间体CYT266-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-2-(4-甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率86%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.52(dd,J=4.5,7.5Hz,1H),1.95(dd,J=4.2,8.4Hz,1H),2.35(s,3H),2.74(d,J=13.5Hz,1H),3.02(d,J=13.5Hz,1H),3.20(t,J=8.4Hz,1H),7.13(d,J=7.5Hz,2H),7.18-7.28(m,4H),7.35(d,J=7.2Hz,1H),8.09(dt,J=1.2,8.1Hz,1H)。
制备实施例10(±)(1R,2S)-2-(4-甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT280-4C）的合成
除了使用中间体CYT266-4C替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(4-甲基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率31%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.33(t,J=6.3Hz,1H),1.57(dd,J=6.0,7.8Hz,1H),2.32(s,3H),2.53(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.96(d,J=14.7Hz,1H),3.57(d,J=14.4Hz,1H),7.03–7.07(m,4H),7.11–7.24(m,2H),7.38(t,J=7.2Hz,1H),7.97(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例11(±)(1R,2S)-2-(2-氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮化合物CYT301-2T的合成
步骤一：(Z)-3-(2-氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT287-2T）的合成
除了使用2-氯苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(E)-3-(2-氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率83%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.12(s,3H),7.20–7.26(m,2H),7.35–7.41(m,3H),7.51–7.58(m,3H),8.60(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(2-氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT301-2T）的合成
除了使用中间体CYT287-2T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2-氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率37%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.41(t,J=6.6Hz,1H),1.60(t,J=6.3Hz,1H),2.53(t,J=6.6Hz,1H),3.11(d,J=15.3Hz,1H),3.81(d,J=15.6Hz,1H),7.17–7.28(m,5H),7.35–7.42(m,2H),7.98(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例12(±)(1R,2S)-2-(3-氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT301-3T）的合成
步骤一：(Z)-3-(3-氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT287-3T）的合成
除了使用3-氯苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(3-氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率90%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.94(s,2H),7.17–7.25(m,4H),7.45–7.55(m,4H),8.55(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(3-氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT301-3T）的合成
除了使用中间体CYT287-3T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(3-氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率43%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.42(t,J=6.6Hz,1H),1.61(dd,J=6.3,8.4Hz,1H),2.59(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.87(d,J=14.7,1H),3.61(d,J=15.0Hz,1H),7.11–7.24(m,6H),7.39(t,J=7.5Hz,1H),7.95(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例13(±)(1R,2S)-2-(2,4,5-三氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT320-3T）的合成
步骤一：(Z)-3-(2,4,5-三氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT306T）的合成
除了使用2,4,5-三氟苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(2,4,5-三氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率72%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.91(s,3H),6.87–6.89(m,1H),7.21–7.25(m,1H),7.46–7.55(m,3H),7.63(s,1H),8.51(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(2,4,5-三氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT320-3T）的合成
除了使用中间体CYT306T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2,4,5-三氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率13%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(t,J=6.3Hz,1H),1.69(dd,J=6.0,7.8Hz,1H),2.72(dd,J=6.3,7.5Hz,1H),2.78(d,J=15.0Hz,1H),3.57(d,J=15.0Hz,1H),6.85–6.94(m,1H),7.17–7.32(m,3H),7.39(t,J=7.5Hz,1H),7.93(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例14(±)4-(4-溴苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（化合物CYT373-4T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-溴苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT331-4T）的合成
除了使用4-溴苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-溴苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率80%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.07(s,2H),7.26–7.33(m,4H),7.39(t,J=7.2Hz,1H),7.58(d,J=6.9Hz,2H),7.68(s,1H),8.19(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)4-(4-溴苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮（CYT373-4T）的合成
除了使用中间体CYT331-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例1步骤二的方法，制备得(±)4-(4-溴苯基)-4,5-二氢螺[吡唑-3,3’-苯并噻喃]-4’-酮，反应产率60%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.96(d,J=14.1Hz,1H),3.70(dd,J=2.1,7.8Hz,1H),3.83(d,J=14.1Hz,1H),4.82(dd,J=7.8,17.7Hz,1H),5.07(dd,J=2.1,17.7Hz,1H),6.86(d,J=8.4Hz,2H),7.20–7.29(m,2H),7.42(d,J=8.1Hz,2H),7.45(t,J=8.1Hz,1H),8.11(d,J=6.9,1H)。
制备实施例15(±)(1R,2S)-2-苯基螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT266T）的合成：
步骤一：(Z)-3-(苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT252T）的合成
除了使用苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率86%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.97(s,2H),7.21–7.35(m,5H),7.45–7.48(m,3H),8.56(d,J=7.2Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-苯基螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT266T）
除了使用中间体CYT252T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-苯基螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率32%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.36(t,J=6.3Hz,1H),1.57(dd,J=6.3,8.1Hz,1H),2.53(t,J=6.6Hz,1H),2.96(d,J=15.0Hz,1H),3.62(d,J=14.7Hz,1H),7.15–7.29(m,8H),7.34(t,J=7.5Hz,1H),7.96(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例16(±)(1R,2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT326T）的合成
步骤一：(Z)-3-(3,5-二甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT312T）的合成
除了使用3,5-二甲氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(3,5-二甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率91%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.77(s,6H),3.93(s,2H),6.36(s,1H),6.42(s,2H),7.42(s,1H),7.51–7.59(m,3H),8.59(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT326T）的合成
除了使用中间体CYT312T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率17%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.37(t,J=6.3Hz,1H),1.61(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.58(t,J=7.8Hz,1H),2.90(d,J=15.0Hz,1H),3.59(d,J=15.0Hz,1H),3.76(s,3H),6.32(s,1H),6.37(s,2H),7.17–7.23(m,2H),7.38(t,J=7.5Hz,1H),7.95(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例17(±)(1R,2S)-2-(4-氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT284-4T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT270-4T）的合成
除了使用4-氟苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率54%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.94(s,2H),6.99(t,J=8.7Hz,2H),7.23(dd,J=5.4,8.1Hz,1H),7.41(s,1H),7.48–7.55(m,4H),8.56(d,J=7.5Hz,1H)。
除了使用中间体CYT270-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(4-氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率31%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.39(t,J=6.0Hz,1H),1.59(dd,J=6.0,7.8Hz,1H),2.56(dd,J=6.3,7.5Hz,1H),2.86(d,J=15.0,1H),3.61(d,J=15.0Hz,1H),6.98(dd,J=1.8,6.6Hz,1H),7.16–7.23(m,4H),7.38(t,J=7.8Hz,1H),7.95(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例18(±)(1R,2S)-2-(2-氯4-氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT319T）的合成
步骤一：(Z)-3-(2-氯-4-氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT305T）
除了使用2-氯-4-氟苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(2-氯-4-氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率95%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.03(s,2H),6.92(t,J=7.8Hz,1H),7.09(d,J=8.7Hz,1H),7.33(t,J=8.1Hz,1H),7.39(s,1H),7.45–7.55(m,3H),8.53(d,J=7.5Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(2-氯4-氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT319T）
除了使用中间体CYT305T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2-4-氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率60%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.43(t,J=6.3Hz,1H),1.61(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.56(dd,J=6.6,7.8Hz,1H),3.02(d,J=15.3Hz,1H),3.77(d,J=15.3Hz,1H),6.92(dt,J=2.4,8.1Hz,1H),7.12(dd,J=2.4,8.1Hz,1H),7.19–7.29(m,3H),7.40(t,J=7.8Hz,1H),7.96(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例19(±)(1R,2S)-2-(4-氰基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT291-4T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-氰基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT277-4T）的合成
除了使用4-氰基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-氰基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率90%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.00(s,2H),7.37(d,J=7.8Hz,1H),7.49–7.58(m,6H),8.50(d,J=7.5Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(4-氰基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT291-4T）的合成
除了使用中间体CYT277-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(4-氰基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率31%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(t,J=6.0Hz,1H),1.67(dd,J=6.0,7.8Hz,1H),2.65(dd,J=6.3,8.1Hz,1H),2.80(d,J=15.6Hz,1H),3.74(d,J=15.3Hz,1H),7.17–7.23(m,2H),7.36–7.42(m,3H),7.56(d,J=8.4Hz,2H),7.91(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例20(±)(1R,2S)-2-(2,4-二氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT335T）的合成
步骤一：(Z)-3-(2,4-二氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT321T）
除了使用2,4-二氯苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(2,4-二氯苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率89%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.03(s,2H),7.15(d,J=8.1Hz,1H),7.30(d,J=8.1Hz,1H),7.33(s,1H),7.43–7.50(m,4H),8.53(d,J=7.5Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(2,4-二氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT335T）
除了使用中间体CYT321T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2,4-二氯苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率65%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(t,J=6.3Hz,1H),1.62(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.57(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),3.00(d,J=15.9Hz,1H),3.78(d,J=15.6Hz,1H),7.16–7.26(m,4H),7.38–7.43(m,2H),7.96(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例21(±)(1R,2S)-2-(4-硝基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT311T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-硝基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT297-4T）的合成
除了使用4-硝基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-硝基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率72%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.06(s,2H),7.44(d,J=8.7Hz,2H),7.49–7.63(m,4H),8.12(d,J=8.7Hz,2H),8.52(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(4-硝基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT311T）的合成
除了使用中间体CYT297-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(4-硝基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率35%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.51(t,J=6.3Hz,1H),1.71(dd,J=6.3,7.5Hz,1H),2.68(t,J=6.6Hz,1H),2.85(d,J=15.3Hz,1H),3.79(d,J=15.6Hz,1H),7.19–7.26(m,2H),7.38–7.46(m,3H),7.93(d,J=7.5Hz,1H),8.15(d,J=8.1Hz,2H)。
制备实施例22(±)(1R,2R)-2-(3-氯-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT331T）的合成
步骤一：(Z)-3-(3-氯-4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT317T）的合成
除了使用3-氯-4-甲氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(3-氯-4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率95%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.94(s,3H),4.11(s,2H),6.98(d,J=8.4Hz,1H),7.22–7.31(m,3H),7.38(d,J=7.8Hz,1H),7.43(s,1H),7.65(s,1H),8.17(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-2-(3-氯-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT331T）的合成
除了使用中间体CYT317T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-2-(3-氯-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率73%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.44(dd,J=4.8,7.2Hz,1H),1.95(dd,J=4.5,9.0Hz,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.06(d,J=13.8Hz,1H),3.10(t,J=8.4Hz,1H),3.89(s,3H),6.87(d,J=8.1Hz,1H),7.18–7.37(m,5H),8.07(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例23(±)(1R,2S)-2-(2,5-二氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT302T）的合成
步骤一：(Z)-3-(2,5-二氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT288T）的合成
除了使用2,5-二氟苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(2,5-二氟苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率90%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.97(s,2H),6.86–7.10(m,3H),7.48–7.57(m,4H),8.55(d,J=7.8Hz,1H)
步骤二：(±)(1R,2S)-2-(2,5-二氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT302T）的合成
除了使用中间体CYT288T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2,5-二氟苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率85%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.44(t,J=6.3Hz,1H),1.68(t,J=6.3Hz,1H),2.70(t,J=6.9Hz,1H),2.87(d,J=15.0Hz,1H),3.63(d,J=15.0Hz,1H),6.83–7.02(m,2H),7.07–7.13(m,1H),7.17–7.26(m,2H),7.39(t,J=7.8Hz,1H),7.95(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例24(±)(1R,2R)-6’-氟-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT314S-4T4）的合成
步骤一：6-氟二氢苯并噻喃-4-酮（182-6）的合成
3-溴丙酸（500mg,1.0eq,3.27mmol）与Na2CO3（346mg,1.0eq,3.27mmol）溶于1mL冰水中，将此溶液加入到4-氟苯硫酚（348μL,1.0eq,3.27mmol）与NaOH（131mg,1.0eq,3.27mmol）的1mL水溶液中回流1.5小时。反应液用1M盐酸调至pH≈1，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得3-(4-氟苯硫基)丙酸，直接进行下一步反应。
所得3-(4-氟苯硫基)丙酸与1mL浓硫酸混合，室温放置过夜。于反应物中加入碎冰，乙酸乙酯萃取，有机相依次用水、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=3：1）得化合物182-6（300mg，两步产率50%），淡黄色固体。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.93-2.98(m,2H),3.21-3.25(m,2H),7.13(dt,J=3.0,8.1Hz,1H),7.24(dd,J=4.8,8.7Hz,1H),7.74(dd,J=2.7,9.3Hz,1H)。
步骤二：(Z)-6-氟-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT300T）和(E)-6-氟-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT300C）的合成
除了使用6-氟二氢苯并噻喃-4-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-6-氟-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮CYT300C，反应产率24%，和(E)-6-氟-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮CYT300T，反应产率10%。
化合物CYT300T：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.83(s,3H),4.13(s,2H),6.95(d,J=8.4Hz,2H),7.00-7.32(m,2H),7.75(s,1H),7.84(dd,J=2.7,9.3Hz,1H)。
化合物CYT300C：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.79(s,3H),3.92(s,2H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),7.17(d,J=8.7Hz,2H),7.34(tq,J=0.9,7.2Hz,1H),7.40(t,J=0.9Hz,1H),7.56(dd,J=4.8,9.0Hz,1H),7.83(d,J=9.0Hz,1H),8.24(dd,J=3.0,9.9Hz,1H)。
步骤三：(±)(1R,2R)-6’-氟-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT314S-4T4）的合成
除了使用中间体CYT300T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-6’-氟-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率30%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.50(dd,J=4.5,7.2Hz,1H),1.97(dd,J=4.8,8.7Hz,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.05(d,J=13.8Hz,1H),3.16(t,J=8.7Hz,1H),3.81(s,3H),6.86(d,J=8.4Hz,2H),7.10(dt,J=3.0,8.1Hz,1H),7.22-7.25(m,3H),7.76(dd,J=3.0,9.3Hz,1H)。
制备实施例25(±)(1R,2S)-6’-氟-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT314S-4C4）的合成
除了使用中间体CYT300C替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-6’-氟-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率52%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.31(t,J=5.7Hz,1H),1.57(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.54(dd,J=6.3,8.1Hz,1H),2.93(d,J=14.7Hz,1H),3.52(d,J=14.7Hz,1H),3.79(s,3H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),7.08-7.18(m,4H),7.66(dq,J=0.9,9.3Hz,1H)。
制备实施例26(±)(1R,2S)-8’-氯-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT331S-4T2）的合成
步骤一：8-氯二氢苯并噻喃-4-酮（199-8）的合成
除了使用2-氯苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得8-氯二氢苯并噻喃-4-酮，两步反应产率61%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.88-2.93(m,2H),3.18-3.22(m,2H),7.06(t,J=7.8Hz,1H),7.42(dd,J=1.2,8.1Hz,1H),7.97(dd,J=1.2,8.1Hz,1H)。
步骤二：(Z)-8-氯-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT317-8）的合成
除了使用化合物199-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-8-氯-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率40%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.79(s,3H),6.90(d,J=8.4Hz,2H),7.32-7.38(m,2H),7.52(d,J=7.8Hz,1H),7.74(d,J=8.7Hz,2H),8.41(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤三：(±)(1R,2S)-8’-氯-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT331S-4T2）的合成
除了使用中间体CYT317-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-8’-氯-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率18%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.33(t,J=6.3Hz,1H),1.57-1.61(m,1H),2.60(dd,J=6.3,7.8Hz,1H),2.92(d,J=15.0Hz,1H),3.52(d,J=15.0Hz,1H),3.78(s,3H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),7.17-7.21(m,3H),7.48(d,J=7.8Hz,1H),7.91(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例27(±)(1R,2R)-6’-氯-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT331S-4T4）的合成
步骤一：(Z)-6-氯-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（化合物CYT317-6）的合成
除了使用6-氯二氢苯并噻喃-4-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率30%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.86(s,3H),4.15(s,2H),6.97(d,J=8.7Hz,2H),7.25(d,J=8.1Hz,1H),7.33-7.39(m,3H),7.77(s,1H),8.15(d,J=2.4Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-6’-氯-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT331S-4T4）的合成
除了使用中间体CYT317-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-6’-氯-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率65%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.2,6.9Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),2.66(d,J=14.1Hz,1H),3.07(d,J=13.5Hz,1H),3.14(t,J=8.1Hz,1H),3.80(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.18-7.26(m,3H),7.31(dd,J=2.4,8.4Hz,1H),8.04(d,J=2.1Hz,1H)。
制备实施例28(±)(1R,2R)-6’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT326S-4T4）的合成
步骤一：6-甲氧基二氢苯并噻喃-4-酮（化合物194-6）的合成
除了使用4-甲氧基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得6-甲氧基二氢苯并噻喃-4-酮，两步反应产率39%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.94(dd,J=4.5,6.6Hz,2H),3.18(dd,J=4.5,6.9Hz,2H),3.79(s,3H),6.97(dd,J=3.0,8.4Hz,1H),7.15(d,J=8.7Hz,1H),7.59(d,J=3.0Hz,1H)。
步骤二：(Z)-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT312T）的合成
除了使用化合物194-6替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-6-甲氧基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率20%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.85(s,6H),4.12(s,2H),6.96(d,J=8.7Hz,2H),7.01(dd,J=3.0,8.7Hz,1H),7.21(d,J=8.7Hz,1H),7.38(d,J=8.7Hz,2H),7.69(d,J=2.7Hz,1H),7.76(s,1H)。
步骤三：(±)(1R,2R)-6’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT326S-4T4）的合成
除了使用中间体CYT312T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-6’-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率74%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47(m,1H),1.96(m,1H),2.67(d,J=13.5Hz,1H),3.00(d,J=13.5Hz,1H),3.74(s,3H),3.77(s,3H),6.85(d,J=7.2Hz,2H),6.98(dq,J=1.5,9.0Hz,1H),7.17(d,J=9.0Hz,1H),7.23(d,J=8.1Hz,2H),7.59(s,1H)。
制备实施例29(±)(1R,2R)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,2’-茚]-1’(3’H)-酮（化合物CYT264T）的合成
步骤一：(E)-2-(4-甲氧基苯烯基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮（CYT250T）的合成
除了使用2,3二氢-1H-茚-1-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(E)-2-(4-甲氧基苯烯基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮，反应产率47%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.88(s,3H),4.03(s,2H),6.99(d,J=8.7Hz,2H),7.43(t,J=7.5Hz,1H),7.57–7.67(m,5H),7.91(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,2’-茚]-1’(3’H)-酮（CYT264T）的合成
除了使用中间体CYT250T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,2’-茚]-1’(3’H)-酮，反应产率82%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.29(dd,J=4.8,7.2Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,9.0Hz,1H),2.78(d,J=18.0Hz,1H),2.88(t,J=7.5Hz,1H),2.97(d,J=17.7Hz,1H),3.80(s,3H),6.86(d,J=8.4Hz,2H),7.06(d,J=8.7Hz,2H),7.35-7.39(m,2H),7.53(t,J=8.1Hz,1H),7.79(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例30(±)(1'R,2'R)-2'-(3,4-二甲氧基苯基)-5-甲氧基-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮（化合物CYT326M）的合成
除了使用(Z)-2-(3,4-二甲氧基苯烯基)-5-甲氧基苯并呋喃-3(2H)-酮替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法的方法，制备得(±)(1'R,2'R)-2'-(3,4-二甲氧基苯基)-5-甲氧基-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮，一对光学异构体，反应产率56%。
制备实施例31(±)(1S,2R)-2-(4-甲氧基苯基)-3',4'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2’-萘]-1’-酮（化合物CYT278T）的合成
步骤一：(E)-2-(4-甲氧基苯烯基)-3,4-二氢萘-1(2H)-酮（CYT264TD）的合成
除了使用3,4-二氢萘-1(2H)-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(E)-2-(4-甲氧基苯烯基)-3,4-二氢萘-1(2H)-酮，反应产率64%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.86(t,J=6.0Hz,2H),3.08(t,J=6.0Hz,2H),3.79(s,3H),6.91(d,J=8.7Hz,2H),7.19(d,J=7.5Hz,1H),7.31–7.43(m,4H),7.83(s,1H),8.10(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1S,2R)-2-(4-甲氧基苯基)-3',4'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2’-萘]-1’-酮（CYT278T）的合成
除了使用中间体CYT264TD替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1S,2R)-2-(4-甲氧基苯基)-3',4'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2’-萘]-1’-酮，反应产率72%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.32(dd,J=4.5,7.2Hz,1H),1.66(m,1H),1.89(m,1H),1.93(dd,J=4.2,6.9Hz,1H),2.74(m,2H),2.97(t,J=8.7Hz,1H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.15-7.20(m,3H),7.32(t,J=7.2Hz,1H),7.45(t,J=7.2Hz,1H),8.05(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例32(±)(1'R,2'R)-2'-(4-甲氧基)-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮（化合物CYT266）的合成
步骤一：(Z)-2-(4-甲氧基苯烯基)苯并呋喃-3(2H)-酮（化合物CYT252）的合成
除了使用苯并呋喃-3(2H)-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-2-(4-甲氧基苯烯基)苯并呋喃-3(2H)-酮，反应产率80%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.83(s,3H),6.87(s,1H),6.94(d,J=9.3Hz,2H),7.17(t,J=7.8Hz,1H),7.28(d,J=8.4Hz,1H),7.60(dt,J=1.5,7.5Hz,1H),7.78(d,J=7.5Hz,1H),7.85(d,J=8.7Hz,2H)。
步骤二：(±)(1'R,2'R)-2'-(4-甲氧基)-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮（CYT266）的合成
除了使用中间体CYT252替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1'R,2'R)-2'-(4-甲氧基)-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮，反应产率73%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.05-2.19(m,2H),3.00(t,J=9.3Hz,1H),3.81(s,3H),6.88(d,J=9.0Hz,2H),7.08-7.17(m,2H),7.20(d,J=8.4Hz,2H),7.56(t,J=7.2Hz,1H),7.73(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例33(±)(1’S,2’R)-2’-(4-甲氧基苯基)螺[苯并二氢吡喃-3,1’-环丙烷]-4-酮（化合物CYT280C-4T）的合成
步骤一：(E)-3-(4-甲氧基苯烯基)苯并二氢吡喃-4-酮（CYT266T）的合成
除了使用苯并二氢吡喃-4-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(E)-3-(4-甲氧基苯烯基)苯并二氢吡喃-4-酮，反应产率30%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.87(s,3H),5.38(s,2H),6.95-7.00(m,3H),7.07(t,J=7.8Hz,1H),7.29(d,J=8.7Hz,2H),7.48(dt,J=1.8,7.2Hz,1H),7.84(s,1H),8.02(dd,J=1.5,7.5Hz,1H)。
步骤二：(±)(1’S,2’R)-2’-(4-甲氧基苯基)螺[苯并二氢吡喃-3,1’-环丙烷]-4-酮（CYT280C-4T）的合成
除了使用中间体CYT266T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1’S,2’R)-2’-(4-甲氧基苯基)螺[苯并二氢吡喃-3,1’-环丙烷]-4-酮，反应产率84%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.34(dd,J=4.8,6.9Hz,1H),2.03(dd,J=4.8,8.7Hz,1H),2.97(t,J=8.4Hz,1H),3.80(s,3H),3.92(d,J=12.0Hz,1H),4.34(d,J=12.0Hz,1H),6.87(d,J=8.7Hz,2H),6.94(d,J=8.4Hz,1H),7.05(t,J=7.8Hz,1H),7.18(d,J=8.7Hz,2H),7.47(t,J=8.1Hz,1H),7.95(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例34(±)(1R,2R)-2-(4-苄氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（化合物CYT372-4T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-苄氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT358T）的合成
除了使用4-苄氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得(Z)-3-(4-苄氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率71%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ4.15(s,2H),5.12(s,2H),7.03(d,J=8.7Hz,2H),7.22-7.46(m,10H),7.75(s,1H),8.18(dd,J=1.2,7.8Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-2-(4-苄氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（CYT372-4T）
除了使用中间体CYT358T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-2-(4-苄氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮，反应产率76%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.42(dd,J=4.8,7.2Hz,1H),1.93(dd,J=4.8,9.3Hz,1H),2.65(d,J=13.5Hz,1H),3.00(d,J=13.8Hz,1H),3.14(t,J=8.4Hz,1H),5.01(s,2H),6.91(d,J=8.4Hz,2H),7.13-7.42(m,10H),8.07(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例35(±)(1R,2R)-2-(4-(2-(2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT514T）的合成
步骤一：(Z)-3-(4-(2-(2-(2-叔丁氧羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT500-4T）的合成
化合物CYT358T（52mg,1.0eq,0.15mmol）和五甲基苯（Me5PhH）（215mg,15.0eq,1.5mmol）溶于2mL三氟醋酸（TFA），室温搅拌3小时。浓缩，加入饱和NaHCO3溶液将pH值调至7―8，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=5：1）得化合物CYT268-4，即(Z)-3-(4-羟基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（36mg，产率89%），黄色固体。直接进行下一步反应。
所得化合物(Z)-3-(4-羟基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（28mg,1.0eq,0.104mmol）溶于5mL丙酮，加入BrCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCOOC(CH3)3（33mg,1.0eq,0.104mmol）、碳酸钾（72mg,5.0eq,0.522mmol）和四正丁基碘化铵（Bu4NI）（19mg,0.5eq,0.052mmol），室温搅拌过夜。反应液浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=3：1）得化合物CYT500-4（23mg,产率44%），黄色固体。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.44(s,9H),3.32(q,J=5.1Hz,2H),3.56(t,J=5.1Hz,2H),3.64-3.67(m,2H),3.71-3.74(m,2H),3.86-3.90(m,2H),4.14(s,2H),4.18(t,J=5.1Hz,2H),5.04(br,1H),6.98(d,J=8.4Hz,2H),7.16-7.41(m,5H),7.74(s,1H),8.18(d,J=6.6Hz,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-2-(4-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（CYT514T）的合成
除了使用中间体CYT500-4T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-2-(4-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率73%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.44(s,9H),1.45-1.48(m,1H),1.96(dd,J=4.8,8.7Hz,1H),2.68(d,J=13.8Hz,1H),3.06(d,J=13.8Hz,1H),3.14(t,J=8.4Hz,1H),3.29-3.34(m,2H),3.55(t,J=5.4Hz,2H),3.63-3.66(m,2H),3.70-3.73(m,2H),3.86(t,J=5.4Hz,2H),4.14(t,J=5.1Hz,2H),6.87(d,J=8.7Hz,2H),7.18-7.27(m,4H),7.36(t,J=7.5Hz,1H),8.08(dt,J=0.6,7.8Hz,1H)。
制备实施例36(±)(1R,2S)-2-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT544-42T）的合成
步骤一：(Z)-3-(2-苄氧基4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT388-42T）的合成
除了使用2-苄氧基-4-甲氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得：(Z)-3-(2-苄氧基4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率79%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.78(s,3H),3.99(s,2H),5.03(s,2H),6.51(dd,J=2.4,8.1Hz,1H),6.57(d,J=2.4Hz,1H),7.26-7.37(m,6H),7.47-7.52(m,3H),8.59(d,J=6.6Hz,1H)。
步骤二：(Z)-3-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯烯基)噻喃-4-酮（CYT530-42T）的合成
除了使用化合物CYT388-42T替代化合物CYT358T以外，按照上述制备实施例35步骤一的方法，制备得化合物CYT530-42T，反应产率86%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.42(s,9H),3.26-3.30(m,2H),3.44-3.50(m,4H),3.58-3.61(m,2H),3.79-3.81(m,5H),3.93(s,2H),4.09(t,J=4.8Hz,2H),6.46-6.50(m,2H),7.24(d,J=8.1Hz,1H),7.48-7.57(m,3H),8.59(d,J=7.2Hz,1H).
步骤三：(±)(1R,2S)-2-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（CYT544-42T）的合成
除了使用中间体CYT530-42T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率77%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.25-1.28(m,1H),1.42(s,9H),1.54-1.59(m,1H),2.69(t,J=6.6Hz,1H),2.94(d,J=14.4Hz,1H),3.29-3.31(m,2H),3.50-3.55(m,2H),3.60-3.62(m,2H),3.67-3.69(m,2H),3.77(s,3H),3.83(t,J=4.5Hz,1H),4.09-4.10(m,2H),6.42-6.44(m,2H),7.14-7.21(m,3H),7.35(t,J=7.5Hz,1H),7.96(d,J=6.9Hz,1H)。
制备实施例37(±)(1R,2S)-2-(3-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT544-43T）的合成
步骤一：(Z)-3-(3-苄氧基4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT388-43T）的合成
除了使用3-苄氧基-4-甲氧基苯甲醛替代4-甲氧基苯甲醛以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得：(Z)-3-(3-苄氧基4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率89%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.87(s,5H),5.13(s,2H),6.78-6.87(m,3H),7.23-7.33(m,4H),7.39(d,J=7.2Hz,1H),7.51-7.59(m,3H),8.58(dd,J=0.6,7.5Hz,1H)。
步骤二：(Z)-3-(3-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯烯基)噻喃-4-酮（CYT530-43T）的合成
除了使用化合物CYT388-43T替代化合物CYT358T以外，按照上述制备实施例35步骤一的方法，制备得化合物CYT530-43T，反应产率89%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.37(s,9H),3.24-3.26(m,2H),3.48(t,J=5.4Hz,2H),3.54-3.57(m,2H),3.63-3.66(m,2H),3.78(s,3H),3.81(t,J=5.4Hz,2H),3.86(s,2H),4.12(t,J=5.4Hz,2H),6.78-6.79(m,3H),7.35(s,1H),7.45-7.52(m,3H),8.52(dd,J=1.2,7.5Hz,1H)。
步骤三：(±)(1R,2S)-2-(3-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（CYT544-43T）的合成
除了使用中间体CYT530-43T替代中间体CYT282以外，按照上述制备制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(3-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率63%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.41(s,9H),1.31-1.35(m,1H),1.56(dd,J=6.0,7.8Hz,1H),2.53(dd,J=6.3,8.1Hz,1H),2.86(d,J=14.7Hz,1H),3.28-3.32(m,2H),3.51-3.56(m,3H),3.59-3.62(m,2H),3.67-3.70(m,2H),3.80(s,3H),3.85(t,J=5.1Hz,2H),6.75-6.80(m,3H),7.15-7.21(m,2H),7.36(dt,J=1.5,7.5Hz,1H),7.93(dd,J=1.5,7.8Hz,1H)。
制备实施例38(±)(1R,2S)-2-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-(3-三氟甲基-3H-双吖丙啶-3-基)苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT622T）的合成
除了使用中间体(E)-3-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-(3-三氟甲基-3H-双吖丙啶-3-基)苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2S)-2-(2-(2-(2-(2-叔丁氧基羰基氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-(3-三氟甲基-3H-双吖丙啶-3-基)苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率45%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.36(t,J=6.3Hz,1H),1.42(s,9H),1.62(dd,J=5.7,7.5Hz,1H),2.78(t,J=7.5Hz,1H),2.85(d,J=15.0Hz,1H),3.30-3.32(m,2H),3.54(t,J=4.8Hz,2H),3.62-3.71(m,5H),3.85(t,J=4.5Hz,2H),4.13(q,J=4.8Hz,2H),6.59(s,1H),6.73(d,J=8.1Hz,1H),7.16-7.21(m,2H),7.31-7.39(m,2H),7.94(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例39化合物CYT312a-4T和化合物CYT312e-4T的合成：
化合物(±)(1R,2R)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（32mg,1.0eq,0.11mmol）溶于2mL氯仿，加入间氯过氧苯甲酸（m-CPBA）（19mg,1.0eq,0.11mmol），室温搅拌7小时。反应液用二氯甲烷稀释，依次用饱和NaS2O3溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2：1）得化合物CYT312a-4T（15mg,产率44%），白色固体，和化合物CYT312e-4T（15mg,产率44%），白色固体。
化合物CYT312a-4T：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.80(d,J=7.8Hz,2H),2.70(d,J=12.3Hz,2H),3.23(d,J=12.3Hz,2H),3.54(t,J=7.8Hz,1H),3.80(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.15(d,J=9.0Hz,2H),7.63(d,J=7.8Hz,1H),7.79(d,J=7.8Hz,1H),7.91(d,J=7.8Hz,1H),8.09(d,J=7.8Hz,1H)。
化合物CYT312e-4T：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.55(m,1H),2.34(dd,J=4.2,9.0Hz,1H),2.93(d,J=12.0Hz,1H),3.01(t,J=8.4Hz,1H),3.61(d,J=12.3Hz,1H),3.83(s,3H),6.89(d,J=7.5Hz,2H),7.23(d,J=8.4Hz,2H),7.62(t,J=7.8Hz,1H),7.76(t,J=7.5Hz,1H),7.85(d,J=7.8Hz,1H),8.06(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例40化合物CYT328-4T的合成（一对外消旋体）
化合物(±)(1R,2R)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3’-噻喃]-4’-酮（37mg,1.0eq,0.12mmol）溶于2mL氯仿，加入m-CPBA（43mg,2.0eq,0.25mmol），室温搅拌4小时。反应液用二氯甲烷稀释，依次用饱和NaS2O3溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=5：1）得化合物CYT328-4T（35mg,产率89%），白色固体。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.80(dd,J=4.8,8.1Hz,1H),2.09(dd,J=4.8,9.3Hz,1H),2.99(d,J=15.0Hz,1H),3.39(d,J=15.3Hz,1H),3.44(t,J=8.7Hz,1H),3.80(s,3H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),7.16(d,J=8.7Hz,2H),7.71-7.78(m,2H),7.98(dd,J=2.1,6.9Hz,1H),8.12(dd,J=2.1,6.9Hz,1H)。
制备实施例41化合物CYT368-1和CYT368-2的合成（各为一对外消旋体）：
（乙氧基羰基甲基）二甲基溴化硫鎓（142mg,2.5eq,0.62mmol）溶于6mL干燥二氯甲烷，室温搅拌下加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）（111μL,3.0eq,0.74mmol），室温搅拌1小时。加入化合物CYT282，60℃搅拌过夜。反应液用水稀释，二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=10：1）得化合物CYT368-1（30mg，产率33%）和化合物CYT368-2（32mg，产率35%）。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ1.28(t,J=7.2Hz,3H),2.70(d,J=9.9Hz,1H),3.55(s,2H),3.59(d,J=9.9Hz,1H),3.80(s,3H),4.17(dq,J=2.1,7.2Hz,2H),6.85(d,J=9.0Hz,2H),7.18(d,J=8.1Hz,2H),7.24(d,J=6.9Hz,1H),7.31-7.43(m,2H),8.10(dd,J=1.2,7.8Hz,1H)；1HNMR(300MHz,CDCl3):δ1.33(t,J=7.2Hz,3H),1.74-1.79(m,1H),3.35-3.40(m,1H),3.61-3.67(m,1H),3.70(s,3H),4.23(q,J=7.2Hz,2H),6.67(d,J=8.4Hz,2H),7.04(d,J=8.4Hz,2H),7.07-7.12(m,2H),7.32-7.36(m,1H),7.88(d,J=8.4Hz,1H)。
制备实施例42化合物CYT324DM的合成（一对外消旋体）
将2-硝基丙烷（Me2CHNO2）（319μL,20.0eq,3.5mmol）加入到叔丁醇钾（KOtBu）（397mg,20.0eq,3.5mmol）的干燥DMSO溶液中（2mL），室温（r.t.）搅拌30分钟后，加入化合物CYT282（50mg,1.0eq,0.18mmol），室温搅拌过夜。反应液用水稀释，用1M盐酸调至酸性，乙酸乙酯萃取，有机相依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=20：1）得化合物CYT324DM（25mg，产率43%）。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.20(s,3H),1.43(s,3H),2.50(d,J=14.1Hz,1H),3.34(s,1H),3.76(s,1H),3.81(s,3H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),7.06(d,J=8.4Hz,2H),7.14-7.39(m,3H),8.19(d,J=7.2Hz,1H)。
制备实施例43化合物ZY314-3的合成
步骤一：化合物182-5的合成
除了使用3-氟苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物182-5，两步反应产率26%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.95-2.99(m,2H),3.23-3.27(m,2H),6.83-6.89(dt,J=2.1,6.3Hz,1H),6.95-6.99(dd,J=2.1,8.7Hz,1H),8.11-8.16(dd,J=8.7,6.3Hz,1H)。
步骤二：化合物300-7的合成
除了使用化合物182-5替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物300-7，反应产率49%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.73(s,3H),3.86(s,2H),6.86-6.90(d,J=11.7Hz,2H),7.16-7.31(m,5H),8.57-8.62(dd,J=5.4,8.7Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY314-3的合成
除了使用中间体300-7替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY314-3，反应产率41%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.85-0.98(m,2H),2.51(t,J=6.6Hz,1H),2.90(d,J=15Hz,1H),3.54(d,J=15Hz,1H),3.80(s,3H),6.81-6.91(m,4H),7.11(d,J=8.7Hz,2H),8.00(dd,J=6.9,8.1Hz,1H)。
制备实施例44化合物ZY330-4的合成
步骤一：化合物199-6的合成
除了使用4-氯苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物199-6，两步反应产率80%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.97-3.01(m,2H),3.24-3.28(m,2H),7.25(t,J=8.1Hz,1H),7.36(dd,J=2.1,8.1Hz,1H),8.16(d,J=2.4Hz,1H)。
步骤二：化合物317-6的合成
除了使用化合物199-6替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物317-6，反应产率92%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.85(s,3H),4.14(s,2H),6.97(d,J=8.7Hz,2H),7.23-7.39(m,4H),7.76(s,1H),8.14(d,J=2.4Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY330-4的合成
除了使用中间体317-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY330-4，反应产率55%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.50(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),1.99(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.08(d,J=13.8Hz,1H),3.16(t,J=8.1Hz,1H),3.75(s,3H),6.87(dd,J=2.4,9.6Hz,2H),7.20-7.35(m,4H),8.05(d,J=2.4Hz,1H)。
制备实施例45化合物ZY314-4T2的合成
步骤一：化合物182-8的合成
除了使用2-氟苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物182-8，两步反应产率64%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.96-3.00(m,2H),3.24-3.28(m,2H),7.11-7.23(m,2H),7.93(dd,J=1.8,7.5Hz,1H)。
步骤二：化合物300-8的合成
除了使用化合物182-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物300-8，反应产率26%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.85(s,3H),3.92(s,2H),6.87(dd,J=2.1,6.6Hz,2H),7.18(dd,J=2.7,9.3Hz,2H),7.30-7.38(m,2H),7.45-7.52(m,1H),8.37(dd,J=1.2,8.1Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY314-4T2的合成
除了使用中间体300-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY314-4T2，反应产率10%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48-1.51(m,1H),1.95-2.00(m,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.07(d,J=14.1Hz,1H),3.16(t,J=8.4Hz,1H),3.82(s,3H),6.85(dd,J=4.2,6.6Hz,2H),7.10-7.26(m,4H),7.90(dd,J=3.6,5.7Hz,1H)。
制备实施例46化合物ZY330-2的合成
步骤一：化合物199-8的合成
除了使用2-氯苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物199-8，两步反应产率59%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.95-2.99(m,2H),3.23-3.28(m,2H),7.13(t,J=7.5Hz,1H),7.49(d,J=8.1Hz,1H),8.06(d,J=7.5Hz,1H)。
步骤二：化合物317-8的合成
除了使用化合物199-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物317-8，反应产率74%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.84(s,3H),3.98(s,2H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),7.17(d,J=8.4Hz,2H),7.48(s,1H),7.54(t,J=9.3Hz,1H),7.66(d,J=7.8Hz,1H),8.53(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY330-2的合成
除了使用中间体317-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY330-2，反应产率10%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.33(t,J=6.0Hz,1H),1.56-1.61(m,1H),2.57-2.62(m,1H),2.93(d,J=15.0Hz,1H),3.53(d,J=15.0Hz,1H),3.71(s,3H),6.83(dd,J=4.8,6.6Hz,2H),7.10-7.17(m,3H),7.47(dd,J=1.2,7.5Hz,1H),7.90(dd,J=1.5,7.8Hz,1H)。
制备实施例47化合物ZY330-4T3的合成
步骤一：化合物199-7的合成
除了使用3-氯苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物199-7，两步反应产率67%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.94-2.99(m,2H),3.22-3.27(m,2H),7.13(dd,J=2.1,8.7Hz,1H),7.28(d,J=1.8Hz,1H),8.03(d,J=8.4Hz,1H)。
步骤二：化合物317-7的合成
除了使用化合物199-7替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物317-7，反应产率18%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.85(s,3H),3.97(s,2H),6.87(d,J=8.7Hz,2H),7.18(d,J=8.7Hz,2H),7.31(s,1H),7.46(dd,J=2.1,8.7Hz,1H),7.57(d,J=1.8Hz,1H),8.50(d,J=8.7Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY330-4T3的合成
除了使用中间体317-7替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY330-4T3，反应产率26%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),2.66(d,J=14.1,1H),3.06-3.16(m,2H),3.78(s,3H),6.85(dd,J=1.8,6.6Hz,2H),7.13-7.26(m,4H),8.00(d,J=8.7Hz,1H)。
制备实施例48化合物ZY330-4C3的合成
除了使用中间体317-7替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY330-4C3，反应产率26%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.30(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),1.57(dd,J=4.5,8.7Hz,1H),2.48-2.53(m,1H),2.91(d,J=15.0Hz,1H),3.51(d,J=15.0Hz,1H),3.80(s,3H),6.82(dd,J=2.4,9.0Hz,2H),7.09-7.17(m,4H),7.90(dd,J=0.3,7.8Hz,1H)。
制备实施例49化合物ZY375-4T4的合成
步骤一：化合物361-6的合成
除了使用6-溴二氢苯并噻喃-4-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物361-6，反应产率32%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.85(s,3H),4.15(s,2H),6.96(d,J=8.7Hz,2H),7.19(d,J=8.4Hz,1H),7.37(d,J=8.7Hz,2H),7.49(dd,J=2.4,8.4Hz,1H),7.76(s,1H),8.29(d,J=2.4Hz,1H)。
步骤二：化合物ZY375-4T4的合成
除了使用中间体361-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY375-4T4，反应产率37%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.65(d,J=13.8Hz,1H),3.04-3.16(m,2H),3.81(s,3H),6.89(d,J=6.3Hz,2H),7.16(d,J=9.9Hz,1H),7.25(d,J=5.4Hz,2H),7.37(dd,J=2.4,8.4Hz,1H),8.19(d,J=2.1Hz,1H)。
制备实施例50化合物ZY326-4T2的合成
步骤一：化合物194-8的合成
除了使用2-甲氧基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物194-8，两步反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.89-2.93(m,2H),3.16-3.20(m,2H),3.89(s,3H),6.93(d,J=7.8Hz,1H),7.12(t,J=8.1Hz,1H),7.73(dd,J=0.6,8.1Hz,1H)。
步骤二：化合物312-8T的合成
除了使用化合物194-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物312-8T，反应产率28%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.80(s,3H),3.87(s,3H),4.11(s,2H),6.95-6.99(m,3H),7.21(t,J=7.8Hz,1H),7.38(d,J=8.7Hz,2H),7.71(s,1H),7.84(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY326-4T2的合成
除了使用中间体312-8T替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY326-4T2，反应产率71%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.93(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.68(d,J=13.8Hz,1H),3.02(d,J=13.8Hz,1H),3.12(t,J=7.8Hz,1H),3.78(s,3H),3.87(s,3H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),6.95(d,J=7.8Hz,1H),7.17(t,J=7.8Hz,1H),7.24(d,J=8.7Hz,2H),7.75(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例51化合物ZY326-4C2的合成
步骤一：化合物312-8C的合成
除了使用化合物194-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物312-8C，反应产率28%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.79(s,3H),3.92(s,2H),3.99(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.06(d,J=8.1Hz,1H),7.19(d,J=8.1Hz,2H),7.41(s,1H),7.48(t,J=8.1Hz,1H),8.20(d,J=8.4Hz,1H)。
步骤二：化合物ZY326-4C2的合成
除了使用中间体312-8C替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY326-4C2，反应产率61%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.31(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.54(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.53-2.58(m,1H),2.91(d,J=15Hz,1H),3.53(d,J=14.7Hz,1H),3.78(s,3H),3.89(s,3H),6.82(d,J=8.4Hz,2H),6.94(d,J=8.4Hz,1H),7.11-7.18(m,3H),7.60(dd,J=1.2,6.9Hz,1H)。
制备实施例52化合物ZY310-4T4的合成
步骤一：化合物178-6的合成
除了使用4-甲基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物178-6，两步反应产率72%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.28(s,3H),2.88-2.93(m,2H),3.14-3.18(m,2H),7.12-7.14(m,2H),7.87(s,1H)。
步骤二：化合物296-6的合成
除了使用化合物178-6替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物296-6，反应产率28%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.36(s,3H),3.85(s,3H),4.12(s,2H),6.95(d,J=8.7Hz,2H),7.21(s,2H),7.37(d,J=8.7Hz,2H),7.74(s,1H),7.99(s,1H)。
步骤三：化合物ZY310-4T4的合成
除了使用中间体296-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY310-4T4，反应产率74%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.93(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.34(s,3H),2.66(d,J=14.1Hz,1H),3.03(d,J=14.1Hz,1H),3.15(t,J=8.1Hz,1H),3.81(s,3H),6.85(d,J=8.4Hz,2H),7.14-7.26(m,4H),7.89(s,1H)。
制备实施例53化合物ZY364-4C2的合成
步骤一：化合物232-8的合成
除了使用2-三氟甲基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物232-8，两步反应产率73%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.99-3.03(m,2H),3.23-3.27(m,2H),7.26(t,J=7.8Hz,1H),7.75(d,J=7.8Hz,1H),8.30(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤二：化合物350-8的合成
除了使用化合物232-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物350-8，反应产率76%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.80(s,3H),3.93(s,2H),6.88(d,J=8.4Hz,2H),7.17(d,J=8.7Hz,2H),7.38(s,1H),7.61(t,J=7.8Hz,1H),7.93(d,J=7.8Hz,1H),8.82(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY364-4C2的合成
除了使用中间体350-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY364-4C2，反应产率32%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.35(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.61(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.60(t,J=7.2Hz,1H),3.00(d,J=14.7Hz,1H),3.47(d,J=14.7Hz,1H),3.80(s,3H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),7.13(d,J=8.7Hz,2H),7.30(t,J=7.5Hz,1H),7.76(d,J=7.2Hz,1H),8.09(dd,J=0.6,7.8Hz,1H)。
制备实施例54化合物ZY364-4T3的合成
步骤一：化合物232-7的合成
除了使用3-三氟甲基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，化合物232-7，两步反应产率83%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.95-2.99(m,2H),3.23-3.27(m,2H),7.31(d,J=8.4Hz,1H),7.48(s,1H),8.12(d,J=8.4Hz,1H)。
步骤二：化合物350-7的合成
除了使用化合物232-7替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物350-7，反应产率63%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.86(s,3H),4.20(s,2H),6.98(d,J=8.7Hz,2H),7.39(d,J=8.7Hz,2H),7.47(d,J=8.4Hz,1H),7.57(s,1H),7.80(s,1H),8.27(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY364-4T3的合成
除了使用中间体350-7替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY364-4T3，反应产率18%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.52(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.01(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.70(d,J=13.8Hz,1H),3.12-3.17(m,2H),3.81(s,3H),6.87(d,J=8.7Hz,2H),7.25(d,J=8.7Hz,2H),7.43(d,J=8.4Hz,1H),7.53(s,1H),8.17(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例55化合物ZY297-4T2的合成
步骤一：化合物165的合成
3-溴丙酸(2.4g,1.2eq,15.47mmol)溶于10mL水及碳酸氢钠（1.3g,1.1eq,14.43mmol）中，此混合液再加入到2-巯基烟酸与20mL10%的氢氧化钾水溶液（aq.）中，60℃搅拌4小时。反应液冷却至室温后放入冰水浴中，剧烈搅拌下滴入浓盐酸调至pH为1～2，生成大量白色固体，抽滤，滤饼用水洗涤。干燥得化合物227粗品。化合物227粗品与无水醋酸钠（NaOAc）（1.5g,2.0eq,17.61mmol）溶于乙酸酐（Ac2O）（18mL），加热至160℃回流1.5小时。冷却后加水稀释，冰浴下缓慢滴加30%浓氨水，调至pH为8～9。抽滤去除固体，滤液用乙酸乙酯萃取，有机相依次用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2：1）得化合物165（127mg，两步产率8.8%），淡黄色固体。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.89-2.93(m,2H),3.20-3.24(m,2H),7.05(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),8.20(dd,J=1.8,7.8Hz,1H),8.44(dd,J=2.1,4.8Hz,1H)。
步骤二：化合物283的合成
化合物165（127mg,1.0eq,0.769mmol）与对甲氧基苯甲醛(105mg,1.0eq,0.769mmol)溶于乙醇（EtOH），加入两滴哌啶，回流3小时，冷却静置，析出黄色晶体。抽滤，得化合物283（128mg，产率59%），黄色固体。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.86(s,3H),4.24(s,2H),6.97(d,J=8.7Hz,2H),7.20(dd,J=4.8,8.1Hz,1H),7.40(d,J=8.7Hz,2H),7.76(s,1H),8.41(dd,J=1.8,7.8Hz,1H),8.54(dd,J=2.1,4.8Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY297-4T2的合成
除了使用中间体283替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY297-4T2，反应产率33%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47-1.51(m,1H),1.93-2.01(m,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.08(t,J=8.1Hz,1H),3.16(d,J=14.1Hz,1H),3.77(s,3H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),7.12(dd,J=4.8,8.1Hz,1H),7.21(d,J=9.0Hz,2H),8.27(dd,J=2.1,8.1Hz,1H),8.47(dd,J=1.8,4.5Hz,1H)。
制备实施例56化合物ZY352-4T4的合成
步骤一：化合物220-6的合成
除了使用4-叔丁基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得化合物220-6，两步反应产率51%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.30(s,9H),2.91-2.95(m,1H),3.16-3.20(m,1H),7.19(d,J=8.1Hz,1H),7.42(dd,J=2.7,8.4Hz,1H),8.14(d,J=2.4Hz,1H)。
步骤二：化合物338-6的合成
除了使用化合物220-6替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物338-6，反应产率39%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.32(s,9H),3.85(s,3H),4.12(s,2H),6.96(d,J=9.0Hz,2H),7.36-7.47(m,4H),7.73(s,1H),8.22(d,J=2.4Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY352-4T4的合成
除了使用中间体338-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY352-4T4，反应产率89%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.33(s,9H),1.47(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.98(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.68(d,J=13.8Hz,1H),3.04(d,J=13.8Hz,1H),3.16(t,J=8.1Hz,1H),3.82(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.20-7.26(m,3H),7.43(dd,J=2.4,8.4Hz,1H),8.13(d,J=2.1Hz,1H)。
制备实施例57化合物ZY364-4T4的合成
步骤一：化合物232-6的合成
除了使用4-三氟甲基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得化合物232-6，两步反应产率38%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.95-2.99(m,2H),3.23-3.27(m,2H),7.35(d,J=8.7Hz,1H),7.52(dd,J=1.8,8.1Hz,1H),8.29(s,1H)。
步骤二：化合物350-6的合成
除了使用化合物232-6替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物350-6，反应产率79%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.87(s,3H),4.20(s,2H),7.99(d,J=8.7Hz,2H),7.41(m,3H),7.60(d,J=8.4Hz,1H),7.80(s,1H),8.45(s,1H)。
步骤三：化合物ZY364-4T4的合成
除了使用中间体350-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY364-4T4，反应产率63%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49-1.56(m,1H),2.00-2.04(m,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.12-3.17(m,2H),3.81(s,3H),6.87(d,J=9.0Hz,2H),7.27(d,J=8.4Hz,2H),7.38(d,J=8.4Hz,1H),7.57(d,J=7.8Hz,1H),8.34(s,1H)。
制备实施例58化合物ZY310-4T2的合成
步骤一：化合物178-8的合成
除了使用2-甲基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得化合物178-8，两步反应产率79%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.31(s,3H),2.93-2.98(m,2H),3.20-3.25(m,2H),7.08(t,J=7.8Hz,1H),7.28(d,J=7.5Hz,1H),8.00(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤二：化合物298-8的合成
除了使用化合物178-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物298-8，反应产率57%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.28(s,3H),3.79(s,3H),4.08(s,2H),6.91(d,J=8.1Hz,2H),7.12(t,J=7.8Hz,1H),7.23(d,J=6.9Hz,1H),7.34(d,J=8.7Hz,2H),7.69(s,1H),8.05(d,J=7.8Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY310-4T2的合成
除了使用中间体298-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY310-4T2，反应产率71%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.94(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.29(s,3H),2.69(d,J=13.8Hz,1H),3.03(d,J=13.8Hz,1H),3.15(t,J=8.1Hz,1H),3.79(s,3H),6.86(d,J=9.0Hz,2H),7.11(t,J=7.5Hz,1H),7.22-7.27(m,3H),7.98(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例59化合物ZY324-4T2的合成
步骤一：化合物192-8的合成
除了使用2-乙基苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得化合物192-8，两步反应产率67%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.24(t,J=7.8Hz,3H),2.67(q,J=7.5Hz,2H),2.92-2.96(m,2H),3.17-3.22(m,2H),7.11(t,J=7.8Hz,1H),7.29(d,J=7.5Hz,1H),8.00(dd,J=1.8,8.1Hz,1H)。
步骤二：化合物310-8的合成
除了使用化合物192-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物310-8，反应产率50%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.24(t,J=7.5Hz,3H),2.71(q,J=7.5Hz,2H),3.84(s,3H),4.11(s,2H),6.96(d,J=9.0Hz,2H),7.20(t,J=7.8Hz,1H),7.31(d,J=7.5Hz,1H),7.39(d,J=8.4Hz,2H),7.72(s,1H),8.07(d,J=7.5Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY324-4T2的合成
除了使用中间体310-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY324-4T2，反应产率86%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.21(t,J=6.0Hz,3H),1.48(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.93(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.64-2.71(m,3H),3.98(d,J=13.8Hz,1H),3.16(t,J=8.1Hz,1H),3.81(s,3H),6.86(d,J=8.4Hz,2H),7.16-7.31(m,4H),7.94(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例60化合物ZY375-4T2的合成
步骤一：化合物243-8的合成
除了使用2-溴苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，
制备得化合物243-8，两步反应产率80%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.89-2.94(m,2H),3.20-3.25(m,2H),7.00(t,J=7.8Hz,1H),7.59(d,J=7.8Hz,1H),8.00(d,J=7.2Hz,1H)。
步骤二：化合物361-8的合成
除了使用化合物243-8替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物361-8，反应产率77%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.86(s,3H),4.16(s,2H),6.98(d,J=9.0Hz,2H),7.13(t,J=8.1Hz,1H),7.39(d,J=8.7Hz,2H),7.67(d,J=7.8Hz,1H),7.73(s,1H),8.18(d,J=8.1Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY375-4T2的合成
除了使用中间体361-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY375-4T2，反应产率21%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.96(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.08-3.15(m,2H),3.81(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.08(t,J=7.5Hz,1H),7.24(d,J=8.7Hz,2H),7.64(d,J=6.6Hz,1H),8.07(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例61化合物ZY373-4T2-3的合成
化合物ZY375-4T2（120mg,1.0eq,0.320mmol），3-吡啶硼酸和Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2，加入到反应瓶中，加入乙二醇二甲醚（DME）和2M碳酸钠水溶液，氩气置换，80℃搅拌过夜。次日加入少量水稀释，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗，干燥，浓缩，硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=2：1），得化合物ZY373-4T2-3(100mg，产率89%)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.98(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.60(d,J=14.1Hz,1H),2.98(d,J=14.1Hz,1H),3.16(t,J=8.4Hz,1H),3.79(s,3H),6.84(d,J=8.4Hz,2H),7.21-7.37(m,5H),7.70(d,J=8.1,1H),8.15(dd,J=1.8,7.5Hz,1H),8.61(d,J=4.2Hz,2H)。
制备实施例62化合物ZY402-4T2-3的合成
除了使用3-甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY402-4T2-3，反应产率80%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.94(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.58(d,J=13.5Hz,1H),2.88(d,J=13.5Hz,1H),3.17(t,J=7.8Hz,1H),3.76(s,3H),3.81(s,3H),6.82(d,J=8.4Hz,2H),6.89-6.95(m,3H),7.20-7.38(m,5H),8.09(d,J=7.5Hz,1H)。
制备实施例63化合物ZY402-4T2-4的合成
除了使用4-甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY402-4T2-4，反应产率68%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(dd,J=4.2,8.1Hz,1H),1.96(dd,J=4.2,8.1Hz,1H),2.60(d,J=14.1Hz,1H),2.92(d,J=14.1Hz,1H),3.19(t,J=7.8Hz,1H),3.80(s,3H),3.84(s,3H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),6.96(d,J=8.7Hz,2H),7.24-7.38(m,6H),8.09(d,J=9.3Hz,1H)。
制备实施例64化合物ZY336-4T2的合成
除了使用环丙基基硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY336-4T2，反应产率71%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.61-0.66(m,2H),0.91-0.97(m,2H),1.47(dd,J=4.2,8.1Hz,1H),1.89-1.93(m,2H),2.72(d,J=14.1Hz,1H),3.98(d,J=14.1Hz,1H),3.16(t,J=8.4Hz,1H),3.80(s,3H),6.85(d,J=6.6Hz,2H),7.10-7.13(m,2H),7.24(d,J=6.9Hz,2H),7.95(dd,J=3.3,6.3Hz,1H)。
制备实施例65化合物ZY456-4T2-4的合成
除了使用4-三氟甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY456-4T2-4，反应产率84%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.96(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.58(d,J=13.5Hz,1H),2.95(d,J=13.5Hz,1H),3.16(t,J=7.8Hz,1H),3.78(s,3H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),7.20-7.40(m,8H),8.12(dd,J=1.5,7.8Hz,1H)。
制备实施例66化合物ZY336-4T4的合成
除了使用环丙基基硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T4替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY336-4T4，反应产率31%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.67-0.73(m,2H),0.94-1.00(m,2H),1.43-1.47(m,1H),1.89-1.96(m,2H),2.66(d,J=13.8Hz,1H),3.01(d,J=13.8Hz,1H),3.13(t,J=8.1Hz,1H),3.80(s,3H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),7.08-7.24(m,4H),7.78(d,J=1.8Hz,1H)。
制备实施例67化合物ZY456-4T4-4的合成
除了使用4-三氟甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T4替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY456-4T4-4，反应产率48%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.50(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.01(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.71(d,J=13.8Hz,1H),3.09-3.17(m,2H),3.81(s,3H),6.86(d,J=6.9Hz,2H),7.24-7.36(m,5H),7.56-7.63(m,3H),8.30(d,J=2.1Hz,1H)。
制备实施例68化合物ZY402-4T4-4的合成
除了使用4-甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T4替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY402-4T4-4，反应产率28%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.99(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.71(d,J=13.8Hz,1H),3.08(d,J=13.8Hz,1H),3.17(t,J=8.4Hz,1H),3.81(s,3H),3.85(s,3H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),6.98(d,J=8.7Hz,2H),7.24-7.32(m,3H),7.53-7.59(m,3H),8.29(d,J=2.1Hz,1H)。
制备实施例69化合物ZY373-4T4-3的合成
除了使用化合物ZY375-4T4替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY373-4T4-3，反应产率39%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.55-1.65(m,1H),1.99-2.10(m,1H),2.71(d,J=13.8Hz,1H),3.10-3.15(m,2H),3.81(s,3H),6.87(d,J=8.4Hz,2H),7.26(d,J=8.7Hz,2H),7.37-7.40(m,2H),7.57(d,J=8.1Hz,1H),7.88(d,J=7.8Hz,1H),8.32(d,J=1.8Hz,1H),8.60(s,1H),8.86(s,1H)。
制备实施例70化合物ZY470-4T4-4的合成
除了使用4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T4替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY373-4T4-3，反应产率40%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47-1.56(m,1H),1.90-2.01(m,1H),2.60(t,J=5.1Hz,4H),2.70(d,J=13.8Hz,1H),3.05-3.25(m,2H),3.28(t,J=4.8Hz,4H),3.812(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.99(d,J=8.7Hz,2H),7.23-7.31(m,3H),7.51-7.57(m,3H),8.29(s,1H)。
制备实施例71化合物ZY375-4T3的合成
步骤一：化合物243-7的合成
除了使用3-溴苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得化合物243-7，两步反应产率62%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.94-2.98(m,2H),3.20-3.26(m,2H),7.28(d,J=8.4Hz,1H),7.44(s,1H),7.94(d,J=8.7Hz,1H)。
步骤二：化合物361-7的合成
除了使用化合物243-7替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物361-7，反应产率55%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.85(s,3H),4.15(s,2H),6.97(d,J=8.7Hz,2H),7.37(d,J=9.0Hz,2H),7.48(s,1H),7.75(s,1H),8.02(d,J=8.7Hz,1H)。
步骤三：化合物ZY375-4T3的合成
除了使用中间体361-7替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY375-4T3，反应产率81%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.43(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.93(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.64(d,J=13.8Hz,1H）,3.03(d,J=13.8Hz,1H),3.11(t,J=7.8Hz,1H),3.75(s,3H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),7.19(d,J=8.7Hz,2H),7.25(dd,J=1.8,10.5Hz,1H),7.37(d,J=1.8Hz,1H),7.88(d,J=8.7Hz,1H)。
制备实施例72化合物ZY373-4T3-3的合成
除了使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY373-4T3-3，反应产率66%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.99(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.1(d,J=13.8Hz,1H),3.10-3.16(m,2H),3.80(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.24(d,J=8.4Hz,2H),7.36-7.42(m,2H),7.47(d,J=1.5Hz,1H),7.87(dt,J=2.4,8.1Hz,1H),8.18(d,J=8.1Hz,1H),8.63(dd,J=1.5,4.8Hz,1H),8.85(d,J=1.8Hz,1H)。
制备实施例73化合物ZY336-4T3的合成
除了使用环丙基基硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY336-4T3，反应产率88%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.75(dd,J=4.2,8.1Hz,2H),1.02(dd,J=4.2,8.1Hz,2H),1.40-1.44(m,1H),1.84-1.95(m,2H),2.65(d,J=13.8Hz,1H),3.02(d,J=13.8Hz,1H),3.07(t,J=7.8Hz,1H),3.79(s,3H),6.82-6.91(m,4H),7.22(d,J=8.7Hz,2H),7.97(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例74化合物456-3-4的合成
除了使用4-三氟甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物456-3-4，反应产率87%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.99(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.71(d,J=13.8Hz,1H),1.09-3.19(m,2H),3.80(s,3H),6.87(d,J=8.7Hz,2H),7.23-7.44(m,6H),7.60(d,J=6.9Hz,2H),8.15(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例75化合物ZY402-4T3-4的合成
除了使用4-甲氧基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物402-4T3-4，反应产率90%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.71(d,J=13.8Hz,1H),3.07-3.15(m,2H),3.80(s,3H),3.84(s,3H),6.86(d,J=9.0Hz,2H),6.97(d,J=9.0Hz,2H),7.25(d,J=8.4Hz,2H),7.37-7.44(m,2H),7.54(dd,J=2.4,6.9Hz,2H),8.11(d,J=8.1Hz,1H)。
制备实施例76化合物ZY470-4T3-4的合成
除了使用4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物470-4T3-4，反应产率90%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.96(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.35(s,3H),2.57(t,J=4.8Hz,4H),2.70(d,J=13.8Hz,1H),3.05-3.17(m,2H),3.28(t,J=4.8Hz,4H),3.79(s,3H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),6.96(d,J=9.0Hz,2H),7.24(d,J=8.4Hz,2H),7.37-7.44(m,2H),7.52(d,J=9.0Hz,2H),8.10(d,J=8.4Hz,1H)。
制备实施例77化合物387-3-3的合成
除了使用3-氨基苯硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物387-3-3，反应产率71%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.70(d,J=13.5Hz,1H),3.08(d,J=13.5Hz,1H),3.16(t,J=8.4Hz,1H),3.79(s,3H),6.68-6.71(m,1H),6.84-6.88(m,3H),6.97(dd,J=0.9,6.0Hz,1H),7.18-7.25(m,3H),7.37(dd,J=1.8,8.1Hz,1H),7.44(d,J=1.5Hz,1H),8.10(d,J=8.4Hz,1H)。
制备实施例78化合物378-3-2的合成
除了使用2-噻吩硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物ZY375-4T3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物378-3-2，反应产率20%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.98(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.69(d,J=13.8Hz,1H),3.07-3.17(m,2H),3.80(s,3H),6.86(d,J=9.0Hz,2H),7.09(dd,J=3.9,5.1Hz,1H),7.25(d,J=8.7Hz,2H),7.35-7.49(m,4H),8.08(d,J=8.4Hz,1H)。
制备实施例79化合物373-2-4的合成
除了使用4-吡啶硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物373-2-4，反应产率39%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.61(d,J=13.8Hz,1H),2.96(d,J=13.8Hz,1H),3.18(t,J=7.8Hz,1H),3.78(s,3H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),7.21-7.36(m,6H),8.15(dd,J=1.8,7.5Hz,1H),8.66(d,J=5.7Hz,2H)。
制备实施例80化合物492-2的合成
除了使用正十四烷基硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物492-2，反应产率36%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.87(t,J=6.3Hz,3H),1.46(m,22H),1.46-1.52(m,1H),1.55-1.61(m,2H),1.91-1.95(m,1H),2.62-2.71(m,3H),2.96(d,J=13.8Hz,1H),3.17(t,J=8.4Hz,1H),3.81(s,3H),6.85(d,J=9.9Hz,2H),7.15(t,J=7.8Hz,1H),7.22-7.29(m,3H),7.96(dd,J=1.8,8.1Hz,1H)。
制备实施例81化合物470-2-4的合成
除了使用4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物470-2-4，反应产率69%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.94(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.55-2.65(m,5H),2.89(d,J=13.8Hz,1H),3.17(t,J=8.4Hz,1H),3.27(t,J=5.1Hz,4H),3.78(s,3H),6.83(d,J=8.4Hz,2H),6.95(d,J=8.7Hz,2H),7.20-7.36(m,6H),8.05(d,J=7.2Hz,1H)。
制备实施例82化合物423-2-3的合成
除了使用4-异喹啉硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物423-2-3，反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.40-1.49(m,2H),1.91-1.95(m,1H),2.00-2.04(m,1H),2.50(d,J=14.1Hz,1H),2.61(d,J=14.1Hz,1H),2.78(d,J=14.1Hz,1H),2.98(d,J=14.1Hz,1H),3.11(t,J=7.8Hz,1H),3.21(t,J=7.8Hz,1H),3.73(s,3H),3.75(s,3H),6.78(t,J=9.0Hz,2H),7.19(t,J=11.1Hz,2H),7.15-7.67(m,5H),8.02-8.04(m,1H),8.24(dt,J=2.1,7.8Hz,1H),8.43(d,J=5.4Hz,1H),9.28(s,1H)。
制备实施例83化合物378-2-2的合成
除了使用2-噻吩硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物378-2-2，反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.96(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.61(d,J=13.8Hz,1H),2.96(d,J=13.8Hz,1H),3.18(t,J=8.4Hz,1H),3.78(s,3H),6.82-6.84(m,2H),6.94-7.38(m,6H),7.52(dd,J=1.5,7.8Hz,1H),8.09(dd,J=1.8,8.1Hz,1H)。
制备实施例84化合物460-2-2的合成
除了使用2,2'-双噻吩-5-硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物460-2-2，反应产率28%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.53(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.00(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.68(d,J=14.1Hz,1H),3.01(d,J=14.1Hz,1H),3.21(t,J=8.1Hz,1H),3.81(s,3H),6.84(d,J=9.6Hz,2H),7.03-7.30(m,8H),7.44(dd,J=1.8,7.8Hz,1H),8.14-8.10(dd,J=1.8,8.1Hz,1H)。
制备实施例85化合物373-2-2的合成
除了使用2-吡啶硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物373-2-2，反应产率25%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.50(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.94(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.57(d,J=14.1Hz,1H),2.84(d,J=14.1Hz,1H),3.23(t,J=8.1Hz,1H),3.79(s,3H),6.83(d,J=9.9Hz,2H),7.17-7.33(m,4H),7.52(d,J=7.8Hz,1H),7.61(d,J=7.5Hz,1H),7.77(td,J=1.8,7.5Hz,1H),8.14(dd,J=1.5,7.8Hz,1H),8.70(dd,J=0.9,5.7Hz,1H)。
制备实施例86化合物557-2-2-boc的合成
除了使用6-(4-叔丁氧羰基哌嗪-1-基)吡啶-3-硼酸频哪醇酯替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物557-2-2-boc，反应产率75%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.45(m,10H),1.96(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.57(d,J=13.5Hz,1H),2.98(d,J=13.5Hz,1H),3.15(t,J=8.1Hz,1H),3.56(s,8H),3.78(s,3H),6.67(d,J=8.7Hz,1H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),7.18-7.34(m,4H),7.53(dd,J=2.4,9.0Hz,1H),8.08(dd,J=1.8,7.8Hz,1H),8.19(d,J=2.4Hz,1H)。
制备实施例87化合物452-3的合成
除了使用6-溴-3-吡啶基硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物452-3，反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.98(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.61(d,J=14.1Hz,1H),3.00(d,J=14.1Hz,1H),3.17(t,J=8.1Hz,1H),3.77(s,3H),6.84(d,J=6.9Hz,2H),6.86-7.34(m,4H),7.51-7.60(m,2H),8.16(dd,J=2.7,6.6Hz,1H),8.37(d,J=3.3Hz,1H)。
制备实施例88化合物529-3-3的合成
除了使用6-溴-3-吡啶基硼酸替代3-吡啶硼酸以及使用化合物452-3替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物529-3-3，反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.50(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.01(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.61(d,J=13.8Hz,1H),3.03(d,J=13.8Hz,1H),3.18(t,J=7.8Hz,1H),3.78(s,3H),6.87(d,J=9.9Hz,2H),7.20-7.41(m,4H),7.61(d,J=8.1Hz,1H),7.77-7.86(m,2H),8.17(dd,J=2.1,7.8Hz,1H),8.24(dd,J=2.7,8.4Hz,1H),8.72(d,J=2.4Hz,1H),8.98(d,J=2.7Hz,1H)。
制备实施例89化合物441-3的合成
除了使用6-三氟甲基吡啶-3-硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物441-3，反应产率52%。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.01(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.61(d,J=13.8Hz,1H),3.04(d,J=13.8Hz,1H),3.16(t,J=8.4Hz,1H),3.78(s,3H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),7.22(d,J=8.4Hz,2H),7.30-7.37(m,2H),7.74(d,J=8.4Hz,1H),7.91(dd,J=2.1,7.8Hz,1H),8.18(dd,J=2.7,6.9Hz,1H),8.74(s,1H)。
制备实施例90化合物ZY344-5的合成
步骤一：化合物212-58的合成
除了使用2-甲基-5-氯苯硫酚替代4-氟苯硫酚以外，按照上述制备实施例24步骤一的方法，制备得化合物212-58，两步反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.27(s,3H),2.98-3.03(m,2H),3.20-3.25(m,2H),7.11(s,2H)。
步骤二：化合物331-58的合成
除了使用化合物212-58替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得化合物331-58，反应产率46%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.30(s,3H),3.89(s,3H),4.07(s,2H),6.97(d,J=8.7Hz,2H),7.16(dd,J=8.1,17.1Hz,2H),7.40(d,J=8.4Hz,2H),7.81(s,1H)。
步骤三：化合物ZY344-5的合成
除了使用中间体331-58替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得化合物ZY344-5，反应产率70%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.53(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.95(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.28(s,3H),2.61(d,J=13.8Hz,1H),2.91(d,J=13.8Hz,1H),3.18(t,J=8.1Hz,1H),3.83(s,3H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.13(dd,J=7.8,17.1Hz,2H),7.24(d,J=8.1Hz,2H)。
制备实施例91化合物ZY387-5的合成
除了使用化合物ZY344-5替代化合物ZY375-4T2以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY387-5，反应产率23%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.80(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.34(s,3H),2.71(d,J=13.5Hz,1H),2.98-3.07(m,2H),3.81(s,3H),6.86(d,J=6.9Hz,2H),7.00(d,J=7.5Hz,1H),7.20-7.34(m,4H),7.60(s,1H),8.48(s,1H),8.55(dd,J=0.9,4.5Hz,1H)。
制备实施例92化合物ZY545-2的合成
除了使用1-(1-叔丁氧羰基哌啶-4-基)吡唑-4-硼酸频那醇酯替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY545-2，反应产率32%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.41(s,9H),1.92-2.03(m,3H),2.15(d,J=10.8Hz,2H),2.63(d,J=13.8Hz,1H),2.85-3.01(m,3H),3.16(t,J=8.4Hz,1H),3.78(s,3H),4.23-4.29(m,3H),6.85(dd,J=2.1,6.6Hz,2H),7.19-7.25(m,3H),7.42(dd,J=1.2,7.5Hz,1H),7.66(d,J=9.9Hz,2H),8.02(dd,J=1.5,7.8Hz,1H)。
制备实施例93化合物ZY389-2的合成
除了使用2-氨基嘧啶-5-硼酸频哪酯替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY389-2，反应产率85%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.48(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.00(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.61(d,J=14.1Hz,1H),3.00(d,J=14.1Hz,1H),3.16(t,J=7.8Hz,1H),3.79(s,3H),5.24(br.s,2H),6.84(d,J=8.4Hz,2H),7.21-7.32(m,4H),8.12(dt,J=1.8,6.9Hz,1H),8.32(s,2H)。
制备实施例94化合物ZY458-2的合成
除了使用6-(4-吗啉基)吡啶-3-硼酸频哪醇酯替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY458-2，反应产率76%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.49(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.04(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.60(d,J=13.5Hz,1H),3.00(d,J=13.5Hz,1H),3.17-3.14(t,J=7.8Hz,1H),3.55-3.60(m,4H),3.81(s,3H),3.83-3.86(m,4H),6.68(d,J=8.7Hz,1H),6.85(d,J=6.9Hz,2H),7.23-7.36(m,4H),7.56(dd,J=2.4,8.4Hz,1H),8.10(dd,J=1.8,7.8Hz,1H),8.22(d,J=2.7Hz,1H)。
制备实施例95化合物ZY412-2的合成
除了使用4-吲哚硼酸频那醇酯替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY412-2，反应产率80%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.00(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.18-2.59(m,1H),2.64(brs,1H),3.21(t,J=8.1Hz,1H),3.77(s,3H),6.81(d,J=8.7Hz,2H),7.12-7.54(m,7H),7.89(s,1H),8.19(dd,J=1.5,7.8Hz,1H)。
制备实施例96化合物ZY428-2的合成
除了使用苯并噻吩-2-硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY428-2，反应产率49%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.51(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.97(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.66(d,J=13.8Hz,1H),2.98(d,J=13.8Hz,1H),3.18(t,J=8.1Hz,1H),3.80(s,3H),6.86(d,J=8.4Hz,2H),7.23-7.39(m,7H),7.60(d,J=7.5Hz,1H),7.81(dd,J=8.4,14.7Hz,1H),8.14(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例97化合物ZY336-2的合成
除了使用烯丙基硼酸频哪醇酯替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY336-2，反应产率81%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),1.93(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.70(d,J=13.8Hz,1H),2.96(d,J=13.8Hz,1H),3.17(t,J=7.8Hz,1H),3.43(d,J=6.6Hz,2H),3.87(s,3H),5.03-5.13(m,2H),5.88-5.97(m,1H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),7.17-7.38(m,4H),8.00(dd,J=1.8,8.1Hz,1H)。
制备实施例98化合物ZY488-2的合成
除了使用9,9-二甲基芴-2-硼酸替代3-吡啶硼酸以外，按照上述制备实施例61的方法，制备得化合物ZY488-2，反应产率67%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.43-1.54(m,7H),1.94(dd,J=4.5,7.8Hz,1H),2.66(d,J=13.8Hz,1H),2.83(d,J=13.8Hz,1H),3.23(t,J=8.1Hz,1H),3.78(s,3H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),7.22-7.48(m,9H),7.72-7.77(m,2H),8.12(dd,J=1.5,7.8Hz,1H)。
制备实施例99(±)(1'R,2'R)-2'-(4-甲氧基苯基)-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮（化合物CYT266-4）的合成
除了使用(Z)-2-(4-甲氧基苯烯基)苯并呋喃-3(2H)-酮替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法的方法，制备得(±)(1'R,2'R)-2'-(4-甲氧基苯基)-3H-螺[苯并呋喃-2,1'-环丙烷]-3-酮，反应产率32%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.05-2.16(m,2H),3.00(t,J=9.6Hz,1H),3.81(s,3H),6.88(d,J=9.0Hz,2H),7.08-7.17(m,2H),7.20(d,J=8.4Hz,2H),7.56(t,J=7.2Hz,1H),7.73(d,J=7.8Hz,1H)。
制备实施例100(±)(1R,2R)-6'-(4-溴丁氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT447-6）的合成
步骤一：(Z)-6-羟基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT298-6）的合成
除了使用6-羟基二氢苯并噻喃-4-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得：(Z)-6-羟基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率91%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.86(s,3H),4.13(s,2H),5.93(s,1H),6.95-7.01(m,3H),7.21(d,J=8.4Hz,1H),7.39(d,J=8.4Hz,2H),7.74-7.78(m,2H)。
步骤二：(Z)-6-(4-溴丁氧基)-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT433-6）的合成
除了使用化合物CYT298-6替代化合物CYT268-4以及使用1,4-二溴丁烷替代BrCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCOOC(CH3)3以外，按照上述制备实施例35步骤一的方法，制备得化合物CYT433-6，反应产率76%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.90-2.02(m,2H),2.03-2.09(m,2H),3.48(t,J=6.3Hz,2H),3.84(s,3H),4.04(t,J=6.0Hz,2H),4.11(s,2H),6.94-7.00(m,3H),7.20(d,J=8.7Hz,1H),7.37(d,J=8.7Hz,2H),7.66(d,J=2.7Hz,1H),7.74(s,1H)。
步骤三：(±)(1R,2R)-6'-(4-溴丁氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT447-6）的合成
除了使用中间体CYT433-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-6'-(4-溴丁氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率43%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.47(dd,J=4.2,7.5Hz,1H),1.92-2.09(m,6H),2.67(d,J=13.5Hz,1H),3.01(d,J=14.1Hz,1H),3.15(t,J=8.4Hz,1H),3.49(t,J=6.6Hz,2H),3.81(s,3H),4.03(t,J=6.0Hz,2H),6.85(d,J=9.0Hz,2H),6.97(dd,J=3.0,8.7Hz,1H),7.17(d,J=8.7Hz,1H),7.24(d,J=8.7Hz,2H),7.57(d,J=3.0Hz,1H)。
制备实施例101(±)(1R,2R)-6'-(8-叠氮辛氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT466-6）的合成
步骤一：(Z)-6-(8-叠氮辛氧基)-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT452-6）的合成
除了使用化合物CYT298-6替代化合物CYT268-4以及使用1-叠氮-8-溴辛烷替代BrCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCOOC(CH3)3以外，按照上述制备实施例35步骤一的方法，制备得化合物CYT452-6，反应产率99%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.37-1.47(m,8H),1.58-1.66(m,2H),1.79(m,J=6.6Hz,2H),3.26(t,J=7.2Hz,2H),3.85(s,3H),4.00(t,J=6.6Hz,2H),4.12(s,2H),6.97-7.01(m,3H),7.20(d,J=8.7Hz,1H),7.38(d,J=8.4Hz,2H),7.67(d,J=2.7Hz,1H),7.75(s,1H)。
步骤二：(±)(1R,2R)-6'-(8-叠氮辛氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT466-6）的合成
除了使用中间体CYT452-6替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-6'-(8-叠氮辛氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率11%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.36-1.41(m,8H),1.45-1.49(m,1H),1.59-1.63(m,2H),1.78(m,J=6.3Hz,2H),1.94(q,J=4.5Hz,1H),2.67(d,J=13.8Hz,1H),3.00(d,J=13.8Hz,1H),3.15(t,J=7.8Hz,1H),3.27(t,J=6.9Hz,2H),3.81(s,3H),3.98(t,J=6.6Hz,2H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),6.98(dd,J=2.7,8.7Hz,1H),7.17(d,J=8.7Hz,1H),7.24(d,J=9.0Hz,2H),7.57(d,J=2.7Hz,1H)。
制备实施例102(±)(1R,2R)-8'-(4-溴丁氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT447-8）的合成
步骤一：(Z)-8-羟基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT298-8）的合成
除了使用8-羟基二氢苯并噻喃-4-酮替代二氢苯并噻喃-4-酮以外，按照上述制备实施例1步骤一的方法，制备得：(Z)-8-羟基-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮，反应产率56%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.86(s,3H),4.16(s,2H),5.93(s,1H),6.97(d,J=9.0Hz,2H),7.06(d,J=7.8Hz,1H),7.19(t,J=8.2Hz,1H),7.39(d,J=8.7Hz,2H),7.78-7.83(m,2H)。
步骤二：(Z)-8-(4-溴丁氧基)-3-(4-甲氧基苯烯基)二氢苯并噻喃-4-酮（CYT433-8）的合成
除了使用化合物CYT298-8替代化合物CYT268-4以及使用1,4-二溴丁烷替代BrCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCOOC(CH3)3以外，按照上述制备实施例35步骤一的方法，制备得化合物CYT433-8，反应产率89%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.95-2.12(m,4H),3.50(t,J=6.6Hz,2H),3.83(s,3H),4.04-4.08(s,4H),6.92-6.97(m,3H),7.17(t,J=8.1Hz,1H),7.37(d,J=8.7Hz,2H),7.67(s,1H),7.84(dd,J=0.9,7.8Hz,1H)。
步骤三：(±)(1R,2R)-8'-(4-溴丁氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮（化合物CYT447-8）的合成
除了使用中间体CYT433-8替代中间体CYT282以外，按照上述制备实施例2的方法，制备得(±)(1R,2R)-8'-(4-溴丁氧基)-2-(4-甲氧基苯基)螺[环丙烷-1,3'-噻喃]-4'-酮，反应产率69%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.46(dd,J=4.8,7.5Hz,1H),1.91-2.12(m,5H),2.67(d,J=14.1Hz,1H),3.02(d,J=13.8Hz,1H),3.17(t,J=7.5Hz,1H),3.50(t,J=6.6Hz,2H),3.81(s,3H),4.04-4.09(m,2H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),6.94(d,J=8.1Hz,1H),7.15(t,J=8.1Hz,1H),7.25(d,J=8.7Hz,2H),7.75(dd,J=1.2,8.7Hz,2H)。
诱导iPS细胞生成实验实施例
实验实施例1基于表型的筛选实验
药品与试剂：胎牛血清（Fetal bovine serum（FBS））购自Hyclone公司；达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基（DMEM）\Glutamax-I\2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol）\NEAA\Knockout DMEM\Knockout血清替代物（Knockout Serum Replacement（KSR））\Opti-I减血清培养基\胰蛋白酶（Trypsin）\青霉素（Penicillin）/链霉素（streptomycin）购自Invitrogen公司；白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor（LIF））购自Millipore公司。
质粒：pMXs-Oct4,pMXs-Klf4,pMXs-Sox2,pMXs-c-Myc,pMXs-GFP，由生化细胞所裴钢教授惠赠。
细胞系：Platinum-E逆转录病毒包装细胞，由生化细胞所裴钢教授惠赠；Oct4启动子驱动的GFP转基因小鼠原代MEF细胞，本实验室原代分离自OG2转基因小鼠；Feeder细胞，本实验室通过放射线照射处理原代MEF细胞制备。
实验动物：C57BL6，ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物公司；OG2转基因小鼠，C57BL6，表达Oct4启动子驱动表达GFP的报告基因，购自南京模式动物中心。纯合转基因雄鼠与野生型（野生型，WT）C57BL6雌鼠交配，怀孕母鼠用于原代MEF细胞分离。实验仪器：Olympus IX51荧光倒置显微镜；Acumen X3高通量读板机；Olympus FV10i共聚焦显微镜；Millipore Guava Easysyte8HT流式细胞仪和Eppendorf5810R多孔板离心机。
1、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的分离与培养
将携带Rosa26-lacZ等位基因和驱动表达GFP的转基因Oct4启动子的OG2小鼠与129小鼠交配。将13.5天的孕鼠去除头部、尾巴、四肢及内脏器官，将胎鼠剩余的部分用剪刀细细减碎，加入胰酶室温消化10分钟。加入MEF培养液中和，离心收集细胞。原代MEF细胞培养于含有10%FBS、2mM L-谷氨酸、0.1mM非必须氨基酸、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液中。进一步实验均使用三代以内的原代MEF细胞。
2、Feeder细胞制备
将WT C57雌雄小鼠交配，在孕期为13.5天的孕鼠按上述同样方法分离MEF细胞。此MEF细胞传代到P5-P6代，可用于制备Feeder滋养层细胞。制备时将MEF细胞消化重悬，于60Gay Co60射线辐照灭活5分钟后按不同密度分装冻存。待需要时则直接复苏使用。
3、小鼠iPS细胞的产生
将含有小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列的pMXs逆转录病毒载体质粒转染plat-E细胞，收集48h和72h的病毒。将P0代OG-MEF细胞于感染前18小时种于六孔板中，细胞密度为每孔18万细胞。将添加有4μg/mL聚凝胺的含有病毒的上清液加入到培养OG-MEF六孔板中，2500rpm离心99分钟使病毒感染细胞。病毒感染后随即更换培养液，此时视为“第0天”。病毒感染后2天，将感染后的OG-MEF细胞消化并重新种到预先铺好Feeder细胞的96孔板（细胞密度：5000/孔）中，加入mES培养液（含有15%FBS、2mML-谷氨酸、0.1mM非天然氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1000U/mL白血病抑制因子、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液）。第6天，将细胞培养液替换为KSR培养液（含有15%KnockoutTM血清替代物、2mM L-谷氨酸、0.1mM非天然氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1000U/mL白血病抑制因子、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的KnockoutTM DMEM培养液）。分别在转染后第3天和第5天加入上述制备实施例中制备的化合物，在第12天之后用Olympus IX51倒置荧光显微镜观察GFP+克隆。分别以2%DMSO和1mM VPA（丙戊酸）处理作为阴性对照和阳性对照。
4、iPS克隆数统计
在第17天左右用4%PFA固定96孔板，用Olympus IX51倒置荧光显微镜扫描整张板并拍摄代表性孔的图像，并用image-pro软件记录GFP+克隆数。或用胰蛋白酶消化GFP+克隆后用FACS(guava)进行流式细胞分析，比较加药处理组与对照组GFP信号。化合物活性如表1所示。
表1螺环骨架化合物促进iPS细胞产生的活性
注：“+”定义为有效化合物的不同有效程度。相对于阴性对照产生的克隆数，可使克隆数增加的化合物定义为阳性化合物。将阳性化合物产生的克隆数除以阳性对照VPA产生的克隆数所得的百分比：80%以上为+++，50-80%为++，50%以下为+。
实验实施例2加入小分子化合物CYT296的干细胞培养基能促进四因子诱导的iPS的形成
1、将四因子（Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc）的病毒以等体积混合，加入到6孔板的一孔中共计18万个OG2小鼠胚胎成纤维细胞中，在37℃、5%CO2的环境中培养在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中。以加入病毒当天记为第0天，第2天将细胞消化并重悬于mES培养基中，并接种到预先种满饲养层细胞（放射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞）的96孔板中，每孔5000个细胞。从第3天开始使用添加不同浓度CYT296（125nM、250nM、500nM、1μM）的mES培养基，第6天开始换为加不同浓度CYT296（125nM、250nM、500nM、1μM）的KSR培养基。从第8天开始再换为正常的KSR培养基进行培养。
2、使用如a所述的方法，从第8天开始，每天在倒置荧光显微镜下观察并计数Oct-GFP阳性克隆数，同时使用荧光显微镜拍照。图1A为第15天时96孔板中代表性的图片，可以看到添加了250nM的培养基处理的孔相对于不处理的对照孔，有更多Oct-GFP阳性的克隆。图1B是对Oct-GFP阳性克隆的统计数据。在感染后第15天，250nM CYT296处理的孔中观察到70个左右Oct-GFP阳性克隆，而对照孔观察到1-3个克隆。与对照组相比，统计数据可以看到高渗环境可以提高重编程效率达到对照组的35倍左右。
3、使用如a所述的方法，在第15天消化细胞，利用流式细胞仪检测Oct-GFP阳性的细胞比例。图2A为代表性的流式数据图；图2B是对3次实验的统计数据，显示在四因子诱导条件下，添加250nM CYT296的培养基处理可提高iPS诱导效率12倍。

Claims (18)

1.如下通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
Z为CR1或N；
R1、R2、R3和R4各自独立地为H；卤素原子；取代或未取代的氨基；氰基；取代或未取代的C1-C20烷基；取代或未取代的C2-C6烯基；取代或未取代的C2-C6炔基；取代或未取代的C3-C8环烷基；取代或未取代的C1-C14烷氧基；取代或未取代的C2-C6烯氧基；取代或未取代的C2-C6炔氧基；取代或未取代的C6-C12芳基；取代或未取代的芴基；取代或未取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基；取代或未取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂芳基；取代或未取代的苯并的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂环基；取代或未取代的苯并的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的五元或六元杂芳基；或者取代或未取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；
R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H；取代或未取代的C1-C6烷基；取代或未取代的C2-C6烯基；取代或未取代的C2-C6炔基；卤素原子；氰基；硝基；氨基；取代或未取代的C1-C6烷氧基；取代或未取代的C2-C6烯氧基；取代或未取代的C2-C6炔氧基；苄氧基；取代或未取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；取代或未取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基；
X为-O-；-S-；-[C(R10R11)]t-，其中t为1或2；-S(O)rC(R10R11)-，其中r为0、1或2；或-OC(R10R11)-；其中，各个R10和R11各自独立地为H、C1-C4烷基、C6-C12芳基或卤素原子，优选各自独立地为H、甲基、苯基或卤素原子，更优选各自独立地为H、甲基、或卤素原子，特别优选为H；最优选地，X为-O-、-SCH2-、-OCH2-、-CH2-、-CH2CH2-、-S(=O)CH2-或-S(O2)CH2-；
Y为-C(R12R13)-或-N=NC(R14R15)-；其中，R12和R13各自独立地为H、C1-C6烷基、C1-C4烷氧基羰基或羧基，并优选各自独立地为H、甲基、乙氧基羰基、甲氧基羰基或羧基；R14和R15各自独立地为H或C1-C4烷基，并优选各自独立地为H或甲基，特别优选为H；优选地，Y为-CH2-、-N=NCH2-、-CH(CH3)-、-C(CH3)2-或-CH(COOEt)-。
2.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，
其中，R1、R2、R3和R4各自独立地为H；卤素原子；氨基；氰基；C1-C14烷基；卤代C1-C14烷基；C2-C6烯基；卤代C2-C6烯基；C2-C6炔基；取代或未取代的C3-C6环烷基；C1-C8烷氧基；卤代C1-C6烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；取代或未取代的吗啉基；取代或未取代的哌嗪基；取代或未取代的哌啶基；取代或未取代的苯基；取代或未取代的芴基；取代或未取代的嘧啶基；取代或未取代的吡唑基；取代或未取代的咪唑基；取代或未取代的噻吩基；取代或未取代的吡啶基；取代或未取代的苯并吡啶基；取代或未取代的苯并吡唑基；取代或未取代的苯并噻吩基；取代或未取代的二氮丙啶基；取代或未取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；优选地，R1、R2、R3和R4各自独立地为H；F；Cl；Br；氨基；氰基；甲基；乙基；叔丁基；十四烷基；三氟甲基；4-溴正丁氧基、8-叠氮正辛氧基；烯丙基；环丙基；甲氧基；三氟甲氧基；吗啉基；哌嗪基；苯基；芴基；嘧啶基；吡唑基；噻吩基；吡啶基；苯并吡啶基；苯并吡唑基；苯并噻吩基；二氮丙啶基；由选自卤素、甲基、氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、卤代吡啶基、噻吩基、哌嗪基、4-甲基哌嗪基、哌啶基、C1-C4烷氧基羰基哌啶基、吗啉基和C1-C4烷氧基羰基吗啉基中的取代基取代的吗啉基、哌嗪基、苯基、芴基、嘧啶基、吡唑基、噻吩基、吡啶基、苯并吡啶基、苯并吡唑基、苯并噻吩基或二氮丙啶基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或由选自氨基或C1-C4烷氧基羰基氨基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；和/或
其中，所述R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H；取代或未取代的C1-C6烷基，优选为未取代或由一个、两个或三个卤素原子取代的甲基；卤素原子；氰基；硝基；氨基；取代或未取代的C1-C5烷氧基；取代或未取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；或取代或未取代的二氮丙啶基；更优选地，R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为H；甲基；三氟甲基；甲氧基；三氟甲氧基；苄氧基；F；Cl；Br；硝基；氨基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；由选自氨基或C1-C4烷氧基羰基氨基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或由三氟甲基取代的二氮丙啶基。
3.根据权利要求1或2所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述取代的取代基可以为选自卤素；氨基；氰基；硝基；叠氮基；生物素；二氮丙啶基或三氟甲基取代的二氮丙啶基；C1-C6烷基；卤代C1-C6烷基；C2-C6烯基；C2-C6炔基；C1-C6烷氧基；卤代C1-C6烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；C2-C6烯氧基；C2-C6炔氧基；C1-C6烷氧基羰基；C1-C6烷氧基羰基氨基；未取代或由选自卤素、氨基、C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷氧基中的一个或多个基团取代的苯基；未取代或由选自卤素、氨基、C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷氧基、C1-C6烷氧基羰基中的一个或多个基团取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基或五元或六元杂芳基中的一个或多个取代基；未取代或由选自叠氮基、C2-C6炔基、生物素中的一个或多个基团取代的H(CpH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4；优选地，所述取代的取代基可以为选自卤素；氨基；氰基；硝基；叠氮基；乙炔基；生物素；二氮丙啶基或三氟甲基取代的二氮丙啶基；C1-C4烷基；卤代C1-C4烷基；C2-C4烯基；C1-C4烷氧基；卤代C1-C4烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；C1-C4烷氧基羰基；C1-C4烷氧基羰基氨基；未取代或由选自卤素、氨基、C1-C2烷基、卤代C1-C2烷基、C1-C2烷氧基、卤代C1-C2烷氧基、C1-C4烷氧基羰基中的一个或多个基团取代的含有选自O、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基或五元或六元杂芳基中的一个或多个取代基；未取代或由选自叠氮基、C2-C6末端炔基、生物素中的一个或多个基团取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2或3；优选地，所述取代的取代基可以为选自F；Cl；Br；甲基；三氟甲基；甲氧基；三氟甲氧基；烯丙基；氨基；叔丁氧基羰基氨基；叠氮基；苯基；吡啶基；噻吩基；哌嗪基；哌啶基；吗啉基；由选自F、Cl、Br、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、叔丁氧基羰基中的一个或多个基团取代的吡啶基、噻吩基、哌嗪基、哌啶基或吗啉基中的一个或多个取代基。
4.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，通式I所示的螺环类化合物选自通式II所示的化合物：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、X和Y的定义与权利要求1中的定义相同。
5.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，R1、R2、R3和R4中的至少两个为氢；优选地，R2、R3和R4中的至少两个为氢，特别优选地，R2和R4为氢。
6.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，R5、R6、R7、R8和R9中的至少两个为氢；优选地，R5、R6、R7、R8和R9中的至少三个为氢，特别优选地，R5、R6、R8和R9为氢，还优选的是，R7为甲氧基。
7.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，通式I所示的螺环类化合物选自通式III所示的化合物：
其中，R1、R5、R6、R7、R8、R9、X和Y的定义与权利要求1中的定义相同。
8.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，通式I所示的螺环类化合物选自通式Ⅳ所示的化合物：
其中，R1、R2、R7、R8、X和Y的定义与权利要求1中的定义相同。
9.根据权利要求8所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，在通式Ⅳ中，R2为H；卤素原子；C1-C8烷基；卤代C1-C8烷基；C1-C8烷氧基；卤代C1-C8烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；C3-C6环烷基；C2-C4烯基；C2-C4炔基；噻吩基；未取代或由氨基、C1-C4烷氧基、卤代C1-C4烷氧基或C1-C4烷基哌嗪基取代的苯基或吡啶基；三氟甲基二氮丙啶基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或由C1-C4烷氧基羰基氨基、C2-C6炔基、生物素或叠氮基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；优选地，R2为H；F；Cl；Br；甲基；叔丁基；三氟甲基；环丙基；甲氧基；三氟甲氧基；4-溴正丁氧基；8-叠氮正辛氧基；苯基；噻吩基；吡啶基；由选自氨基、甲氧基、三氟甲氧基或4-甲基哌嗪基取代的苯基。
10.根据权利要求8所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，在通式Ⅳ中，R7为H；卤素原子；C1-C4烷基；卤代C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；卤代C1-C4烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；氰基；硝基；苄氧基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；由C1-C4烷氧基羰基氨基、C2-C6炔基、生物素或叠氮基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或三氟甲基二氮丙啶基。
11.根据权利要求8所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，在通式Ⅳ中，R8为H；卤素原子；C1-C4烷基；卤代C1-C4烷基；C1-C4烷氧基；卤代C1-C4烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；氰基；硝基；苄氧基；H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；由C1-C4烷氧基羰基氨基、C2-C6炔基、生物素或叠氮基取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4；或三氟甲基二氮丙啶基。
12.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，通式I所示的螺环类化合物选自下列化合物：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R12和R13的定义与权利要求1中的定义相同。
13.根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐，其中，通式I所示的螺环类化合物选自下列化合物：
14.权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一
酮1和取代苯甲醛2发生羟醛缩合，得到α,β-不饱和酮3；
步骤二
α,β-不饱和酮3与硫叶立德反应，得到环丙烷螺环类化合物I-1；
或者
α,β-不饱和酮3与重氮甲烷反应，得到二氢吡唑螺环类化合物I-2；
或者
α,β-不饱和酮3与（R12甲基）二甲基溴化硫鎓反应，得到R12取代的环丙烷螺环类化合物I-3；
或者
α,β-不饱和酮3与R12R13CHNO2反应，得到R12和R13取代的环丙烷螺环类化合物I-4；
或者
环丙烷螺环类化合物4与1当量或2当量的间氯过氧苯甲酸（m-CPBA）反应，得到环丙烷螺环亚砜类化合物I-5或环丙烷螺环砜类化合物I-6；
或者
环丙烷螺环类化合物5与R1B(OH)2或通过Suzuki偶联反应得到环丙烷螺环类化合物I-7，其中，U为溴或氯；
反应式中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R12、R13、X和Z定义与权利要求1中的定义相同。
15.权利要求1-13中任一项所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于促进iPS细胞生成的药物中的应用。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐。
17.一种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，在诱导重编程过程中，使用权利要求1-13中任一项所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐对体细胞进行处理。
18.权利要求1-13中任一项所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐作为提高iPS细胞诱导效率的小分子调节剂的用途。
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