CN110618276A - 用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组及其应用 - Google Patents

用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组，包括FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5。采用本发明的分子标记物组进行睡眠剥夺引发型干眼，只需要取患者的泪液就可以检测，无痛又方便快速。采用本发明的分子标记物组进行检测，其样本取的是泪液，靠近眼表，更能反映眼部状态。采用本发明的分子标记物组进行检测的结果准确。

Description

用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组及其应用
技术领域
本发明属于干眼检测技术领域，具体涉及用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组及其应用。
背景技术
睡眠通常被定义为反应性、运动活动和新陈代谢降低的状态，通过快速可逆性区别于昏迷或麻醉[1]。睡眠可分为2个交替周期：快速眼动(REM)睡眠期和非快速眼动睡眠期(NREM)，每晚通常会发生5个周期。
关于人类需要睡眠的原因有很多理论，比如信息处理理论认为睡眠通过将饱和学习电路返回到基线水平来促进记忆的学习和存储[2]，修复理论认为身体在恢复和修复过程中睡觉，睡眠可以逆转醒着时发生的包括氧化损伤压力、能量储备耗尽、海马神经元死亡、以及受体下调损害。总之，睡眠对保持正常生活及身体健康是必须的。
睡眠是保持健康生活方式的基本要求，然而全世界有数百万人睡眠不足。仅在美国，三分之一的成年人睡眠不足。睡眠量要求因人而异，一般人大概需要7-8个小时。也有的人因为睡眠质量差，睡眠唤醒次数多，即使睡眠时间超过8小时，仍然睡眠不足。睡眠中断也可能由使用兴奋剂或健康问题引起，包括压力或与睡眠有关的疾病。
睡眠剥夺还会导致眼部健康问题。小鼠睡眠剥夺后，降低了泪液水分分泌，增加角膜上皮细胞缺陷、角膜敏感性和细胞凋亡，诱导角膜上皮细胞的鳞状化生，损害泪腺系统功能并导致干眼症。急性睡眠丧失通过神经和内分泌这两种途径影响生物体的眼表健康。眼表疾病的发生一般是指圆锥角膜眼表面的结构和功能失常，且通常伴有泪液的变化，干眼病(DED)是最常见的泪液相关的眼表疾病之一。
干眼是影响全球数百万人的眼表常见病症，不同人的严重程度不同。干眼的常见症状，包括眼睛干涩、眼痒、分泌物黏稠、怕风、畏光、对外界刺激很敏感；有时眼睛太干，基本泪液不足，反而刺激反射性泪液分泌，而造成常常流泪；较严重者眼睛会红肿、充血、角质化，这种损伤日久则可造成角结膜病变，影响视力，严重者甚至会失明。目前还无法根治干眼，只能通过滴加人工泪液等方式缓解干眼症状。
干眼是一种复杂的眼表疾病，致病因素非常多，干眼的症状也很多，不同人的症状不尽相同，目前还没有统一的判断标准，使得干眼的诊断及治疗困难。睡眠剥夺是干眼的成因之一，长期睡眠不足会导致干眼，但是现在还没有针对睡眠剥夺导致干眼的诊断手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组。
本发明的另一目的在于提供一种用于非诊断治疗目的的睡眠剥夺引发型干眼严重程度的检测方法。
本发明的技术方案如下：
用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组，其特征在于：包括FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5。
在本发明的一个优选实施方案中，由FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5组成。
本发明的另一技术方案如下：
一种用于非诊断治疗目的的睡眠剥夺引发型干眼严重程度的检测方法，包括如下步骤：
(1)收集被检测者的泪液，提取其中的蛋白；
(2)用蛋白质组学方法检测被检者的泪液蛋白中的FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5的含量，并与正常人的泪液蛋白中的FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5的含量相比对。
在本发明的一个优选实施方案中，所述收集的方法为采用包括schirmer试纸、毛细管和泪液采集器进行收集。
在本发明的一个优选实施方案中，所述蛋白质组学方法为非标记定量的蛋白质组学方法。
在本发明的一个优选实施方案中，所述蛋白质组学方法为标记定量的蛋白质组学方法。
本发明的有益效果是：
1、采用本发明的分子标记物组进行睡眠剥夺引发型干眼，只需要取患者的泪液就可以检测，无痛又方便快速。
2、采用本发明的分子标记物组进行检测，其样本取的是泪液，靠近眼表，更能反映眼部状态。
3、采用本发明的分子标记物组进行检测的结果准确。
附图说明
图1为本发明实施例1中睡眠剥夺后出现干眼症状的眼表综合分析结果图。
图2为本发明实施例1中分组情况、实验流程图及质谱的蛋白测定情况图。
图3为本发明实施例1中火山图及三次差异表达蛋白统计图。
图4为本发明实施例1中差异表达蛋白的热图。
图5为本发明实施例1中差异表达蛋白的基因本体论分析图。
图6为本发明实施例1中KEGG分析图，其中，A：差异蛋白的KEGG通路富集结果；B：PPAR pathway通路图。
图7为本发明实施例1中PPI蛋白相互作用分析图。
图8为本发明实施例1中考马斯亮蓝染色和westernblot结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1.1实验材料
1.1.1常用仪器
裂隙灯显微镜(SL990-5X) C.S.O.SRL意大利
眼表综合分析仪(keratograph 5M) Oculus公司
Lipiview脂质层分析仪 Tearscience公司
真空冷冻冻干机 SIM INTERNATIONAL GROUP
色谱仪 Waters公司
质谱仪 Thermo Fisher Scientific公司
1.1.2耗材试剂
1.2实验方法
1.2.1Schirmers test
(1)嘱受试志愿者坐于指定位置，保持头部水平
(2)分别是在其双眼下睑外1/3处置入schirmer试纸条，保证试纸条拆线以前置入受试者结膜囊内，其余部分就自睑裂悬挂在眼睑之外
(3)嘱受试者在5分钟内闭眼，保持试纸条在位
(4)5分钟后小心取下试纸条，标号并记录对应眼泪液分泌量，后置于离心管内，于准备好的冰盒中低温保存
(5)全部收集完毕后于-80冰箱保存试纸条，为下一步实验做准备
1.2.2泪河高度测定
(1)嘱受试志愿者正坐于眼表综合分析仪前，将下巴置于仪器托板上正确位置
(2)使用眼表综合分析仪分别对受试者双眼进行拍照
(3)使用眼表综合分析仪中泪河高度模块的测量工具，分别测量并记录受试者双眼的泪河高度
1.2.3泪膜破裂时间测定
(1)嘱受试志愿者正坐于眼表综合分析仪前，将下巴置于仪器托板上正确位置
(2)嘱受试者对应单侧眼凝视视野中心光斑，并按医嘱进行两次眨眼准备
(3)嘱受试者保持该眼睁大状态直至测量结束，此过程大约持续10-15s
(4)使用眼表综合分析仪记录受试者双眼的泪膜破裂时间数据
1.2.4Lipiview分析
(1)嘱受试志愿者正坐于Lipiview脂质层分析仪前，将下巴置于仪器托板上正确位置
(2)询问受试者是否可以清楚看到视野中心的黄色光源，随后调整仪器至受试者看清即开始进行测量
(3)嘱受试者对应单侧眼注视中心光源，期间按照医嘱保持平常的眨眼习惯，整个过程大约持续数秒
(4)使用Lipiview脂质层分析仪调节受试眼合适的位置，然后进行拍照和图像分析
(5)打印受试者结果并统计
1.2.5泪液蛋白沉淀
(1)将含有泪液的schirmerstrips分组后剪碎，浸没在1mL 8M urea，0.1M Tris-HCl pH 8.0中，振荡，4℃静置10小时
(2)4℃，12000g，离心10分钟，取上清液
(3)加入4倍体积的预冷丙酮，振荡，-20℃，静置60分钟
(4)4℃，13000g，离心10分钟，去上清液，此时沉淀即为收集到的蛋白
(5)加入8M urea，0.1M Tris-HCl pH8.0溶解沉淀
(6)用BCA试剂盒蛋白定量
1.2.6截留柱辅助的蛋白样品制备(FASP)
(1)装柱，在内柱和外柱上都做上标记
(2)将蛋白样品加到内柱中(需小于最大载样量)，加入200μL 8M urea，0.1MTris-HCl pH 8.0，混合后振荡1分钟
(3)20℃，14000g，离心40分钟，丢弃下方收集管中液体
(4)加入200μL 8M urea，0.1M Tris-HCl pH 8.0，混合后振荡1分钟
(5)20℃，14000g，离心40分钟，丢弃下方收集管中液体，重复一次
(6)加入200μL 50mM DTT，振荡1分钟，静置40分钟
(7)20℃，14000g，离心40分钟，丢弃下方收集管中液体
(8)加入200μL 40mM IAA，振荡1分钟，避光静置40分钟
(9)20℃，14000g，离心40分钟，丢弃下方收集管中液体
(10)加入200μL 50mM ABC，振荡1分钟，20℃，14000g，离心40分钟，丢弃下方收集管中液体
(11)重复两次
(12)更换新的外柱，加入胰酶(1∶50)，37℃水浴16小时
(13)20℃，14000g，离心20分钟
(14)加入50μL 50mM ABC，振荡1分钟，20℃，14000g，离心20分钟
(15)重复一次，收集管中离心得到的就是酶解好的肽段样品
1.2.7肽段除盐
(1)装柱，取合适大小的C4膜塞进200μL枪头中，称取C18填料(1∶50)装入枪头
(2)加入200μL乙腈，200g，离心2分钟活化
(3)加入150μL 0.1％甲酸，300g，离心3分钟平衡，重复两次
(4)将肽段样品的pH调至2-4，上样(不超过75μL)
(5)700rpm，离心15分钟
(6)加入150μL 0.1％甲酸，200g，离心6分钟，重复两次
(7)洗脱：加入75μL 40％乙腈，700rpm，离心15分钟；再加入75μL 60％乙腈，700rpm，离心15分钟，重复一次
(8)用speedVac离心干燥，30℃，离心1.5小时
(9)用20μL 0.5M TEAB再溶解肽段
(10)用肽段定量试剂盒定量肽段
1.2.8 iTraq标记
(1)取标记试剂，室温20分钟，使其达到室温
(2)离心将溶液都甩到管底，加入50μL异丙醇，混匀离心
(3)将准备好的标记试剂加入到准备好的肽段样品中，振荡混合后离心
(4)测pH是否在7-10之间，如果不是，用0.5MTEAB调节
(5)保持最终反应的样品中，有机相比例大于60％，若不足，补加异丙醇
(6)室温反应2小时，加入三倍反应溶液体积的0.1％甲酸，终止反应
(7)将样品离心甩到管底，汇集到一管中，振荡混匀，-80℃保存
1.2.9 High-pH分段样品制备
(1)配流动相，A相：pH 10的超纯水、B相：pH 10的90％乙腈，甲酸铵调节，抽滤流动相，再超声排气
(2)打开色谱仪及软件，先设好样品洗脱梯度
(3)50％A相冲洗柱子30分钟
(4)99％A相平衡3分钟后上样
(5)将制备的样品用EP管接好
(6)根据正交法将接出来的样品合并成10个
(7)样品在-80℃过夜，放入预冷好的冷冻干燥机中冻干
(8)加入20μL的2％乙腈溶解后每个样品送1μg
1.2.10质谱检测及搜库方法
(1)色谱仪：nanoscaleEASY-nLC 1200UHPLC system(Thermo FisherScientific)
(2)质谱：Orbitrap Fusion Lumos equipped with a nanoelectrospray source(Thermo Fisher Scientific)
(3)流动相：A：0.1％甲酸、B：80％乙腈，0.1％甲酸，流速300nL/min
色谱柱：RP-HPLC analytical column(75um×25cm)packed with 2um C18 beads(Thermo Fisher Scientific)
(4)梯度：7％至32％ACN，90min，线性增加至50％ACN，20min
(5)其他参数：喷雾电压2.2千伏，离子转移喷针温度为300℃，(350-1500m/z)范围的光谱以60,000的分辨率、4×105的AGC和50ms的最大注入时间采集
(6)使用具有Mascot搜索引擎(Matrix Science，London，UK；版本2.3.02)的Proteome Discoverer(PD，版本2.1)处理原始数据，根据SwissProt人类蛋白质组数据库搜索MS/MS谱
(9)搜索参数：前体质量耐受性为20ppm，片段质量耐受性为0.02Da，氧化(Met)(+15.9949Da)，iTRAQ8plex(Lys，Try)(304.205Da)和乙酰化(蛋白质N-末端)(+42.0106Da)作为可变修饰，氨甲酰甲基化(Cys)(+57.0215Da)，iTRAQ8plex(N-末端)(304.205Da)作为固定修饰，并且允许三个胰蛋白酶错过切割。仅考虑长度至少为6个氨基酸的肽段。
过滤肽段和蛋白质鉴定以控制错误发现率(FDR)＜1％，蛋白质鉴定需要至少一种独特的肽段。差异表达的蛋白质设定如下：变化倍数＞1.2表明上调(P＜0.05)，＜0.8表明下调(P＜0.05)
1.2.11生物信息学分析方法
(1)使用AmiGO 2和David6.7在线网站(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行基因本体分类
(2)KEGG通路数据库(http：//www.genome.jp/kegg/)
(3)STRING网站分析差异蛋白质相互作用(https：//string-db.org/)
1.2.12westernblot
(1)蛋白样品加入5X SDS，100℃，10分钟煮样，高速离心
(2)按照配方将SDS-PAGE胶配好后上样，加page ruler作为分子marker
(3)电泳槽中加入1XSDS running buffer后开始跑胶，80V，20分钟，120V，40分钟，150V，20分钟
(4)切一块PVDF膜，在甲醇中活化，将胶拆下后装成三明治结构的转膜夹，加入1Xtransfer buffer，260mA，90分钟
(5)将转好的膜放入用TBST配制的5％脱脂牛奶中室温封闭2小时
(6)切膜敷一抗，室温两小时或4℃过夜
(7)洗膜：加入1X TBST，摇床上摇晃10分钟，换液，重复三次
(8)敷二抗，室温两小时或4℃过夜
(9)洗膜：加入1X TBST，摇床上摇晃10分钟，换液，重复三次
(10)1∶1配好ECL液，加到膜上，暗室显影
实验结果
2.1睡眠剥夺后出现干眼症状
为了探究睡眠剥夺与干眼两者可能存在的关系，先初步探究睡眠剥夺后是否会产生干眼的症状。招募了9名志愿者组织24小时的急性睡眠剥夺试验，并在睡眠剥夺前后分别对志愿者进行相应的眼表综合检查。
检查项目包括schirmer’s测试、泪河高度测试、泪膜破裂时间测试、瞬目检测及泪膜脂质层分析。在眼表综合分析结果中，(A)schirmer’s测试睡眠剥夺后泪液明显减少，一般干眼的schirmer’s测试值小于5，显示睡眠剥夺后的泪液分泌量有所下降，接近干眼指标。(B)干眼患者的泪河高度一般小于0.2mm，测试结果显示，睡眠剥夺组的泪河高度明显低于正常组，且几乎达到干眼指标。泪膜破裂时间(TBUT)反映泪膜的稳定性，一般泪膜破裂时间小于10s是泪膜不稳定的判定指标。(C)中结果可以看出睡眠剥夺组的TBUT也有明显减少。在Lipiview脂质层分析结果中，(D)睡眠剥夺组的不完全瞬目次数减少，瞬目能使泪膜重新分布，不完全瞬目可以使泪膜得到补偿，瞬目异常，属于泪液动力学异常型干眼(E)表明睡眠剥夺组的泪膜平均脂质层厚度比起正常组有所增加。综合以上结果，睡眠剥夺会导致泪膜水液层的量减少，泪膜稳定性下降，且接近或符合干眼的指标，提示睡眠剥夺会导致正常人出现干眼的现象，长期睡眠剥夺可能会导致干眼。另外脂质层厚度的增加，初步猜测可能是眼部对于干眼现象出现产生的代偿反应，增加脂质层的厚度，减少泪液的过度蒸发，保持眼睛湿润。
图1中Control组为志愿者睡眠剥夺前分析数据，ASD组为24小时急性睡眠剥夺后分析数据。如图1所示，睡眠剥夺组的眼表情况明显差于正常组，并且睑板腺情况和正常组比起来也有明显差异，其中，(A)显示睡眠剥夺组的泪液分泌量有所下降，(B)显示睡眠剥夺组的泪河高度也低于正常组，(C)中可以看出睡眠剥夺组的TBUT也有明显减少。在Lipiview脂质层分析结果中，(D)可以得出睡眠剥夺组的不完全瞬目次数有所降低，而(E)表明睡眠剥夺组的泪膜平均脂质层厚度比起正常组有所增加。
2.2泪液样本质谱检测结果
既然眼表综合分析的结果提示，睡眠剥夺会导致正常人出现干眼的现象，那么睡眠剥夺后导致干眼的可能原因是什么呢？睡眠剥夺是否会引起泪液的蛋白成分变化呢？希望通过对泪液蛋白成分的变化分析得出睡眠剥夺导致干眼的可能原因。
于是收集了睡眠剥夺前后9个志愿者的泪液，三个为一组随机分成三组，将蛋白沉淀出来后酶解成肽段，分别用iTraq稳定同位素标记试剂标上113、114、115、116、117、118后进行二维纳米色谱串联质谱鉴定。实验流程如图2A所示，募集志愿者，收集24小时急性睡眠剥夺前后的泪液，将泪液蛋白提取处理成肽段分组标记，合并成一个样品再通过High-pHPRLC的方法进行样品的梯度洗脱分段，得到十个组分，都冻干之后质谱检测，搜库后用生物信息学方法分析数据，根据得到的数据炎症并寻找可能的分子标志物。
质谱鉴定情况如图2B所示，通过质谱检测到的总谱图，利用的谱图数、特异谱图数、肽段数、特异肽段数、蛋白数，共得到1791个蛋白。
2.3三次生物学重复情况
为了证明数据的可靠性，进行了三组生物学重复，即三组泪液样本分别用不同的iTraq八标同位素标记试剂的其中六标，标记三组睡眠剥夺前后即三次生物学重复样本的共六组样本，标记结束后合并成一个样本进行后续的实验。三组重复的情况如图3中的火山图及柱状图所示。火山图中X轴是蛋白质差异倍数(取log2)，Y轴是相应的Q值(取-log10)。Q值＜0.05且倍数变化foldchange＞1.2或foldchange＜0.8是筛选显著差异蛋白的条件。在该图中，红点是显著上调的蛋白质，绿点是显著下调的蛋白质，灰点是无显著变化的蛋白质。柱状图中红色的表示上调的蛋白数目，绿色的表示下调的蛋白数目。那么根据三次的火山图已经分别上下调蛋白数目的统计图可以看出，三次重复实验情况良好，数据具有较好的重复性和可靠性。
2.4差异表达蛋白
根据Q值＜0.05且倍数变化foldchange＞1.2或foldchange＜0.8的筛选显著差异蛋白的条件，睡眠剥夺后共得到了142个差异表达蛋白，其中Q值＜0.05且倍数变化foldchange＞1.2的上调蛋白有77个；Q值＜0.05且倍数变化foldchange＜0.8的下调蛋白有65个。具体是哪些蛋白发生了变化如图4的热图所示，热图可以更直观的看到这些蛋白的差异变化情况，根据这些蛋白的三次差异倍数，也可以说明三次数据具有良好的重复性。
2.5基因本体论分析(Gene Ontology)
既然知道了睡眠剥夺后哪些蛋白发生了变化，那么到底这些变化的蛋白参与了哪些生物学过程，主要都有什么功能呢？进行了后续的生物信息学分析。首先进行的是基因本体论分析。GO分析分为三部分，分别是分子功能(molecularfunction)、生物过程(biologicalprocess)、细胞组分(cellularcomponent)。
如图5所示，从GO分析的结果可以看到，这些差异表达的蛋白在细胞中主要起到连接、催化活性、分子功能调节剂、结构分子等分子功能，细胞过程、生物调节、代谢过程、生物过程调节等生物过程，值得注意的是其中有部分差异表达蛋白参与了机体的免疫过程，提示可能睡眠剥夺之后，机体的免疫会发生变化或调节。另外细胞组分中主要为细胞器、细胞部分、细胞外区域等，由于样本取自泪液，其中部分蛋白在细胞外区域起主要作用也符合。由于GO分析的结果还是不够直观得了解得到差异蛋白参与的功能，利用The Database forAnnotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID)网站进一步进行分析。DAVID提供了一套全面的功能注释工具，供研究人员了解大量基因背后的生物学意义。对于任何给定的基因列表，DAVID工具能够发现丰富的功能相关基因组、群集冗余注释术语等，可以更好的分析GO术语。将得到的差异蛋白分析后得到冗余注释术语群集(表1)。在Cluster1和3中可以看到，大部分差异表达蛋白属于分泌型蛋白，且在细胞外区域，这非常符合泪液蛋白的特点。在Cluster2和4中，发现这些差异表达蛋白主要参与对伤害的反应(具体蛋白情况见表2)和炎症反应，提示睡眠剥夺后，机体产生了炎症反应。Cluster5中富集到的是脂质蛋白和其相关蛋白，说明睡眠剥夺后脂质反应发生了变化。另外在Cluster 8中发现很多与免疫相关的蛋白发生调节，这与GO分析中细胞组分中免疫过程这一结果一致，说明睡眠剥夺会影响机体的免疫功能。
表1.DAVID群集冗余注释
表2.创伤反应及对应的蛋白变化情况
这些差异变化的蛋白中，属于分泌型的蛋白有IGHG2、IGHG3、S100A8、FGG、APOA2、APOA1、FGA、FGB、LCN2、LCN1、ORM1、IGHV3-7等，炎症反应对应的具体变化的蛋白有APOA2、FABP5、S100A8、PRDX2、C8G、CD14等，参与免疫的有：IGHG2、FGA、FGB、IGHV3-7、IGHG3、IGHA1、IGKV4-1、IGKC、IGLC2等，参与脂质代谢的蛋白APOA2、APOA1、LCN1、LCN2等。根据GO分析，知道急性睡眠丧失可促进创伤、急性炎症和免疫反应，还会影响脂质代谢。
2.6KEGG通路分析
知道了哪些蛋白发生变化的信息还不够，因为蛋白在体内通过蛋白与蛋白之间的相互作用，参与一个个不同的通路，起到传递信息、调节机体的作用，那么就需要具体知道这些差异表达的蛋白是参与到哪些通路中起到什么作用的。继续分析，如图6A KEGG通路分析图所示，发现差异表达蛋白被富集到了补体和凝血级联、IL-17信号通路、PPAR通路、糖类脂质代谢通路等，此外还发现了NF-κB信号通路、TRP通道的炎症介质调节、PI3K-Akt信号通路、昼夜夹带等。其中补体和凝血级联是免疫相关通路，IL-17信号通路、NF-κB信号通路、TRP通道的炎症介质调节等与炎症、免疫相关，这些通路和前面GO分析得到的蛋白参与免疫、炎症、脂质代谢的结果也是一致的。
其中PPAR通路包括PPARα/PPARβ/PPARγ通路，KEGG通路图6B中可以看到，APOA1、APOA2、FABP5蛋白发生了上调，PPARα通路上调。其中APOA1、A2是载脂蛋白，可以参与组织与细胞间的脂质运输与重分配，促进脂质代谢。此外，甘油磷脂代谢、鞘脂代谢通路也发生了上调。
2.7相互作用蛋白分析
如图7所示，在蛋白互作分析的结果中可以看到蛋白之间的相互作用，STRING蛋白互作网站上的结果显示，中间区域有一部分蛋白相互作用非常紧密，如FGA、FGB、ORM1、APOA1、APOA2等蛋白，基本也都是参与免疫、炎症、脂质运输三者相关的蛋白。
2.8western验证寻找的分子标记物
综合以上分析结果，那么已经可以解决开始提出的问题：睡眠剥夺是否会引起泪液的蛋白成分变化？睡眠剥夺后导致干眼的可能原因能否通过对泪液蛋白成分的变化分析得出？急性睡眠剥夺后泪液中的蛋白成分确实发生了变化，其中免疫、炎症、脂质运输相关蛋白发生了改变，而其中炎症是干眼的成因之一，也就是说睡眠剥夺导致干眼出现的原因可能就是因为睡眠剥夺之后造成了眼部的炎症反应，从而促进了干眼现象的发生。
最后，为了证明通过蛋白质组学得到结果的可靠性，用传统的westernblot方法验证蛋白的变化。
选取了五个和免疫、炎症、脂质运输相关的且相互作用网络图中比较重要的蛋白，分别是FGA、FGB、APOA1、APOA2、FABP5作为分子标记物进行验证。FGA被蛋白酶凝血酶切割，得到单体，可以与纤维蛋白原β(FGB)和纤维蛋白原γ(FGG)一起聚合形成不溶性纤维蛋白基质，具有止血功能。在伤口修复的早期阶段起作用以稳定病变并在再上皮化期间引导细胞迁移，也可通过先天和T细胞介导的途径促进免疫应答。FGB也可通过先天性和T细胞介导的途径促进抗菌免疫应答。APOA1通过促进胆固醇从组织中流出并作为卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的辅助因子，参与胆固醇从组织向肝脏的逆向转运。APOA2可通过与脂质结合稳定HDL(高密度脂蛋白)结构，并影响HDL代谢。FABP5用于长链脂肪酸的细胞内载体和相关的活性脂质，调节它们结合的配体的代谢和作用，选择性地将特定脂肪酸从细胞质递送至细胞核，在炎症期间通过NF-κB活化和前列腺素E2(PGE2)生物合成调节PTGES诱导来调节炎症。
于是将先前24小时急性睡眠剥夺前后取的泪液中提取出的蛋白，按照之前的分组情况按照蛋白总量1∶1∶1混合样品，同样分成三个睡眠剥夺前组，三个对应的睡眠剥夺后组，每个组都分别取5μg蛋白上样，跑SDS-PAGE胶后考马斯亮蓝染色，结果如图8所示，蛋白总量基本是一致的，在这个基础上分别载上样5μg，westernblot标记目标蛋白，得到图8的结果。可以明显的看到在睡眠剥夺后，FGA、FGB、APOA1、APOA2有增加，FABP5也有一定程度的增加。一方面验证了蛋白质组学结果的可靠性，另一方面也证明了这几个蛋白可以作为判断睡眠剥夺的分子标记物。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (6)

1.用于检测睡眠剥夺引发型干眼的分子标记物组，其特征在于：包括FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5。
2.如权利要求1所述的分子标记物组，其特征在于：由FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5组成。
3.一种用于非诊断治疗目的的睡眠剥夺引发型干眼严重程度的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)收集被检测者的泪液，提取其中的蛋白；
(2)用蛋白质组学方法检测被检者的泪液蛋白中的FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5的含量，并与正常人的泪液蛋白中的FGA、FGB、APOA1、APOA2和FABP5的含量相比对。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述收集的方法为采用包括schirmer试纸、毛细管和泪液采集器进行收集。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述蛋白质组学方法为非标记定量的蛋白质组学方法。
6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述蛋白质组学方法为标记定量的蛋白质组学方法。
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