CN104704365B - 精神分裂症标记物组及其利用 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供能够高精度地辨别精神分裂症的生物标记物的组合及其用途。本发明提供一种精神分裂症标记物组，其由选自三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷?3、尿卟啉原脱羧酶、干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、谷氧还蛋白?3、微管相关蛋白RP/EB家族成员1、微管蛋白折叠辅助因子B、免疫球蛋白mu链C区以及70kDa热休克蛋白4L中的2个以上的蛋白质分子的组合构成。另外，本发明提供以该标记物组在检体中的水平值为指标的精神分裂症检查法。

Description

精神分裂症标记物组及其利用

技术领域

本发明涉及对检查精神分裂症有用的精神分裂症标记物。详细而言，涉及能够用于判定精神分裂症的发病可能性(患病概率)的生物标记物的组合(生物标记物组)以及利用该生物标记物组的精神分裂症的检查法等。本申请基于2012年10月15日申请的日本专利申请第2012－228417号要求优先权，通过参照而援用该专利申请的全部内容。

背景技术

精神分裂症是在青春期·青少年期发病的慢性·进行性的精神疾病，以阳性症状(幻觉、妄想、紊乱的语言或动作等)、阴性症状(情感麻痹、思考困难、积极性下降等)和认知障碍(注意障碍、工作记忆下降、执行功能障碍等)为主要症状。认为精神分裂症是遗传因素和环境因素参与的多因素疾病，但是由于关于精神分裂症的病症的分子生物学机制，依然有很多不明白的部分，结果没有找到一种生物化学的检查法。

精神分裂症的诊断一直以来是按照以医师的问诊、患者的申述为基础的症候学进行的，基于生物化学的检查的诊断法还没有确立。认为精神分裂症在发病后数年病情恶化，引起不可逆的障碍，产生社会功能的永久性障碍，但由于没有对诊断有用的检查法，所以治疗介入迟缓，其结果，现状是难治的病例不少。迫切期望开发出对精神分裂症的诊断有用的检查法，但是认为该疾病是由于脑内分子的异常而发病的，另一方面，测知脑的分子病症是极其困难的，检查法的开发没有进展。

根据双胞胎研究等的结果，明确了遗传因素与精神分裂症的发病有很大关系。目前，根据对精神分裂症患者和健康人进行的基因解析，鉴定出启示与精神分裂症的发病有关的一些候选基因(例如非专利文献1～3)，但由于使这些基因和精神分裂症的病症明确化的线索少，所以尚未弄清楚疾病的发病分子机制。其结果，现状是本疾病的病症生理依然不明，基于生物化学的检查的诊断法还未确立。

专利文献

专利文献1：日本特开2012－013415号公报

非专利文献

非专利文献1：Arcos-Burgos M.et al.,Am J Hum Genet 77,6p937-44,2005

非专利文献2:Lewis CM.et al.,Am J Hum Genet 73,34-48,2003

非专利文献3:Badner JA.and Gershon ES.,Mol Psychiatry 7,405-11,2002

发明内容

本发明的课题在于提供一种能够对精神分裂症进行高精度的辨别的生物标记物的组合以及其用途(检查法、检查试剂、检查试剂盒等)。

本发明人等为了找出精神分裂症特异性的生物标记物，着眼于末梢血液中含有的淋巴细胞而进行研究。作为其成果，报告了在患者组和健康人组之间在表达水平值上看到显著差别的22种蛋白质(专利文献1)。成功鉴定的这些蛋白质的大部分被确认在脑内也表达，强烈地启示了与精神分裂症的病症形成密切相关的可能性大。

鉴定出的22种蛋白质即便分别单独使用，其利用价值也很大。然而，在临床领域要求尽可能高的辨别精度，使用单一的生物标记物时，难以应对这样的要求。另外，像精神分裂症这样因各种因素而发病的疾病的辨别中，为了实现更高的精度，认为并用多个生物标记物是有利的。基于这样的观点，目标是运用统计学的方法确定出能够进行高精度的辨别的生物标记物的组合。其结果，成功地发现特别有效的生物标记物，并且确定出具有非常高的辨别精度的生物标记物的组合。使用了所确定的生物标记物的组合的检查的实用性极高，期待有助于精神分裂症的诊断技术的飞跃性的提高。以下所示的发明主要基于以上的成果。

[1]一种精神分裂症标记物组，由选自三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、谷氧还蛋白-3、微管相关蛋白RP/EB家族成员1、微管蛋白折叠辅助因子B、免疫球蛋白mu链C区、以及70kDa热休克蛋白4L中的2个以上的蛋白质分子的组合构成。

[2]根据[1]所述的精神分裂症标记物组，至少包含三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、以及谷氧还蛋白-3。

[3]根据[2]所述的精神分裂症标记物组，进一步包含微管相关蛋白RP/EB家族成员1和/或微管蛋白折叠辅助因子B。

[4]根据[1]所述的精神分裂症标记物组，由三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、谷氧还蛋白-3、微管相关蛋白RP/EB家族成员1、以及微管蛋白折叠辅助因子B的组合构成。

[5]根据[1]所述的精神分裂症标记物组，由三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、以及谷氧还蛋白-3的组合构成。

[6]根据[1]所述的精神分裂症标记物组，至少包含三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3和干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1。

[7]根据[1]所述的精神分裂症标记物组，由三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3和干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1的组合构成。

[8]根据[1]所述的精神分裂症标记物组，包含选自三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、以及70kDa热休克蛋白4L中的1个以上的蛋白质分子。

[9]一种精神分裂症检查法，以[1]～[8]中任一项所述的精神分裂症标记物组在检体中的水平值为指标。

[10]根据[9]所述的精神分裂症检查法，包括以下步骤(1)～(3)：

(1)准备来自被检查者的检体的步骤；

(2)检测上述检体中的构成上述标记物组的各蛋白质分子的步骤；以及

(3)基于检测结果，判定精神分裂症在现在或将来发病的可能性的步骤。

[11]根据[10]所述的精神分裂症检查法，其中，关于三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、谷氧还蛋白-3、微管相关蛋白RP/EB家族成员1、微管蛋白折叠辅助因子B、以及70kDa热休克蛋白4L，检测值低就表示精神分裂症的发病可能性高，

关于干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1和免疫球蛋白mu链C区，检测值高就表示精神分裂症的发病可能性高。

[12]根据[10]或[11]所述的精神分裂症检查法，其中，使用Logistic模型进行步骤(3)的判定。

[13]根据[9]～[12]中任一项所述的精神分裂症检查法，其中，上述检体是血液、血浆、血清、口腔粘膜、鼻粘膜、皮肤、血液细胞、或者使从被检查者采集的血液淋巴细胞永生化而得的类淋巴母细胞。

[14]一种精神分裂症检查试剂盒，包括用于检测构成[1]所述的精神分裂症标记物组的各蛋白质分子的试剂、以及操作说明。

[15]根据[14]所述的精神分裂症检查试剂盒，其中，上述试剂分别由针对作为其靶标的蛋白质分子的抗体构成。

附图说明

图1是表达解析(免疫印迹和2D-DIGE法)的结果。示出了各解析的S/C(精神分裂症患者组与健康人组的比)和p值(Student’s t-test)。

图2是表示修正型AUC大的上位30个模型的特征的表。

图3是表示候选模型1所含的蛋白质的比值比的表。

图4是表示候选模型2所含的蛋白质的比值比的表。

图5是被选择的生物标记物的有效性的验证。使用生物标记物的筛选中使用的30个检体(筛选数据)和另外的30个检体(验证数据)进行验证。

图6是被选择的生物标记物的有效性的验证。总结了各生物标记物的功能说明和验证结果。

图7是使用了验证数据集的4种生物标记物(MX1、GART、UROD以及GLRX3)的验证。用4变量模型进行评价。

图8是使用了验证数据集的4种生物标记物(MX1、GART、UROD以及GLRX3)的验证。评价4变量模型对验证数据的预测性能。AUC为0.724。根据数据个数(N＝30)，可以说重现性好。

图9是使用了验证数据集的6种生物标记物(MX1、GART、UROD、GLRX3、MAPRE1以及TBCB)的验证。用6变量模型进行评价。

图10是使用了验证数据集的6种生物标记物(MX1、GART、UROD、GLRX3、MAPRE1以及TBCB)的验证。评价6变量模型对验证数据的预测性能。AUC为0.664。

图11表示MX1、GART和HSPA4L的相关关系(验证数据中的相关系数，综合两方数据时的相关系数)。

图12是各种预测模型及其辨别精度。上段的4个预测模型是用筛选数据集进行预测模型的构建并用验证数据集进行评价的。中段的4个预测模型是用验证数据集进行预测模型的构建并用筛选数据集进行评价的。下段的4个预测模型中，用筛选数据集和验证数据集构建预测模型。S：筛选数据集，V：验证数据集，I：将筛选数据集和验证数据集进行综合。

具体实施方式

1.精神分裂症标记物组

本发明的第1方面涉及一种精神分裂症特异性蛋白质分子(生物标记物)的组合，即精神分裂症标记物组(以下也称为“本发明的生物标记物组”)。本发明的生物标记物组在判定·评价精神分裂症在现在或将来发病的可能性方面有用。“现在发病的可能性”表示检查时是否精神分裂症在患病或发病(是否为精神分裂症)、或者患病或发病的概率。另一方面，“将来发病的可能性”表示精神分裂症将来发病的可能性(风险)。“精神分裂症”是以精神功能的分裂为基础的精神疾病群的统称。根据世界卫生组织(WHO)的疾病与相关健康问题的国际统计分类(ICD)，被分成妄想型、青春型、紧张型、未分化型、精神分裂症后抑郁、残留型、单纯型。

本发明的生物标记物组由确认了与精神分裂症的相关性的蛋白质分子的组合构成。具体而言，由选自以下列举的8种蛋白质中的2个以上的蛋白质分子构成本发明的生物标记物组。优选由3个以上，更优选由4个以上的蛋白质分子构成本发明的生物标记物组。

三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3(以下，称为“GART”。序列号1)；

尿卟啉原脱羧酶(以下，称为“UROD”。序列号2)；

干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1(以下，称为“MX1”。序列号3)；

谷氧还蛋白-3(以下，称为“GLRX3”。序列号4)；

微管相关蛋白RP/EB家族成员1(以下，称为“MAPRE1”。序列号5)；

微管蛋白折叠辅助因子B(以下，称为“TBCB”。序列号6)；

免疫球蛋白mu链C区(以下，称为“IGHM”。序列号7)；

70kDa热休克蛋白4L(以下，称为“HSPA4L”。序列号8)

作为本发明的生物标记物组，可采用上述蛋白质的各种组合。其中，如后述的实施例(特别是图2的表)所示，GART、UROD、MX1、GLRX3在能够进行精度极高的辨别这方面特别有用且重要。因此，在本发明的优选的一个方式中，提供至少包含这4个蛋白质分子的精神分裂症标记物组。另一方面，显示了MAPRE1和TBCB仅次于上述4个蛋白质分子，也是有用的。因此，还优选除上述4个蛋白质分子以外，还组合MAPRE1和TBCB中的2个或者1个而构成精神分裂症标记物组。

以下列举本发明的生物标记物组的具体例。应予说明，它们是利用统计学方法进行解析的结果，被确定为具有高辨别精度的组合。

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、HSPA4L的组合

GART、UROD、GLRX3、MAPRE1、TBCB的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、MAPRE1、TBCB的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、TBCB、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、MAPRE1、TBCB、HSPA4L的组合

GART、UROD、GLRX3、MAPRE1、TBCB、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、IGHM、HSPA4L的组合

GART、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、TBCB、HSPA4L的组合

GART、UROD、GLRX3、MAPRE1、TBCB的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、TBCB、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、MAPRE1、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、MAPRE1、TBCB、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、IGHM的组合

GART、UROD、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、TBCB、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、MAPRE1、TBCB、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、HSPA4L的组合

GART、MX1、GLRX3、MAPRE1、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、IGHM的组合

GART、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM、HSPA4L的组合

GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、TBCB、IGHM的组合

GART、UROD、MX1、TBCB、IGHM、HSPA4L的组合

以上组合中，GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB的组合显示出最高的辨别精度。考虑到该事实，可以说该组合是最佳的生物标记物组之一。另外，基于统计学中的奥卡姆剃刀(Occam’s razor)这样的理论，只要辨别精度为同等程度，则辨别中使用的蛋白质的个数越少越好(详细内容后述)。最符合该理论的组合是GART、UROD、MX1、GLRX3的组合。

如后述的实施例所示，根据重现性的验证结果，判明GART和MX1的重现性好。鉴于该认识，优选在生物标记物组中包含GART和MX1。特别优选由GART和MX1这两者构成生物标记物组。另一方面，在GART和MX1的重现性好的认识的基础上，以HSPA4L的重现性也较好的认识为根据，在本发明的优选的一个方式中，以包含选自GART、MX1和HSPA4L中的1个以上的蛋白质分子的方式构成生物标记物组。

2.精神分裂症检查法

本发明的第2方面涉及上述本发明的生物标记物组的用途，提供检查精神分裂症在现在或将来发病的可能性的方法(以下，也称为“本发明的检查法”)。本发明的检查法作为用于判定是否精神分裂症在患病或者发病的手段，或者作为用于判定精神分裂症将来发病的可能性的手段是有用的。本发明的检查法给予对诊断精神分裂症有用的信息。根据本发明的检查法，能够简便且客观地判定精神分裂症的发病可能性。

但是，将从精神分裂症等的精神病发病到开始药物疗法为止的时间延迟称为精神病未治疗期(Duration of untreated psychosis；DUP)。已知DUP越长，临床恢复越不好。另一方面，发病后的数年是影响预后的重要时期，称为临界期(critical period)。在脑神经图像解析的认识中，报告了DUP越长，则作为左颞上回的一部分的颞平面的体积越小(Takahashi et al.:Psychiatry Res 154:209-219,2007)，该认识启示了在病初期(临界期)的未治疗期进行脑形态变化，而且，不仅缩短DUP、而且也改善临界期中的神经生物学变化的早期介入是极其重要的。本发明的检查法还能够用于筛选精神分裂症，还有助于精神分裂症的早期发现·早期治疗。

本发明的检查法中，将来自被检查者的检体中的本发明的生物标记物组的水平值作为指标使用。这里的“水平值”典型的是“量”或者“浓度”。但是，根据惯例和技术常识，在表达能否检测出检测对象的分子(即，有无表观上的存在)时也使用用语“水平值”。应予说明，只要考虑到所要求的精度、检查的简便性等而决定所采用的生物标记物组即可。

本发明的检查法中进行以下步骤。

(1)准备来自被检查者的检体的步骤

(2)检测构成上述检体中的标记物组(即，选自GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM、HSPA4L中的2个以上(优选为3个以上，更优选为4个以上)的蛋白质分子的组合)的各蛋白质分子的步骤

(3)基于检测结果，判定精神分裂症在现在或将来发病的可能性的步骤

步骤(1)中准备来自被检查者的检体。作为检体，可以使用被检查者的血液、血浆、血清、口腔粘膜、鼻粘膜、皮肤等。另外，可以使用从被检查者来源中采集的血液细胞作为检体。可以使用从血液细胞分离的淋巴细胞、B细胞或者T细胞作为检体。另外，可以使用次代培养后的细胞。另一方面，也可以将使从被检查者采集的血液淋巴细胞永生化而得的类淋巴母细胞作为检体。“类淋巴母细胞”是与分化为成熟淋巴细胞前的细胞类似的细胞，可以通过利用EB(Epstein-Barr)病毒使从血液分离的淋巴细胞永生化而制备。形成细胞株的类淋巴母细胞与新鲜血液细胞相比，可以说显示出更反映出疾病的特征·性状的蛋白质表达谱。因此，如果将类淋巴母细胞作为检体，能够防止该疾病以外的要素，即采集时的被检查者的状态(状态依赖性因素)掩盖本来应该显示的表达谱(即，用本检测法应该检测出的表达谱)。其结果，可得到更反映出疾病的特征·性状的可信度高的检查结果。由于以血液、血浆或者血清等为检体的检查操作简便，所以作为筛选性检查特别有用，另一方面，由于以类淋巴母细胞为检体的检查给予可信度更高的结果，所以作为2次检查或作为确诊的手段特别有用。因此，如果通过以血液、血浆或者血清等为检体的检查来排查高危人群(发病的可能性高的人)后，再进行以类淋巴母细胞为检体的检查，能够进行高效率且可信度高的诊断。

被检查者没有特别限定。即，对于需要判定精神分裂症在现在或将来发病的可能性(即，是否精神分裂症在患病或发病、精神分裂症发病的可能性的程度、精神分裂症将来发病的可能性的程度)的人，都能广泛适用于本发明。例如，对于通过医师的问诊等而被诊断为精神分裂症的患者适用本发明时，基于蛋白质的表达水平值这样的客观指标，能够判定该诊断是否正确。即，若采用本发明的检查法，则可得到辅助或支持以往的诊断的信息。该信息对决定更适当的治疗方针有益，促进治疗效果的提高、患者的QOL(Quality of Life，生活质量)的提高。另一方面，在患病状态的监控中利用本发明，还能够实现难治化、病重化、复发等的防止。

由家族背景等被推定精神分裂症的患病风险高的人(高危人)也是合适的被检查者。对于这样的被检查者在显现精神分裂症的症状之前应用本发明，能够阻止或延迟发病，或者能够进行早期的治疗介入。出于确定精神分裂症的患病风险高的人的目的，本发明也是有用的。这样的确定使得通过例如预防措施、生活习惯改善等而降低发病的可能性(患病可能性)成为可能。没有自觉症状的人等、在以往的诊断中无法或者难以判定是否为精神分裂症的人也是本发明的合适的受检者。应予说明，可以将本发明作为健康诊断的一个项目来实施。

步骤(2)中检测检体中的各生物标记物。不需要严格地定量各生物标记物的水平值。即，只要以在后续的步骤(3)中能够判定精神分裂症的发病可能性的程度检测各生物标记物的水平值即可。例如，也能够以可辨别检体中的各生物标记物的水平值是否超过规定的基准值的方式进行检测。

各生物标记物的检测方法没有特别限定，但优选利用免疫学的方法。若采用免疫学的方法，则能够进行快速且灵敏度高的检测。另外，操作也简便。在利用免疫学的方法进行的测定中，使用对所采用的生物标记物具有特异结合性的物质。作为该物质，通常可使用抗体，但并不局限于抗体，只要是对该生物标记物具有特异结合性且能够测定其结合量的物质，就可以采用。应予说明，并不局限于市售的抗体，可以采用利用免疫学的方法、噬菌体展示法、核糖体展示法等而新制备的抗体。

作为测定法，可例示乳胶凝集法、荧光免疫测定法(FIA法)、酶免疫测定法(EIA法)、放射免疫测定法(RIA法)、免疫印迹法。作为优选的测定法，可举出FIA法和EIA法(包括ELISA法)。若采用这些方法，则能够高灵敏度、快速且简便地进行检测。FIA法中使用经荧光标记的抗体，将荧光作为信号来检测抗原抗体复合物(免疫复合物)。另一方面，EIA法中使用经酶标记的抗体，将基于酶反应的发色或发光作为信号来检测免疫复合物。

ELISA法具有检测灵敏度高、特异性高、定量性优异、操作简便、适合多检体的同时处理等很多优点。以下示出利用ELISA法时的具体操作法的一个例子。首先，将抗生物标记物抗体固定于不溶性支撑体。具体而言，例如用抗生物标记物单克隆抗体敏化(涂布)微量滴定板的表面。使检体与这样固相化的抗体接触。该操作的结果是，如果针对固相化的抗生物标记物抗体的抗原(作为生物标记物的蛋白质分子)存在于检体中，则形成免疫复合物。通过清洗操作，除去非特异性结合成分后，添加与酶结合的抗体而标记免疫复合物，接着与酶的底物反应而发色。然后，以发色量为指标而检测免疫复合物。应予说明，ELISA法的详细内容记载在很多专著、论文中，设定各方法的实验步骤、实验条件时可以参考这些专著、论文。应予说明，并不局限于非竞争法，也可以采用竞争法(与检体一起添加抗原进行竞争的方法)。另外，可以采用利用标记化抗体直接检测检体中的生物标记物的方法，或者可以采用夹心法。夹心法中使用表位不同的2种抗体(捕获用抗体和检测用抗体)。

可以采用蛋白质阵列、蛋白质芯片等能够同时检测多个检体的手段。探针使用例如靶标的生物标记物特异性抗体。

步骤(3)中，基于检测结果判定精神分裂症在现在或将来发病的可能性。为了能够进行精度好的判定，可以在将步骤(2)中得到的检测值与对照检体(对照物)的检测值进行比较的基础上进行判定。发病可能性的判定可以是定性、定量中的任一种。应予说明，这里的判定由其判定基准可知，即便不依靠医师、检查技师等具有专业知识的人的判断，也可以自动/机械地进行。

本发明中，作为原则，对于各生物标记物，采用以下的基准。即，对于GART、UROD、GLRX3、MAPRE1、TBCB、HSPA4L，检测值低就表示精神分裂症的发病可能性高(检测值与发病可能性呈负的相关关系)，对于MX1、IGHM，检测值高就表示精神分裂症的发病可能性高(检测值与发病可能性呈正的相关关系)。

步骤(3)的判定可以使用与所采用的生物标记物组对应的Logistic模型(统计模型)进行。以下，示出具体例(使用由GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB构成的生物标记物组的情况)。

＜使用Logistic模型的判定＞

以下的Logistic模型中，计算p。具体而言，将各蛋白质分子的水平值(检测值)代入以下的式子中，求出精神分裂症的发病可能性(精神分裂症患病概率)。

$p=\frac{\exp (11.54-4.64\mathrm{GART}-2.67\mathrm{UROD}+2.04\mathrm{MX}1-3.14\mathrm{GLRX}3-1.65\mathrm{MARPRE}1-2.01\mathrm{TBCB})}{1+\exp (11.54-4.64\mathrm{GART}-2.67\mathrm{UROD}+2.04\mathrm{MX}1-3.14\mathrm{GLRX}3-1.65\mathrm{MARPRE}1-2.01\mathrm{TBCB})}$

另一方面，预先设定基准值或CUT-OFF值，按照以下的(a)、(b)作出定性的判定。应予说明，判定中使用的基准值、CUT-OFF值考虑使用的检体的种类、状态，要求的精度(可信度)等决定即可。

(a)将生物标记物组所含的生物标记物全部为阳性(CUT-OFF值以上)的情况判定为阳性(例如发病可能性为50％以上)，将除其以外的情况判定为阴性(例如发病可能性低于50％)。

(b)将生物标记物组所含的生物标记物中有1个为阳性(CUT-OFF值以上)的情况判定为阳性(例如发病可能性为50％以上)，将除其以外的情况判定为阴性(例如发病可能性低于50％)。

可以预先设定多个判定区间，并作出定量或者半定量判定。定量判定的情况下，例如，预先设定与各生物标记物的水平值的范围相关的多个判定区间(各判定区间中规定精神分裂症的发病可能性)，并由各生物标记物的水平值确定出检体属于的判定区间。判定区间的个数和与各判定区间相关的各生物标记物的水平值以及判定结果没有特别限定，可以通过预实验等任意地设定。例如，以规定的阈值为边界而判定发病可能性的高低时的“阈值”、与发病可能性的高低涉及的区间相关的“生物标记物的水平值范围”可以通过使用了多个检体的统计解析来决定。利用统计处理进行解析时，一般设定高风险组和低风险组是有效的。作为高风险组，例如，在精神分裂症患者的群体、家族中精神分裂症患者多的人的群体符合，作为低风险组，例如，在健康人的群体、家族中没有精神分裂症患者的人的群体符合。

在本发明的一个方式中，将对同一个被检查者在某时间点测定的各生物标记物的水平值与过去测定的各生物标记物的水平值进行比较，分析各生物标记物的水平值有无增减和/或增减的程度。其结果得到的与生物标记物组的水平值变化有关的数据是对于监控精神分裂症的发病可能性的变化有用的信息。即，根据生物标记物组的水平值变动，能够进行从上次的检查到这次的检查之间发病可能性变高或者变低或者没有变化这样的判定。如果将这样的评价与精神分裂症的治疗同时进行，则能确认治疗效果自不必说，还能够预先掌握精神分裂症复发的征兆。由此，能够决定更适当的治疗方针。这样，本发明能够对治疗效果的最大化和患者的QOL(生活质量)提高有巨大的贡献。

3.精神分裂症检查试剂盒

本发明还进一步提供用于检查精神分裂症的发病可能性的试剂盒。本发明的试剂盒包括用于检测构成精神分裂症标记物组的各蛋白质分子的试剂。对各生物标记物(蛋白质分子)，准备试剂。各试剂由向对应的生物标记物显示特异结合性的物质(以下，称为“结合分子”)构成。例如，如果为GART用的试剂，则使用对GART显示特异结合性的物质作为试剂。作为结合分子的例子，可举出特异性识别生物标记物的抗体、核酸适配体和肽适配体。结合分子只要具有对采用的生物标记物的特异结合性，其种类、来源等就没有特别限定。另外，为抗体时，可以为多克隆抗体、寡克隆抗体(数种～数十种的抗体的混合物)以及单克隆抗体中的任一种。作为多克隆抗体或者寡克隆抗体，除来自进行动物免疫而得的抗血清的IgG组分以外，还可以使用利用抗原的亲和精制抗体。抗生物标记物抗体可以是Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv、dsFv抗体等抗体片段。

结合分子可以用常规方法制备。如果能够获得市售品，则可以使用该市售品。例如，如果为抗体，则可以利用免疫学的方法、噬菌体展示法、核糖体展示法等制备。利用免疫学的方法的多克隆抗体制备可以按照下述步骤进行。制备抗原(生物标记物或其一部分)，使用该抗原对兔子等动物实施免疫。可以通过对生物体试样进行精制而得到抗原。另外，也可以使用重组型抗原。重组型抗原例如可以通过使用载体将编码生物标记物的基因(也可以为基因的一部分)导入适当的宿主中，使其在得到的重组细胞内表达而制备。

为了增强免疫诱导作用，可以使用与载体蛋白结合的抗原。作为载体蛋白，使用KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin：钥孔血蓝蛋白)、BSA(Bovine Serum Albumin：牛血清白蛋白)、OVA(Ovalbumin：卵白蛋白)等。载体蛋白的结合可使用碳化二亚胺法、戊二醛法、重氮缩合法、MBS(马来酰亚胺苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)法等。另一方面，也可以采用使生物标记物分子(或者其一部分)表达为与GST、β半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、或者组氨酸(His)标签蛋白等的融合蛋白的抗原。这样的融合蛋白可以利用通用的方法简便地精制。

根据需要反复进行免疫，在抗体值充分上升的时刻采血，通过离心处理等得到血清。对得到的抗血清进行亲和精制，制成多克隆抗体。

另一方面，单克隆抗体可以按照下述步骤制备。首先，按照与上述相同的步骤实施免疫操作。根据需要反复进行免疫，在抗体值充分上升的时刻从免疫动物取出产生抗体的细胞。接下来，将得到的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合而得到杂交瘤。接着，将该杂交瘤单克隆化后，选择产生对目标蛋白质具有高的特异性的抗体的克隆体。通过对被选择的克隆体的培养液进行精制而得到目标抗体。另一方面，也可以使杂交瘤增殖到所希望的个数以上后，将其移植到动物(例如小鼠)的腹腔内，使其在腹水内增殖并精制腹水，从而获得目标抗体。上述培养液的精制或者腹水的精制优选采用使用了蛋白G、蛋白A等的亲和层析。另外，也可以采用将抗原固相化的亲和层析。还可以进一步使用离子交换色谱、凝胶过滤色谱、硫酸铵盐析以及离心分离等方法。这些方法可以单独使用或者任意组合使用。

作为保持对生物标记物的特异结合性的条件，可以对得到的抗体实施各种改型。可以将这样的改型抗体作为本发明的试剂。

如果使用标记抗体作为特异性结合分子，则可以将标记量作为指标而直接检测结合抗体量。因此，能够构建更简便的检查法。相反，存在需要准备与标记物结合的抗体且检测灵敏度一般变低这样的问题点。因此，优选利用与标记物结合的二级抗体的方法、利用二级抗体和标记物结合的聚合物的方法等间接检测方法。这里的二级抗体是指对采用的生物标记物特异性抗体具有特异结合性的抗体。例如，制备生物标记物特异性抗体作为兔子抗体时，可以使用抗兔子IgG抗体作为二级抗体。市售可对兔子、山羊、小鼠等的各种抗体使用的标记二级抗体有市售(例如FUNAKOSHI株式会社、Cosmo Bio株式会社等)，可以根据本发明的试剂适当地选择合适的二级抗体使用。

作为标记物的例子，有过氧化物酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等酶，异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)和铕等荧光物质，鲁米诺、异鲁米诺和吖啶衍生物等化学发光物质，NAD等辅酶、生物素，以及¹³¹I和¹²⁵I等放射性物质。

一个方式中，本发明的试剂根据其用途进行固相化。固相化中使用的不溶性支撑体没有特别限定。例如可以使用由聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、有机硅树脂、尼龙树脂等树脂，玻璃等不溶于水的物质构成的不溶性支撑体。抗体向不溶性支撑体上的担载可以通过物理吸附或者化学吸附来进行。

本发明的试剂盒中通常附带操作说明书。试剂盒中也可以包括实施检查法时使用的其它试剂(缓冲液、阻断用试剂、酶的底物、发色试剂等)和/或装置或器具(容器、反应装置、吸收分光光度计、荧光检测仪等)。另外，优选试剂盒中包含构成生物标记物组的各蛋白质分子或者其片段作为标准样品。

实施例

根据之前的研究，鉴定出确认与精神分裂症的相关性的22种蛋白质(专利文献1)。为了确定出能够进行高精度的辨别的生物标记物的组合，进行了以下的研究。

1.利用免疫印迹进行的表达解析

(1)方法

以30名精神分裂症患者(男性15名：43.7±12.6岁，女性15名：43.1±8.9岁)和30名健康人(男性15名：44.4±12.9岁，女性15名：43.2±9.6岁)为对象，利用免疫印迹法对鉴定出的22种蛋白质进行表达量的再确认。

(2)结果

在22种蛋白质中，确认了表达量的显著差异(Student’s t-test,p<0.05)的蛋白质为8种。在精神分裂症患者组中，确认了表达上升的蛋白质为2个(MX1、IGHM)，确认了表达下降的蛋白质为6个(MAPRE1、TBCB、GLRX3、UROD、HSPA4L、GART)(图1)。

2.利用统计学的方法制作疾病辨别模型

采用统计假设检验对精神分裂症患者组和健康人组的蛋白质表达量的平均值的差进行比较，结果存在显著差异的蛋白质为8种(Student’s t-test,p<0.05)(与上述结果相同)。从该8种中，鉴定出对精神分裂症患者组和健康人组的辨别有用的蛋白质，制成能够高精度辨别疾病的统计模型(Logistic模型)。Logistic模型是用于辨别下式(式(1))表示的二值响应(这里为精神分裂症患者和健康人)的统计模型。

这里，p为患精神分裂症的概率，蛋白质1～蛋白质k为辨别中使用的蛋白质的表达量。β₀为截距，β₁～β_k为表示各蛋白质的表达量对患精神分裂症的概率的影响的大小的参数，由蛋白质表达数据推定。β为为正(负)是指如果其蛋白质的表达量大，则患精神分裂症的概率高(低)。为了制作高精度的疾病辨别模型，需要从总共255(＝₈C₁+₈C₂+₈C₃+₈C₄+₈C₅+₈C₆+8C₇+₈C₈)个蛋白质的组合中选定最佳的组合。利用以下的统计方法，鉴定出2个适合疾病辨别的蛋白质的组合(辨别模型)。

＜辨别模型1＞

对255个蛋白质的组合，基于偏差修正型曲线下面积(AUC：areaunder the curve)、LOO交叉验证(LOOCV：leave one out crossvalidation)分别算出预测误差。修正型AUC越接近1.0，意味着基于LOOCV的预测误差越小，其组合的辨别精度越高。应予说明，两个指标均是统计学的教科书和论文中推荐的评价指标。图2表示修正型AUC大的上位30个蛋白质的组合。由图2的表可知采用GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB的模型(以下，辨别模型1)的辨别精度最高(修正型AUC：0.877，预测误差：0.164)。辨别模型1的Logistic模型如下(式(2))。

$p=\frac{\exp (11.54-4.64\mathrm{GART}-2.67\mathrm{UROD}+2.04\mathrm{MX}1-3.14\mathrm{GLRX}3-1.65\mathrm{MARPRE}1-2.01\mathrm{TBCB})}{1+\exp (11.54-4.64\mathrm{GART}-2.67\mathrm{UROD}+2.04\mathrm{MX}1-3.14\mathrm{GLRX}3-1.65\mathrm{MARPRE}1-2.01\mathrm{TBCB})}---\left(2\right)$

由式(2)可知MX1越大，患精神分裂症的概率越高，其它的蛋白质的值越大，患精神分裂症的概率越低。

＜辨别模型2＞

统计学中具有奥卡姆剃刀(Occam’s razor)这样的理论。该理论是“只要能够同样地说明某种现象，假设的数目越少越好”。具体而言，使用统计模型，用多个解释变量(蛋白质)的测定数据说明因变量(精神分裂症的有无)时，越增加统计模型所包含的解释变量的个数，使模型变得越复杂，则对“其测定数据”的拟合度变得越好好。但是，该统计模型会与“其测定数据(过去的数据)”过拟合，与新测定的数据的拟合变差。即，统计模型与现有的数据过拟合(Overfitting)。为了避免该问题，统计模型所包含的解释变量越少越好。基于该理论，如果辨别精度为同等程度，则辨别中使用的蛋白质个数越少越好。由图2的表可知采用GART、UROD、MX1、GLRX3的模型(以下，辨别模型2)是符合该理论的模型(修正型AUC：0.860，预测误差：0.178)。辨别模型2的Logistic模型(式(3))如下。

$p=\frac{\exp (6.44-3.82\mathrm{GART}-2.18\mathrm{UROD}+2.48\mathrm{MX}1-2.84\mathrm{GLRX}3)}{1+\exp (6.44-3.82\mathrm{GART}-2.18\mathrm{UROD}+2.48\mathrm{MX}1-2.84\mathrm{GLRX}3)}---\left(3\right)$

可知参数的正负与辨别模型1相同，各蛋白质对患精神分裂症的概率的影响在辨别模型1和2中相同。

＜辨别模型1和2的比较＞

将辨别模型1和2所含的蛋白质的比值比分别示于图3和图4。两个模型所含的蛋白质对精神分裂症患病概率的影响在统计学上是显著(p<0.05)或者边缘显著(p<0.10)时，表示是适合辨别的蛋白质。另外，采用逐步变量选择法这样的统计方法，选定适合辨别的蛋白质的组合。其结果，选择GART、UROD、MX1、GLRX3，辨别模型2的有用性也得到不同的统计方法的支持。此外，由图2的表可知按GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB、IGHM、HSPA4L的顺序包含在模型中的次数多。

以上的研究结果启示了以下的内容。

·辨别模型1和2的精神分裂症辨别精度在统计学上几乎相同。

·精神分裂症的辨别中，图2的几乎所有模型中包含的GART、UROD、MX1、GLRX3特别重要。

·辨别模型1所含的MARPRE1和TBCB对辨别的有用性也高。

＜使用辨别模型的精神分裂症的判定＞

使用辨别模型1或2判定是否为精神分裂症时，计算精神分裂症患病概率(式(2)或(3)中的p)。例如，使用辨别模型1时，测定患者的GART、UROD、MX1、GLRX3、MAPRE1、TBCB，将该值代入式(2)，求出精神分裂症患病概率。

3.生物标记物的有效性的验证

使用另外的临床检体验证被选择的8种生物标记物的有效性。将利用免疫印迹验证的结果示于图5、6。关于MX1、GART和HSPA4L，筛选数据(上述1.中使用的30个检体的数据)和验证数据(另外的30个检体的数据)显示向相同方向的变化(存在统计的显著性)，具有重现性。

使用验证数据集验证4种生物标记物(MX1、GART、UROD以及GLRX3)的有效性，结果MX1和GART重现了显著性(图7、8)。另外，使用验证数据集验证6种生物标记物(MX1、GART、UROD、GLRX3、MAPRE1以及TBCB)的有效性时，MX1和GART重现了显著性(图9、10)。应予说明，结果是4变量模型的预测精度更好。

基于MX1、GART和HSPA4L具有重现性，通过多变量解析对这3个分子的相关关系进行分析。将结果示于图11。括弧内的数值从左依次为筛选数据中的相关系数、验证数据中的相关系数、将两方的数据综合时的相关系数。3个分子间完全没有相关关系。应予说明，估计多变量解析中没有看到HSPA4L的显著性的原因不是多重共线性的影响。

另一方面，基于MX1和GART重现了显著性，特别着眼于这些生物标记物，并且构建了使用的生物标记物的种类和个数不同的多个预测模型，对8种生物标记物(MX1、GART、UROD、GLRX3、MAPRE1、TBCB、HSPA4L、IGHM)进行了进一步的验证。将验证结果示于图12。除一部分预测模型以外，看到高的重现性。从预测精度和重现性的观点考虑，可以说MX1和GART的2变量模型最优异。应予说明，各预测模型与上述的式(1)同样地表示。例如，图12的最上段的辨别模型是p＝exp(﹣0.234+3.012MX1－2.852GART)/{1+exp(﹣0.234+3.012MX1－2.852GART)。

由以上的研究结果启示了以下内容。

·MX1和GART的重现性好，为优异的生物标记物。

·HSPA4L重现性也较好，利用价值高。

·用MX1和GART这两者辨别时可得到精度最高的结果。

产业上的可利用性

本发明的检查法能够高精度辨别精神分裂症。本发明的检查法作为用于判定精神分裂症是否发病的手段有用。另外，作为用于掌握将来发病的可能性的手段也有用。通过利用本发明的检查法的早期发现·早期治疗，可期待实现防止精神分裂症的难治化、病重化(病情发展)、复发等。

该发明不限于上述发明的实施方式和实施例的说明。只要不脱离专利申请请求保护的范围的记载，在本领域技术人员能够容易想到的范围内，各种变型方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等的内容通过援用其全部的内容而引用。

Claims (7)

1.一种精神分裂症标记物组，由干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、谷氧还蛋白-3、微管相关蛋白RP/EB家族成员1、以及微管蛋白折叠辅助因子B的组合构成。

2.一种精神分裂症标记物组，由干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1、三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3、尿卟啉原脱羧酶、以及谷氧还蛋白-3的组合构成。

3.一种精神分裂症标记物组，由干扰素诱导GTP结合蛋白质Mx1和三官能团嘌呤生物合成蛋白质腺苷-3的组合构成。

4.一种非诊断目的的检查法，包括以下步骤(1)～(2)：

(1)准备来自被检查者的检体的步骤；以及

(2)检测所述检体中的构成权利要求1～3中任一项所述的精神分裂症标记物组的各蛋白质分子的步骤。

5.根据权利要求4所述的检查法，其中，所述检体是血液、血浆、血清、口腔粘膜、鼻粘膜、皮肤、血液细胞、或者使从被检查者采集的血液淋巴细胞永生化而得的类淋巴母细胞。

6.一种精神分裂症检查试剂盒，包括用于检测构成权利要求1～3中任一项所述的精神分裂症标记物组的各蛋白质分子的试剂、以及操作说明。

7.根据权利要求6所述的精神分裂症检查试剂盒，其中，所述试剂分别由针对作为其靶标的蛋白质分子的抗体构成。