CN104703620A

CN104703620A - 诊断和治疗方法

Info

Publication number: CN104703620A
Application number: CN201380049135.0A
Authority: CN
Inventors: B·S·帕克; P·J·赫佐格
Original assignee: La Trobe University
Current assignee: La Trobe University
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2015-06-10
Also published as: US10441636B2; AU2018203670A1; EP2874647A4; US20150174205A1; CA2879427A1; EP2874647B1; JP2015524397A; AU2013293049A1; WO2014012147A1; AU2020200253A1; EP2874647A1

Abstract

本发明通常涉及一种诊断、预测或监测转移癌(特别是骨转移癌)发展或进展的方法。更具体地，本发明的方法提供了一种通过筛选包含IRF7结合位点的一组基因的差异表达来检测转移癌或其发展倾向的方法。在相关方面，本发明提供了一种治疗性或预防性治疗转移癌(特别是骨转移癌)的方法。更具体地，本发明提供了一种通过上调I型IFN水平来治疗性或预防性治疗转移癌的方法。

Description

诊断和治疗方法

技术领域

发明背景

在说明书中对任何在先出版物(或由此得到的资料)或任何已知事物的参考不作为并且不应被看作承认或认可或者以任何形式提示在先出版物(或由此得到的资料)或任何已知事物形成本说明书涉及的领域中的公知普通常识的一部分。

关于本说明书中作者的发表物详细书目按字母顺序附于说明书结尾。

肿瘤是由较高水平的组织自主生长所产生的异常细胞集落或团块。许多肿瘤由已进行肿瘤转化的单细胞克隆扩张生成。改变细胞基因组的化学、物理或生物试剂(或事件)可导致正常细胞至肿瘤细胞的转化。肿瘤细胞的特征是缺失一些特定功能和获取新生物学特性(最主要是较高水平自主生长的特性)。它们将其可遗传的生物学特性遗传给子代细胞。肿瘤可出现在含有能够进行有丝分裂的细胞的几乎所有组织中。

肿瘤的过去、现在和未来预测的生物学行为和临床过程被进一步分为良性或恶性，这一区分在诊断、治疗和预后中至关重要。恶性肿瘤表现为较高程度的自主性，能够侵入并转移性扩散，可抵抗治疗并可导致死亡。然而，良性肿瘤表现出较低程度的自主性，通常不是侵入性的且不转移。在西方国家，癌症是仅次于心脏病的第二大死亡原因。例如，预测美国的癌症发生率是每年约1x10⁶个新病例。所有恶性肿瘤中的几乎80％出现在10个解剖学位点，即肺、乳腺、结肠和直肠、前列腺、淋巴结、子宫、膀胱、胰腺、血液和胃。

转移性肿瘤在癌症晚期时非常常见。转移癌的扩散可以经由血液、淋巴液或同时通过上述两者，最常见的发生转移的位置是淋巴结、肺、肝、大脑和骨。

对于某些肿瘤而言，其倾向于感染特定器官。Stephen Paget在一个世纪以前的1889年首次讨论了该现象并提出“种子和土壤”理论。例如，前列腺癌通常转移至骨。类似地，结肠癌倾向于转移至肝，而在女性中胃癌通常转移至卵巢。根据“种子和土壤”理论，癌细胞难以在其起源区域外存活，因此为进行转移，其必须找到具有类似特征的位置。例如，从乳汁中摄取钙离子的乳腺癌细胞转移至骨组织，此时其从骨中摄取钙离子。恶性黑素瘤扩散至大脑，可能是因为神经组织和黑素细胞起源于胚胎中相同细胞系。

转移涉及复杂的一系列步骤，其中癌细胞离开初始肿瘤位点并经由血液或淋巴系统迁移至身体的其他部位。为此，恶性细胞脱离原发肿瘤并粘附和降解构成周围胞外基质的蛋白，这种基质将肿瘤与周边组织分开。通过降解这些蛋白，癌细胞能够破坏胞外基质并逸出。

身体通过各种机制通过被称为转移抑制因子的一类蛋白的作用来阻止转移，目前已知十几种这类蛋白。还已经证明，所需的关键事件之一是新的血管网络的生长，即肿瘤血管生成。许多研究因此关注使用血管生成抑制剂来阻止转移。虽然有这些发现，但转移性癌症的有效治疗仍然难以实现且仍主要依赖于使用非常非特异性且高毒性的基于化疗的方法。

同样难以实现的是建立一种转移性癌症的早期诊断方法。当转移性癌症在同时被发现作为原发肿瘤时(这通常在手术中)，由于疾病已发展至晚期，患者的预后通常不良。然而，在患有晚期但非转移的原发肿瘤或转移刚开始的患者中，由于目前诊断技术所限，转移性癌症的确认几乎是不可能的。在这些患者中，会移除原发肿瘤，然后对患者进行全疗程的化疗以期望这能够有效地杀死任何存在的转移性肿瘤。然而，在没有积极确定任何这类肿瘤的前提下，难以评估是否需要这类治疗方案。另一个复杂的因素是并非所有原发肿瘤都会转移，并且仅基于组织学分析几乎不可能预测肿瘤是否会发生转移。在其他情况下，对于可能存在的转移，可能没有提供化疗，而如果转移确实存在，结果是最终没有对其进行鉴定直至其发展至无法进行有效治疗的晚期。

为此，非常需要开发精确确定原发肿瘤变为转移性的可能性的方法。目前的基于组织学的原发肿瘤分析具有高度主观性且并非那么精确。因此，非常需要研发出可靠且常规地对于具有原发肿瘤的患者进行评估以确定转移性癌症发生的可能性的方法。

在启发本发明的工作中，鉴定到了一种分子标签，如果其存在于原发肿瘤中，则其是肿瘤转移倾向的特征。具体而言，相对于非转移性肿瘤，肿瘤中包含IRF7结合位点的基因表达水平的下调显示存在转移性表型。因此，该发现提供了一种灵敏且可靠的方法来鉴定肿瘤是否或可能转移。与肿瘤的分类相联系，该信息能够显示适用于患者的治疗性治疗和正在进行的监测的开发。

此外，该发现还促进了研发治疗性或预防性治疗转移性癌症的方法，该方法基于在经诊断患有原发肿瘤并表型出对象基因签名表达水平下降的患者中上调I型干扰素水平。

发明内容

整篇说明书和之后的权利要求书中，除非上下文需要另外说明，术语“包括”或其变体如“包含”和“含有”应理解为指示包括所述整体或步骤或者整体或步骤组但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤组。

本文所用术语“来源于”指源自特定物种的特定整体或整体组，但不必直接获自特定来源。此外，如本文中所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。

本发明的一个方面提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测一个或多个基因在所述肿瘤中的表达水平，这类基因在其启动子中包含IRF7结合位点，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

在另一个方面，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测表1中的一个或多个基因在所述肿瘤中的表达水平，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

在一个相关方面，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测所述肿瘤中IRF7、IRF9或STAT1的功能水平，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述IRF7、IRF9或STAT1功能水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

在另一个方面，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测表1中的一个或多个基因在所述肿瘤中的表达水平，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移表型，且所述转移是骨转移。

在其他方面，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测所述肿瘤中IRF7、IRF9或STAT1的功能水平，其中，所述IRF7、IRF9或STAT1功能水平的下降表示所述肿瘤的转移表型，且所述转移是骨转移。

在一个实施方式中，所述肿瘤是乳腺、结肠、肾、肺、皮肤、卵巢、胰腺、前列腺、结肠、胃、甲状腺或子宫的肿瘤。

在其他实施方式中，所述筛选涉及至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少60个基因、至少70个基因、至少80个基因、至少90个基因、至少100个基因、至少110个基因、至少120个基因、至少130个基因、至少140个基因、至少150个基因、至少160个基因、至少170个基因、至少180个基因、至少190个基因、至少200个基因或至少208个基因。

在另一个实施方式中，所述筛选涉及一个或多个选自表2的基因。

本发明的其他方面涉及一种治疗个体中转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

本发明的另一个方面更具体地涉及一种治疗个体中乳腺、肾或前列腺转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

在另一个方面，提供了一种治疗转移性癌症的方法，在个体中，所述转移存在于骨中且所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

在一个实施方式中，提供了一种治疗患者中转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述患者中I型IFN-α水平的试剂。

在另一个实施方式中，提供了一种治疗个体中转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN-β水平的试剂。

在一个相关方面，提供了上调I型IFN水平的试剂在制造药物中的应用，所述药物用于治疗个体中的转移性癌症，所述癌症的特征是异常的IRF7功能。

附图说明

图1：乳腺癌起源的骨转移癌下调了干扰素途径和其他免疫基因。使用欧几里德距离(Euclidean distance)和质心连接规则(centroid linkage rule)进行分层聚类生成的热图。彩色的比例尺代表倍数变化Log ₂。灰色的比例尺代表“方法”中所述的CLOVER富集评分。在受抑制基因和INTERFEROME基因的交叉中，IRF7被鉴定为显著的调节因子。

图2：转录因子IRF7的表达在骨转移癌中受抑制。(a)分离自4T1.2原发肿瘤和脊椎转移癌的mRNA中IRF7表达的实时RT-PCR分析(误差线表示SEM，n＝4)。IRF转录本丰度是相对于GAPDH。(b)取自携带4T1.2肿瘤的Balb/c小鼠(原发肿瘤、肺转移癌和脊椎转移癌)和对照小鼠(正常脊椎)的组织切片的免疫组化染色。使用用于显示形态的苏木精和伊红(H&E)(顶部)、IRF7特异性抗体(α-IRF7)、免疫前兔Ig对照、IRF9特异性抗体(α-IRF9)或大鼠IgG对照对系列切片进行染色。T＝肿瘤，N＝正常肺上皮细胞，O＝骨细胞。比例尺＝50μm。虚线代表肿瘤边界。

图3：IRF7表达的恢复增强了IFN信号转导并抑制转移癌。(a)4T1.2-BV和4T1.2-IRF7细胞的体外增殖试验。n＝6，误差线表示S.E.M.。(b)进行或不进行聚(I:C)刺激的情况下，来自4T1.2-BV或4T1.2-IRF7细胞的条件培养基的IFN-α的ELISA，n＝6。(c)将4T1.2-BV或4T1.2-IRF7细胞接种至同系、有免疫力的Balb/c小鼠乳腺后的肿瘤体积。(d)4T1.2-BV和4T1.2-IRF7瘤荷小鼠的脊椎中转移性瘤荷的Q-PCR检测(终点，d 32)。(e)来自携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的有免疫力的Balb/c小鼠脊椎的H&E染色切片(误差线＝50μm，T＝肿瘤，虚线代表肿瘤边界)。(f)将4T1.2-BV和4T1.2-IRF7肿瘤细胞接种至个数匹配(litter-matched)的Ifnar1^–/–和野生型小鼠乳腺后的肿瘤体积。(g)当携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的小鼠的原发肿瘤达到500mm³时，将其切除并分析无病存活率。进行对数秩检验。4T1.2-BV Ifnar1^+/+对比4T1.2-IRF7Ifnar1^+/+(*P＝0.0123)；4T1.2-BV Ifnar1^–/–对比4T1.2-IRF7Ifnar1^–/–(ns P＝0.4317)；4T1.2IRF7Ifnar1^+/+对比4T1.2IRF7Ifnar1^–/–(***P＝0.0002)；4T1.2BV Ifnar1^+/+对比4T1.2BV Ifnar1^–/–(**P＝0.0067)。4T1.2-BV Ifnar1^+/+(n＝12)；4T1.2-IRF7Ifnar1^+/+(n＝13)；4T1.2-BV Ifnar1^–/–(n＝16)；4T1.2-IRF7Ifnar1^–/–(n＝16)。(h)来自携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的Ifnar1^–/–小鼠脊椎的H&E染色切片(误差线＝50μm，T＝肿瘤，虚线代表肿瘤边界)。

图4：转移性肿瘤细胞对免疫系统的调节和通过增强I型IFN途径表达对这些作用的逆转。(a)有免疫力的Balb/c背景(*P＝0.03，n＝15，复制自图3g以用于比较)或免疫力低下的NSG背景(****P＝ns，n＝15)下携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的小鼠的无病存活率。(b)来自携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的NSG小鼠脊椎的H&E染色切片(误差线＝50μm，在右图中放大)。(c)不携带肿瘤(原始)或携带66cl4、4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤(n＝3)的Balb/c小鼠外周血中MDSC随时间的累积。(d)使用抗CD3/CD28抗体激活CFSE标记的原始Balb/c脾细胞并将其与或不与来源于4T1.2-BV肿瘤携带小鼠的CD11b⁺Ly6G⁺MDSC共同培养(比例1:1)。通过流式细胞术测量72h时总脾细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞增殖。进行双尾斯氏t检验并比较7个重复样品的脾细胞±MDSC之间CFSE的平均荧光强度(MFI)。总脾细胞***p＝0.0006；CD8⁺T细胞**P＝0.0021和CD4⁺T细胞**P＝0.0021。(e)5天前使用4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤接种的小鼠外周血中CD4⁺T细胞(CD4⁺TCRβ⁺)、CD8⁺T细胞(CD8⁺TCRβ⁺)和NK细胞(DX5⁺TCRβ^-)数目。(f)消耗了CD8细胞(抗CD8抗体，克隆53-6.7)、NK细胞(抗唾液酸基GM1)或上述两种群体的4T1.2-IRF7肿瘤携带小鼠的肿瘤体积。(g)消耗了CD8细胞、NK细胞或上述两种群体的小鼠的无病存活率。无消耗(n＝14)，CD8消耗(n＝11)，NK细胞消耗(n＝7)，NK+CD8细胞消耗(n＝11)。使用对数秩检验分析各组之间的存活率。无消耗对比NK+CD8消耗(**P＝0.0014)；无消耗对比NK(ns,P＝0.4382)；无消耗对比CD8(ns,P＝0.0795)；NK对比CD8(ns,P＝0.1294)；NK+CD8细胞消耗对比CD8(*P＝0.0114)；NK+CD8细胞消耗对比NK(**P＝0.0047)。

图5：人乳腺癌转移癌中的IRF7表达。(a)未匹配的原发乳腺肿瘤和骨转移癌以及正常骨样品针对IRF7、Ig对照和H&E的染色(如图所示)。箭头表示骨细胞染色。比例尺＝50μm。(b)原发乳腺肿瘤和匹配的骨转移物针对IRF7、Ig对照和H&E的染色。还显示了来自缩胸乳房成形术的正常乳房上皮细胞以用于比较。比例尺＝50μm。(c)通过人乳腺癌中基因表达所测量的IRF7通路活性以及与作为远端复发第一位点的骨转移癌的显著关联。卡普兰-迈耶曲线上的Y轴表示“骨无复发存活率”，X轴是以月为单位的时间。紫色、黑色和蓝色分别代表IRF7基因签名表达的最高、中间和最低三分位。跨这三层计算对数秩p值。(d)IRF7基因签名与非骨复发(大脑、肝、肺)没有显著关联。

图6：I型IFN治疗转移癌的效果。(a)使用1000IU/mL重组IFN-α₁治疗的4T1.2细胞的实时RT-PCR分析。(n＝3，*p<0.05，误差线是S.E.M.)。(b)使用1000IU/mL重组IFN-α₁治疗的4T1.2细胞的增殖。(n＝6，误差线是S.E.M.)。(c)原发肿瘤体积，n＝15。(d)使用IFN_α1或载剂治疗的小鼠脊椎中转移性4T1.2瘤荷的Q-PCR检测(肿瘤细胞接种后第33天)。(e)来自使用IFN_α1或载剂治疗的4T1.2携带小鼠的脊椎和股骨的H&E染色切片(误差线＝50μm，T＝肿瘤)。(f)携带随后切除的4T1.2肿瘤的小鼠的卡普兰-迈耶无病存活率分析。从第3天开始使用10⁵IU的重组IFN-α1或盐水治疗小鼠(n＝15)。

图7：显示了在一组干扰素调节的转移癌抑制基因的推定启动子区域(-1,500bp-200bp)中TRANSFAC匹配预测的IRF/IRF7、ISRE和IRF2位点。

图8：应用于鉴定和显示来自受抑制基因列表的干扰素签名富集和IRF启动子结合位点的启动子分析框架。使用干扰素组(Interferome)数据库鉴定I型IFN签名。在提取自Ensembl v59并使用CLOVER算法和TRANSFAC数据库分析的序列上进行启动子分析。使用干扰素组界面(Interferome interface)实现可视化。

图9：获自用于IRF7和STAT1的DNA甲基化分析的MS-HRM实验的Tm图(高分辨率解链曲线的负一阶导数)。通过应用分析软件中可用的光数字过滤器(light digital filter)使Tm曲线部分光滑。未甲基化和完全甲基化的对照DNA的曲线分别显示为绿色和红色。此后，还显示了50％(蓝绿色粗点曲线)和10％(灰色粗点曲线)的DNA甲基化标准。黑色曲线对应于正常组织样品841/07，而蓝色曲线对应于脊椎转移癌2,375.07。对于所有分析的区域，正常组织和所有肿瘤样品都是未甲基化的。为清楚起见，仅显示了样品2375/07作为代表性肿瘤样品。a)跨IRF7的外显子1的CpG富集区的Tm图(区域1)。b)与IRF7的内含子1/外显子2边界相连的CpG岛的Tm图(区域2)。c)与IRF7的内含子1/外显子2边界相连的CpG岛的Tm图(区域3)。d)STAT1的启动子区域的Tm图。

图10：增强的IRF7表达恢复了I型IFN通路的表达。a.亲代细胞(4T1.2)或表达基载体构建体(BV)或IRF7表达构建体(IRF7)的细胞中的IRF7表达。各组中含有5个个体克隆。b.在同种型对照抗体或IFNAR1封闭抗体存在的情况下，BV细胞或表达IRF7的细胞中IRF9和STAT1的表达。c.来自携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的小鼠的原发肿瘤切片对IRF9的染色。比例尺＝50μm。

图11：4T1.2细胞中增强的IRF7表达恢复了IRF7签名。代表4T1.2BV和4T1.2-IRF7细胞之间差异表达基因(倍数变化>2，P<0.05)的表达值的热图对基因表达值进行分层聚类。相对于基载体对照，红色代表诱导而蓝色代表表达下降。

图12：携带转移性乳腺肿瘤的有免疫力的Balb/c小鼠中血液表型的变化。携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的有免疫力小鼠中的脾重量(a)和WBC计数(b)。(n＝14，P<0.01)。

图13：4T1.2原发肿瘤和转移癌的Gr1表达。4T1.2-BV原发肿瘤、肺转移癌和脊椎转移癌以及4T1.2-IRF7原发肿瘤样品针对Gr1和兔IgG进行染色(如图所示)。箭头表示Gr1阳性细胞。比例尺＝50μm。

图14：肿瘤携带小鼠中CD11b⁺Ly6G⁺细胞的测量。原始小鼠或携带4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的小鼠外周血中CD11b⁺Ly6G⁺群体的流式细胞图的代表性图象。

图15：肿瘤携带的有免疫力小鼠中的G-CSF生产。(a)原发肿瘤中的G-CSFmRNA表达(n＝5，*P<0.05)。(b)携带66c14、4T1.2-BV或4T1.2-IRF7肿瘤的小鼠或原始小鼠的原发肿瘤裂解物(n＝3)或血浆(n＝12)中的G-CSF水平(⁺⁺P<0.05)。

图16：消耗了NK细胞和CD8⁺T细胞的小鼠中骨转移癌的组织病理学图像。对来自携带4T1.2-IRF7肿瘤和消耗了NK和或CD8⁺T细胞的小鼠脊椎和股骨的切片进行H&E染色以显示转移癌。虚线表示肿瘤区域。T＝肿瘤。

图17：携带4T1.2肿瘤的小鼠中肺转移癌的定量。4T1.2-BV和4T1.2-IRF7瘤荷小鼠(终点，第32天)或使用盐水或IFNα1治疗的4T1.2-BV小鼠(终点，第33天)的脊椎中转移性瘤荷的Q-PCR检测。

图18：使用IFNα1治疗的4T1.2肿瘤携带小鼠血液中MDSC和G-CSF的测量。使用IFNα1或盐水对照在将4T1.2肿瘤细胞接种至乳腺一天后治疗小鼠。肿瘤接种五天后，测量了MDSC百分比(a)和绝对数(b)，并通过ELISA测量了G-CSF水平(c)。

图19：乳腺、肺和骨中免疫细胞的变化。a)使用IFN-α1或盐水对照在将4T1.2肿瘤细胞接种至乳腺后第1、3和5天时治疗小鼠。在肿瘤接种后十天，在脂肪垫/原发肿瘤、肺和骨髓中测量MDSC、NK、CD4⁺和CD8⁺T细胞百分比。N＝5。使用非配对T检验评估各治疗组之间的差别并显示了显著性。b)分离自原始Balb/c小鼠的乳腺、肺和骨髓的细胞针对DX5、TCR、CD11b和CD27进行染色。显示了门选的DX5⁺TCR上CD11b和CD27表达的代表性概况。显示了CD11b^低/高和/或CD27^低/高的百分比。

图20：使用IFN激动剂聚I:C的治疗抑制了转移。使用25ug的聚I:C通过尾静脉注射治疗携带4T1.2细胞的小鼠，从第3天开始每周治疗3次。(a)手术切除前4T1.2原发瘤荷的生物发光图像。(b)使用载剂或聚I:C治疗的小鼠中转移性瘤荷的生物发光图像。(c)第33天时小鼠的股骨、脊椎和肺中4T1.2瘤荷的Q-PCR检测。

图21：聚I:C和阿霉素的组合在早期治疗环境下减少了转移。将4T1.2细胞接种至Balb/c小鼠的第4个乳腺。在原发肿瘤达到0.2g时将其切除并在2天后开始为期2周的治疗。使用单独的载剂、每2天25ug聚I:C、每4天4mg/kg阿霉素或聚I:C和阿霉素的组合治疗小鼠。使用生物发光成像在设置的时间点观察所有小鼠中的转移性瘤荷。

图22：在弱(4T1)和非转移性(66cl4)乳腺癌模型中，使用Ifnar1缺陷的小鼠封闭I型IFN信号传导增强了骨转移。(a)4T1和66cl4肿瘤的原发肿瘤生长。(b)携带4T1肿瘤的小鼠中的转移性瘤荷(第32天，不切除)。(c)携带66c14肿瘤的小鼠中的转移瘤荷(切除后第21天)。RTB，相对瘤荷。(d)终点处携带4T1和66c14肿瘤的小鼠股骨的代表性H&E染色切片。比例尺，50μm。T代表肿瘤区域。

发明详述

本发明部分在测定结果的基础上发现，肿瘤中IRF7基因功能的缺失诱导了向转移性表型的转变，并且该功能缺失可常规地通过肿瘤中是否存在特定基因签名来鉴定，该签名是在其启动子中包含IRF7结合位点的一个或多个基因的表达水平的下调。该发现不仅促进了研发用于筛选肿瘤以确定其转移倾向性的方法，还导致了研发治疗性或预防性治疗表现出转移性表型的原发肿瘤患者的方法，所述方法基于上调患者中I型IFN水平。

因此，在本发明的一个方面中，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测一个或多个基因在所述肿瘤中的表达水平，所述基因在其启动子中包含IRF7结合位点，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

更具体地，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测表1中的一个或多个基因在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

本文中使用术语“肿瘤”来描述细胞或组织的异常质量或生长，其特征是不受控制的细胞分裂。肿瘤可以是良性(非癌性)或恶性(癌性)。可通过临床筛选或诊断方法来鉴定、监测或评估肿瘤，包括但不限于触诊、活组织检查、细胞增殖指数、内窥镜、乳房造影、数码乳房造影、超声波检查、计算机断层成像(CT)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影(PET)、射线照相、放射性核素评价、CT或MRI指导的抽吸细胞学检查和成像指导的针吸活检等。这类诊断技术是本领域技术人员熟知的。

更具体地，所述肿瘤是原发肿瘤。

肿瘤的“转移性表型”应理解为对象肿瘤的细胞从最初的器官或组织扩散至另一器官或组织的能力，通常经由淋巴或血液循环。还应理解，虽然对象细胞表现出转移性表型，但实际上其可能已转移或没有转移至携带肿瘤的患者中的另一器官。为此，本发明的方法将不仅检测检测晚期转移是否存在，还更重要地检测非常早期的转移(此时转移癌的数目少且尺寸小，因此难以通过目前使用的方法检测)或原发肿瘤已转变为转移性表型但其细胞还未实际转移至另一器官时(这可能反映较短的时间)。在不将本发明限制于任意一个作用模式或理论的情况下，IRF7功能的下调被理解为触发了向转移性表型的转变。因此，这发生在肿瘤细胞进入循环并接种至其他器官之前。通过鉴定处于转移性疾病的非常早期或将要经历远端器官转移性接种的患者，提供了进行比不可鉴定转移性表型时被认为必要的治疗性介入更适当治疗性介入的可能性。为此，转移“状态”应理解为至对肿瘤进行评估以确定其是否具有转移性表型。

在不以任何方式限制本发明的情况下，在一个实施方式中，已证明对象方法在检测肿瘤的转移性表型方面特别有效，该肿瘤显示具有转移至骨的倾向。由于骨转移癌通常被认为特别具有侵袭性且难以治疗，所以该发现极具价值。因此，开发方法以鉴定显示转移性表型的肿瘤提供了在比目前可能的方法在早得多的阶段潜在地鉴定这些骨转移癌的机制。这可能将显著改善患者的预后结果。

根据该实施方式，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测表1中的一个或多个基因在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型，并且所述转移是骨转移。

在相关实施方式中，提供了一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测所述肿瘤中IRF7、IRF9或STAT1的功能水平，其中，所述IRF7、IRF9或STAT1功能水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型，且所述转移是骨转移。

仍然在不以任何方式限制本发明的情况下，最常见的癌症转移位点是肺、骨和肝。虽然大多数癌症都能够扩散至身体的不同部分，但与其他位点相比，其通常更频繁地扩散至一个位点。下文列出了若干癌症类型的三个最常见转移位点(排除了淋巴结)：

在另一个实施方式中，提供了一种评估来自个体的乳腺、肾或前列腺肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测表1中的一个或多个基因在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

在一个相关实施方式中，提供了一种评估来自个体的乳腺、肾或前列腺肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测所述肿瘤中IRF7、IRF9或STAT1的功能水平，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述IRF7、IRF9或STAT1功能水平的下降表示所述乳腺、肾或前列腺肿瘤的转移性表型。

应理解本发明的方法不能决定性地鉴定转移癌的位点或可能位点。然而，转移性表型的阳性诊断结果确实能够促进设计适当的监测和治疗方案以处理患者向转移性癌症的转变。

如前文所详述的那样，本发明基于意料之外的测定结果预测肿瘤细胞中转录因子IRF7的功能缺失导致这些肿瘤细胞转变为转移性表型。在不将本发明限制于任意一种作用模式或理论的情况下，干扰素调节因子(IRF)是一个转录因子家族，其具有多重功能，包括宿主防御、细胞循环调节、凋亡、癌发生以及免疫细胞发育和内稳态。目前，有10种哺乳动物IRF家族的成员(IRF 1至10)，其都含有保守的DNA结合结构域。该DNA结合结构域位于IRF的氨基端并由五色氨酸重复组成，该五色氨酸重复结合与IFN刺激应答元件(ISRE)类似的特定的GAAA基因组序列。IRF通过其羧基端处的磷酸化被激活，之后其从细胞质易位至细胞核以影响含ISRE基因的转录。各种IRF在细胞定位、结构特性、激活诱导的刺激方面具有差异，因此赋予各IRF独特的功能。

目前，已证明原发肿瘤中IRF7表达的缺失将该肿瘤转变为转移性表型。该发现本身提供了常规性筛选原发肿瘤以评估其转移状态的基础。然而，还进一步证明，在这些肿瘤中，IRF7的缺失导致了表1(a)中所列干扰素调节基因组中一些或全部基因的表达下调。这些基因的共同点是在其启动子区域存在IRF7结合位点。表1(b)中的基因是全体的I型干扰素调节基因。

表1(a)

表1(b)

关于上文所详述的各基因，应将其理解为这些基因的所有形式及其变体。本领域技术人员应理解，已知一些基因在个体或单核苷酸多态性之间显示出等位基因变异。SNP包括不同大小和简单的序列重复(如二核苷酸和三核苷酸重复)的插入和缺失。变体包括来自相同区域的核酸序列，其相对于本文所述基因共有至少90％、95％、98％、99％序列相同性，即具有一个或多个缺失、插入、取代、反转的序列等。因此，本发明应理解为扩展至这类变体，所述变体在本诊断应用中实现相同的结果，但在个体之间可能存在实际核酸序列之间的轻微遗传变异。因此，本发明应理解为扩展至由任何其他突变、多态性或等位基因变异所产生的所有形式的DNA。

就本发明的方法而言，可以多种方法实现对这些基因的“表达水平”的筛选，包括筛选由这些基因转录的RNA或由其生成的cDNA或蛋白表达产物中任意形式。“筛选RNA转录本水平”应理解为直接筛选RNA或筛选由其转录的cDNA。这些产物中任意产物水平的变化表示对象基因的表达发生变化。如前文所详述的那样，经历转变为转移性表型的肿瘤中功能性IRF7的缺失会导致表1中全部或一些基因的表达下降或缺失。因此，在这类样品中，可预期观察到转录下降以及mRNA转录本和编码的蛋白表达产物的缺失。此外，鉴定和测量的核酸分子或蛋白可以是整个分子或其片段。例如，可以仅鉴定RNA片段，这取决于样品是如何处理的。如果所述片段包含足够的序列以显示其来源于特定基因或蛋白，则片段化的分子可用于本发明的方法中。

“核酸分子”应理解为脱氧核糖核酸分子和核糖核酸分子及其片段。本发明因此扩展至直接筛选样品中RNA水平或筛选反转录自感兴趣的RNA群体的互补cDNA。本领域技术人员能够设计方法以筛选DNA、RNA或蛋白。

预测上文表1所列任意基因都可单独地用于或与表1中其他基因或其他诊断标记联用于本发明的方法。虽然关于少至一个基因的表达的信息预期也能提供有用的信息，但在包括更多标记时会提高肿瘤被分类为转移性的准确性。可根据这些基因组的表达分析肿瘤，包括表1所列基因中的1-10个，以任意组合。本领域技术人员能够选择基因组以分析表1所列基因。

为了简洁起见，发明人不会特别地列出各种适用于本发明的可能的基因组合。然而，应理解各种这类组合都包括在本发明的范围内。

表2

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测IFITM3、TLR3、IRF7和IL13RA1在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测CALD1、RUNX1、YWHAZ和HBEGF在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测IL13RA1、CSF2RB、STAT1、CD44、IRF7、IFI44、TLR3和IFITM3在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

优选地，所述方法包括检测L13RA1、CD86、CSF2RB、STAT1、CD44、IRF7、IFI44、TLR3、IER3、IFITM3、RUNX3和CTSS的表达。

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测IFI44、IRF7、CSF2RB、STAT1、TLR3、IL13RA1和IFITM3在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

优选地，所述方法包括检测IFI44、IRF7、CSF2RB、STAT1、TLR3、IFI202B、IER3、RUNX3、CTSS、IL13RA1、IFITM3和CD86的表达。

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测RUNX1、SQLE、PDXK、YWHAZ、DDX3X、RBBP4、HBEGF、DAB2和FAM120A在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

优选地，所述方法包括检测RUNX1、SQLE、PDXK、HNMT、CALD1、YWHAZ、DDX3X、RBBP4、THBS1、HBEGF、DAB2和FAM120A的表达。

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测PTPRK和SLC6A6在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

优选地，所述方法包括检测CSDE1、ATP6V1B2、PTPRK、LGMN、CXCL9、TGIF1、NIPA2、SLC6A6、ARG1、CFP、CTSH和ACSL4的表达。

另一个实施方式涉及一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测DHX58、BST2、IFI44、IFIT3、IRF7、STAT1、DSP和USP18在所述肿瘤中的表达，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移表型。

根据先前的方面，在一个实施方式中，所述筛选方法涉及筛选mRNA或cDNA。

在另一个实施方式中，所述筛选方法涉及筛选编码的蛋白表达产物。

本领域技术人员应理解，上文详述的基因组(gene panel)可对分离的组进行筛选或其可形成较大组的一部分。即，可挑选与一个或多个其他标记一起对给定的组进行筛选。

关于IRF7、IRF9和STAT1，可对这些蛋白中一种或多种在肿瘤细胞核内区域的定位进行筛选，因为这显示成功的磷酸化和分子的信号传导。或者，可对胞内是否存在磷酸化形式的蛋白进行筛选。虽然可对这些蛋白绝对水平的变化进行筛选，但应理解导致转移转变的细胞缺陷不一定是IRF7、IRf9或STAT1表达本身的缺失。该缺陷也可以是这些蛋白的功能形式的缺失。在这种情况下，该蛋白仍可存在，但不是以功能形式存在。

在不将本发明限制于任意一种作用模式或理论的情况下，这些蛋白通过经历磷酸化并之后从细胞质易位至细胞核内来发挥功能。一旦进入细胞核，IRF7和IRF9结合基因启动子以诱导转录。因此，通过筛选蛋白的定位(细胞质定位表示非功能性)或磷酸化(缺乏磷酸化表示非功能性)，非功能性蛋白是可以检测的。该测试形式可与蛋白或所述蛋白的RNA转录本的绝对水平测试共同进行。

“IRF7”、“IRF9”和“STAT1”应理解为这些蛋白的所有形式，包括由对象蛋白mRNA的可变剪接生成的任何同种型或等位基因或多态性变体。

在肿瘤细胞中测量对象基因表达或功能性蛋白水平。本领域技术人员应理解，测试肿瘤以确定其转移状态通常出现在通过外科手术切除肿瘤后。然而，对于不可能或不需要外科切除的程度，或者对于希望得到即时结果的程度而言，可在初步诊断中或之后立即获得活检样品并对该样品进行测试。

相对于相应非转移性肿瘤中的水平，对获自待治疗个体肿瘤的结果进行评估。这是对照水平。“相应”指与测试对象的肿瘤具有相同组织类型的肿瘤。例如，如果乳腺组织肿瘤是根据本发明的方法进行分析的对象，则基因或蛋白表达的对照水平是非转移性乳腺组织肿瘤的基因或蛋白表达水平。对照水平可以是反映个体的标准结果或获自除待治疗哺乳动物以外个体的共同结果。这种形式的分析实际上是优选的分析方法，因为其使试剂盒的设计为需要收集和分析单个生物样品，该样品为感兴趣的测试样品。可通过本领域技术人员熟知的任何合适方法来计算提供对照水平的标准结果。例如，可评估非转移性肿瘤组织群体的基因或蛋白表达水平，从而提供可用于分析所有未来测试样品的标准数值或数值范围。应理解该对照水平可由特定组的对象测定并用于来源于该组的测试对象。因此，可测定多个标准数值或范围，其对应于特性(如年龄、性别、民族或健康状态)不同的各组。预期对可生成肿瘤的各组织类型开发标准。所述“对照水平”可以是独立的水平或水平范围。

根据本发明的方法测试的生物样品可直接测试或在测试前需要一些形式的处理。例如。测试样品可在测试前需要匀浆或需要切片用于原位测试蛋白的胞内定位。或者，在测试前，细胞样品可能需要通透。此外，对于不是液体形式的生物样品，(如果该形式是测试需要的)，则需要添加试剂(如缓冲液)以使样品流动。

可直接测试生物样品或在测试前分离生物样品中存在的全部或一些核酸或蛋白材料。为此，应理解在筛选表1中基因表达水平的变化时，可筛选RNA转录本本身或由其转录的cDNA。在另一个实施例中，在分析前对样品进行部分纯化或富集。本发明的范围包括在测试前对目标细胞群体或其来源的分子进行预处理，例如灭活活病毒或在凝胶上运行。还应理解可在测试前新鲜收获生物样品或将其存储(例如通过冷冻)或者在测试期处理(例如通过进行培养)。

本文所用术语“个体”或“患者”包括人、灵长类、家畜动物(如马、牛、绵羊、猪、驴)、实验室测试动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(如狗、猫)和捕获的野生动物(如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，该哺乳动物是人或实验室测试动物。甚至更优选地，该哺乳动物是人。

应理解在转变为转移性表型的肿瘤中，对象分子表达水平的下降可以是其表达水平相对于对照水平的部分下降或者是表达的完全缺失。应理解各基因之间表达水平的下降程度可以变化。因此，在测试表1的六个或更多个基因时，各基因之间表达水平的下降程度可以不同。然而，关键问题是各基因的水平相对于其相应对照下降。还应预期在具有相同类型的原发肿瘤的不同患者之间，可观察到测试基因表达下降程度的差异。然而，如果观察到的水平低于非转移性肿瘤对照水平，这表示向转移性表型的转变。

在肿瘤样品中测试表1所列一个或多个基因表达水平变化的方法可以通过任何合适的方法实现，其是本领域技术人员熟知的，例如但不限于通过阵列技术评估RNA的表达概况(Alon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA:96,6745-6750，1999年6月)。

“微阵列”是固体支持物表面上形成的优选离散区域(其各自具有限定的区域)的线性或多维阵列。微阵列上离散区域的密度由单个固相支持物表面上待检测的目标多核苷酸的总数确定。如本文中所用，DNA微阵列是置于芯片或其他表面上的寡核苷酸探针的阵列，用于检测来自复杂的核酸混合物的互补寡核苷酸。由于各特定组的探针在阵列中的位置已知，所以可根据其结合于微阵列中的特定位置确定目标多核苷酸的种类。

DNA微阵列技术使其能够在单个固相支持物上对多个目标核酸分子进行大规模试验。美国专利号5,837,832(Chee等)和相关专利申请描述了固定寡核苷酸探针阵列以杂交和检测样品中的特定核酸序列。将分离自感兴趣的组织的感兴趣的目标多核苷酸杂交至DNA芯片并基于离散探针位置上杂交的程度和目标多核苷酸的偏向(preference)来检测特定的序列。阵列的一种重要应用是差异基因表达的分析，其中比较了不同细胞或组织(通常是感兴趣的组织和对照组织)中的基因表达概况并鉴定了相应组织之间基因表达的任何差异。这类信息用于鉴定特定组织类型中表达的基因类型并基于表达概况来诊断病症。

在一个实施例中，对来自感兴趣的样品的RNA进行反转录以获得标记的cDNA。参见美国专利号6,410,229(Lockhart等)。随后将cDNA杂交至以已知顺序排列在芯片或其他表面上的寡核苷酸或已知序列的cDNA。在另一个实施例中，RNA分离自生物样品并杂交至锚定有cDNA探针的芯片。标记的cDNA杂交的寡核苷酸位置提供了cDNA上的序列信息，而标记的杂交的RNA或cDNA的量提供了对感兴趣的cDNA或RNA的相对代表性的预测。参见Schena等，Science 270:467-470(1995)。例如，DeRisi等(Nature Genetics 14:457-460(1996))描述了使用cDNA微阵列以分析人癌症中的基因表达模式。

在一个实施方式中，制备了对应于对象核酸的核酸探针。设计连接于微阵列的核酸探针使其与生物样品的核酸基本互补，从而发生目标序列与本发明的探针之间的特异性杂交。该互补无需完美，其中可存在任何数目的碱基对错配，所述错配会干扰目标序列与本发明的单个标准核酸之间的杂交。预期在核苷酸水平上基因的总体同源性可能是约40％或更高、可能约60％或更高，且甚至更可能约80％或更高；此外会存在约8-12个核苷酸或更长的相应连续序列。然而，如果突变数目过大使得甚至在最低严谨性的杂交条件下仍无法进行杂交，则序列不是互补目标序列。因此，本文中“基本互补”指探针与目标序列足够互补以在正常反应条件(尤其是高严谨性条件)下进行杂交。

核酸探针通常是单链的但可以是部分单链部分双链。探针的链型(strandedness)由目标序列的结构、组成和特性决定。通常，核酸探针的长度范围为约6、8、10、12、15、20、30至约100个碱基，优选约10至约80个碱基，特别优选约15至约40个碱基。即，通常很少将整个基因用作探针。在一些实施方式中，可使用长得多的核酸，最多数百个碱基。探针是足够特异地，以在本领域技术人员已知的条件下与互补模板序列杂交。通过BLAST(默认设置)测定，杂交期间探针序列及其杂交的互补模板(目标)序列之间错配数目一般不超过15％，通常不超过10％且优选不超过5％。

寡核苷酸探针可包含通常在核酸中发现的天然产生的杂环碱基(尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤)以及修饰的碱基和碱基类似物。在本发明的实践中，与探针和目标序列杂交相容的任何修饰的碱基或碱基类似物都是有用的。探针的糖或糖苷部分可包含脱氧核糖、核糖和/或这些糖的修饰形式(例如2'-O-烷基核糖)。在优选的实施方式中，糖部分是2'-脱氧核糖；但是，与探针和目标序列的杂交能力相容的任何糖部分都可使用。

在一个实施方式中，探针的糖苷单元通过磷酸二酯骨架与探针相连，如本领域中所熟知。在其他实施方式中，核苷酸间连接可包括本领域技术人员已知且与探针的特异性杂交相容的任何连接，包括但不限于硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磺酸酯(参见美国专利号No.5,470,967)和聚酰胺(即肽核酸)。肽核酸描述于Nielsen等(1991)Science 254:1497-1500、美国专利号5,714,331和Nielsen(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:71-75。

在某些实施方式中，该探针可以是嵌合分子，即可包含一种以上类型的碱基或糖亚基，和/或连接可以是相同引物内的一种以上类型。该探针可包含某一部分以促进其与目标序列的杂交，如本领域已知的那样，例如嵌入剂和/或小沟结合物。探针上碱基、糖和核苷间骨架的差异以及是否存在任何侧基会与探针以序列特异性方式与其目标序列结合的能力相容。这些界限(bound)中可能存在大量结构修饰。优选地，本发明所述的探针可具有结构特征，从而使其允许信号扩增，这类结构特征是例如支链DNA探针，如Urdea等(Nucleic Acids Symp.Ser.,24:197-200(1991))或欧洲专利号EP-0225,807中所述的那些。此外，制备形成探针的多种杂环碱基、糖、核苷和核苷酸以及制备特异性预定序列的寡核苷酸的合成方法是本领域中完备且已知的。优选的寡核苷酸合成方法包括美国专利号5,419,966的启示。

可对特定目标核酸设计多个探针以针对目标核酸中的多态性和/或二级结构、数据冗余等。在一些实施方式中，当每条序列使用了一个以上探针时，使用了重叠探针或针对单个目标基因的不同部分的探针。即，使用了两个、三个、四个或更多个探针，从而为特定目标构建冗余度。这些探针可以是重叠的(即具有一些共有序列)或对基因的不同序列特异的。当本发明中需要检测多个目标多核苷酸时，对应于特定目标多核苷酸的各探针或探针组位于微阵列的离散区域中。

探针可以在溶液中(如在孔中或微阵列的表面上)或者与固体支持物相连。可使用的固体支持物材料的示例包括塑料、陶瓷、金属、树脂、凝胶和膜。有用的固体支持物的类型是板、珠、磁性材料、微珠、杂交芯片、膜、晶体、陶瓷和自组装单层。一个示例包括二维或三维基质，如具有多个探针结合位点的杂交芯片或凝胶(Pevzner等，J.Biomol.Struc.&Dyn.9:399-410,1991；Maskos和Southern,Nuc.Acids Res.20:1679-84,1992)。杂交芯片可用于构建非常大的探针阵列，随后使用目标核酸进行杂交。对芯片杂交模式的分析可辅助鉴定目标核苷酸序列。可手动或使用计算机分析模式，但带位置信息的杂交测序(positional sequencing by hybridization)适用于计算机分析和自动化。在另一个实施例中，可在固相结构支持物上联合使用昂飞芯片和基于荧光珠的方法。在另一个实施例中，可使用cDNA微阵列。为此，特别优选Lockkart等描述的寡核苷酸(即固相上原位的昂飞合成探针)，即照相平版印刷。

本领域技术人员应理解，可以多种方法将核酸连接或固定于固体支持物。本文中“固定”指核酸探针与固体支持物之间的连接或结合在结合、清洗、分析和移除的条件下足够稳定。结合可以是共价的或非共价的。本文中“非共价结合”和语法等同词指静电、亲水和疏水相互作用中的一种或多种。非共价结合包括分子(如链霉亲和素)与支持物的共价连接和生物素化探针与链霉亲和素的非共价结合。本文中“共价结合”和语法等同词指两个部分(固体支持物和探针)通过至少一个键(包括σ键、π键和配位键)连接在一起。共价键可直接形成于探针和固体支持物之间或者可通过交联剂或在固体支持物或探针或上述两者上导入特定的反应基团来形成。固定还可涉及共价和非共价相互作用的组合。

可通过共价结合(如通过与偶联剂偶联)或通过共价或非共价结合(如静电相互作用、氢键或抗体-抗原偶联)或其组合将核酸探针连接至固体支持物。典型的偶联剂包括生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、金黄色葡萄球菌蛋白A/IgG抗体F_c片段和链霉亲和素/蛋白A嵌合物(T.Sano和C.R.Cantor,Bio/Technology 9:1378-81(1991))或这些试剂的衍生物或组合。可通过光可切割键、静电键、二硫键、肽键、二酯键或这些键的组合将核酸连接至固体支持物。还可通过选择性可释放键(如4,4'-二甲氧基三苯甲基或其衍生物)将阵列连接至固体支持物。已发现可用的衍生物包括3或4[双-(4-甲氧基苯基)]-甲基-苯甲酸、N-琥珀酰亚胺基-3或4[双-(4-甲氧基苯基)]-甲基-苯甲酸、N-琥珀酰亚胺基-3或4[双-(4-甲氧基苯基)]-羟甲基-苯甲酸、N-琥珀酰亚胺基-3或4[双-(4-甲氧基苯基)]-氯甲基-苯甲酸以及这些酸的盐。

本领域技术人员应理解，通常可使用多种方法将探针连接至微阵列。如本文所述，可首先合成核酸随后连接至微阵列，或者可以直接在微阵列上合成核酸。

微阵列包含合适的固体基质。本文中“基质”或“固体支持物”或其它语法等同词指可经修饰以含有适合核酸探针连接或结合的离散独立位点并且适用于至少一种检测方法的任何材料。本发明的固相支持物可以是适用于支持核苷酸杂交和合成的任何固体材料和结构。优选地，该固相支持物包含至少一种基本刚性的表面，其上可固定引物并进行反转录酶反应。多核苷酸微阵列元件稳定连接的基质可由多种材料制成，包括塑料、陶瓷、金属、丙烯酰胺、纤维素、硝化纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚环氧乙烷、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟隆、碳氟化合物、尼龙、有机硅橡胶、聚酐、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚正酯、聚富马酸丙酯、胶原、葡糖胺基葡聚糖和聚氨基酸。基质可以是二维或三维形式，如凝胶、膜、薄膜、玻璃、板、圆柱体、珠、磁珠、光纤、织造纤维等。优选的阵列形式是三维阵列。优选的三维阵列是带标签的珠的集合。各带标签的珠上连接有不同的引物。标签可通过信号传导方式(如颜色(Luminex，Illumina)和电磁场(Pharmaseq))来检测，且甚至可以远程检测带标签的珠上的信号(例如使用光纤)。固体支持物的尺寸可以是用于DNA微阵列技术的任意标准微阵列尺寸，并可调整尺寸以使其符合用于进行本发明的反应的特定机器。通常，该基质允许光学检测且不明显发荧光。

在一个实施方式中，可使用化学官能团对微阵列和探针的表面进行衍生化，用于随后将两者相连。因此，例如，使用化学官能团对微阵列进行衍生化，该化学官能团包括但不限于氨基、羧基、氧代基和巯基，其中特别优选氨基。通过使用这些官能团，可使用探针上的官能团来连接探针。例如，含有氨基的核酸可连接至包含氨基的表面，例如使用本领域已知的接头；例如熟知的同质或异质双功能接头。此外，在一些情况下，还可使用其他接头，如烷基(包括经取代的烷基和杂烷基)。

在该实施方式中，可以本领域已知的方式合成寡核苷酸并随后将其连接至固体支持物表面。本领域技术人员应理解，5'或3'末端都可连接至固体支持物，或可经由内部核苷进行连接。在其他实施方式中，至固体支持物的固定可以非常强，但是非共价的。例如，可制备生物素化的寡核苷酸，其结合有共价包被的链霉亲和素的表面，形成连接。

可根据任何便利的方法生产阵列，例如预形成多核苷酸阵列元件并随后将其稳定地连接至表面。或者，可在表面上合成寡核苷酸，这在本领域中是已知的。多种不同的阵列构型和它们的生产方法是本领域技术人员已知的且公开于WO 95/25116和WO 95/35505(光刻技术)、美国专利号5,445,934(通过光刻法原位合成)、美国专利号5,384,261(通过机械导向的流动路径原位合成)和美国专利号5,700,637(通过点样、打印或偶联合成)；这些文献通过引用全文纳入本文。另一种将DNA偶联至珠的方法使用与DNA末端连接的特异性配体以将配体结合分子连接至珠。可能的配体结合对包括生物素-亲和素/链霉亲和素或各种抗体/抗原对(如地高辛-抗地高辛抗体)(Smith等，Science258:1122-1126(1992))。DNA与支持物的共价化学连接可通过使用标准偶联剂以将DNA上的5'-磷酸通过亚磷酰胺键连接至包衣的微球来实现。将寡核苷酸固定至固态基质的方法是非常成熟的。参见Pease等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(11):5022-5026(1994)。将寡核苷酸连接至固态基质的优选方法描述于Guo等，Nucleic Acids Res.22:5456-5465(1994)。可通过原位DNA合成(Maskos和Southern，同上)或通过共价连接化学合成的寡核苷酸(Guo等，同上)与机器人阵列技术联用来实现固定。

除以微阵列为代表的固相技术外，还可使用液相试验对基因表达进行定量。一种这类系统是动态聚合酶链式反应(PCR)。动态PCR允许同时扩增和定量特定核酸序列。特异性来源于合成的寡核苷酸引物，其设计为优先粘附目标位点周围的单链核酸序列。该寡核苷酸引物对在目标序列的各链上形成特异性、非共价结合复合物。这些复合物促进双链DNA以相反方向进行体外转录。反应混合物的温度循环建立了引物结合、转录和核酸再熔融成单个链的连续循环。结果是目标dsDNA产物的指数增长。可通过使用插入染料或序列特异性探针来实时定量该产物。SYBR(r)Green 1是插入染料的一个示例，其优先结合dsDNA，导致随后荧光信号的增加。序列特异性探针(如使用于TaqMan技术)由荧光染料和与寡核苷酸的相反端共价连接的猝灭分子组成。探针被设计为选择性结合两个引物之间的目标DNA序列。在PCR反应期间合成DNA链时，通过聚合酶的外切核酸酶活性从探针上切除荧光染料，导致信号反淬灭(dequenching)。探针信号传导方法可以比插入染料方法更特异，但在各种情况下，信号强度都与生成的dsDNA产物成比例。各种类型的定量方法都可用于多孔液相阵列，各孔代表对感兴趣的核酸序列特异的引物和/或探针。在使用组织或细胞系的信使RNA制备物时，探针/引物反应的阵列可同时定量多个感兴趣的基因产物的表达。参见Germer等，Genome Res.10:258-266(2000)；Heid等，Genome Res.6:986-994(1996)。

可通过本领域技术人员熟知的任何合适方法来测试IRF7、IRF9和STAT1蛋白的功能性水平变化。例如，可通过简单的免疫组化筛选蛋白的胞内定位。

合适的方法的示例包括但不限于组织切片或活检样品的抗体筛选。

对于使用基于抗体的诊断方法的程度，可通过多种方式确定标记蛋白是否存在，例如通过Western印迹、ELISA或流式细胞术。当然，这些方法包括非竞争类型的单位点和双位点或“夹心”试验，以及传统的竞争性结合试验。这些试验还包括使标记的抗体直接结合靶标。

其中夹心试验是最有用和最常用的试验。存在多种夹心试验技术的变化，且本发明旨在包括所有这些变化。简言之，在典型的正向试验中，将未标记的抗体固定在固体基质上并使待测试的样品接触结合的分子。在合适的孵育期间后，允许足够的时间以形成抗体-抗原复合物，随后添加使用能够产生可检测信号的报告分子标记的对抗原特异的二抗并孵育，给予足够的时间以形成另一个抗体-抗原-标记的抗体复合物。洗去任何未反应的材料并通过观察报告分子产生的信号来确定抗原是否存在。该结果可以是定性的(通过简单观察视觉信号)，或者可以是定量的(通过与对照样品比较)。该正向试验的变化包括同时试验，其中同时向结合的抗体中加入样品和标记的抗体。这些技术是本领域技术人员熟知的，包括任何显而易见的微小差异。

在典型的正向夹心试验中，对标记或其抗原部分具有特异性的一抗可共价或被动地结合至固体表面。该固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素，聚丙烯酰胺，尼龙，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。该固体支持物可以是管、珠、微版盘的形式或适用于进行免疫试验的任何其他表面。结果过程是本领域已知的且通常由交联、共价结合或物理吸附组成，在测试样品的制备物中清洗聚合物-抗体复合物。随后向固相复合物中添加待检测样品的等分试样并孵育足够长的时间(例如2-40分钟)并在合适的条件(例如25℃)下以允许抗体中存在的任何亚基的结合。孵育时间之后，清洗并干燥抗体亚基固相并将其与特异性针对抗原的一部分的二抗孵育。该二抗与报告分子相连，该报告分子用于显示二抗与抗原的结合。

本说明书中使用的“报告分子”指通过其化学性质提供可分析鉴定的信号的分子，用于检测结合抗原的抗体。检测可以是定性或定量的。该类型的试验中最常用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

在酶免疫试验的情况下，酶偶联至二抗，通常通过还原戊二醛或高碘酸盐的方式。然而，应理解存在多种不同偶联技术，这对本领域技术人员而言是显而易见的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。通常选择与特异性酶一起使用的底物以用于在使用相应酶进行水解后生成可检测的颜色变化。合适的酶的示例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，产生荧光产物而不是上面提及的发色底物。在所有情况下，都将酶标记的抗体添加至一抗半抗原复合物，允许结合，随后洗去过量的试剂。然后将含合适底物的溶液加入抗体-抗原-抗体复合物中。底物与连接二抗的酶反应，产生定性可见信号，通常可用分光光度分析进一步定量，指示样品中存在的抗原量。“报告分子”还扩展至使用细胞凝集或凝集抑制，如乳珠上的血红细胞等。

或者，荧光化合物例如荧光素和若丹明，可以化学偶联于抗体上而不改变其结合能力。当用特定波长光照射激活时，荧色物标记抗体吸收光能，诱导分子激发性状态，然后发射用光学显微镜视觉可检测的特征性颜色的光。如同在EIA中，允许荧光标记的抗体结合一抗-半抗原复合物。洗去未结合试剂后，剩余三元复合物随后暴露在合适波长光下，观察到的荧光指示感兴趣半抗原的存在。免疫荧光和EIA技术都是本领域中非常成熟的且对本方法特别优选。然而，也可使用其他报道分子，例如放射性同位素，化学发光或生物发光分子。

就选择筛选这些蛋白的磷酸化状态而言，可定性或定量地实现该目的。最简单地，可在分离物(即存在或不存在任何磷酸化)中或相对于对照测试通过肉眼评估显色的条带强度(例如在整合放射性磷酸(例如[³²P]–γATP)或使用特异性识别磷酸化残基的抗体的免疫印迹后进行的放射自显影上)，其中较暗和/或较厚的条带表示高于较浅和/或较薄条带的磷酸化水平。可使用报告物读数定性或定量地进行相应类型的分析。可使用特定装置(如基于可见光或荧光的密度计)进行更复杂的分析，其根据经验计算给定条带中相对于标准品的磷酸化蛋白浓度。

在一个相关方面，本发明允许开发用于治疗转移性癌症的方法。应理解，无论选择何种治疗方案以靶向原发肿瘤，本发明这一方面的方法都最好用作辅助治疗。例如，可通过外科手术移除原发肿瘤并随后应用对象治疗方法以治疗性治疗转移性疾病。在另一个实施例中，原发肿瘤不可通过外科手术移除并通过放射治疗，然而同时使用本方法治疗患者的转移性肿瘤。本领域技术人员应理解，在原发肿瘤的分析揭示了向转移性表型的转变后，通常可进行本发明的方法的应用。

在不以任何方式限制本发明的情况下，应理解本文中公开的诊断方法鉴定了向转移性表型的转变，在一些情况下转移性扩散已经开始，而在其他临床情况下，虽然出现了向转移性表型的转变，但原发肿瘤细胞向其他器官的实际扩散尚未出现。预测除了在转移癌的较晚期以外(此时转移性肿瘤变得高度可见)，无法确定是否已经出现原发肿瘤的转移性扩散。因此，本发明的方法可以有预防性的功能，例如在具有转移性表型的原发肿瘤不能通过手术移除但尚未实际扩散时，或者其可以有治疗性的功能，例如在转移性扩散已经开始、甚至这些转移癌尚无法通过常规诊断技术检测时。

虽然本发明这一方面的治疗方法可用于治疗晚期或早期转移性疾病，但其在预防或治疗早期转移癌中的应用特别重要，因为这提供了一种潜在预防患者到达晚期疾病点的方法，所述晚期疾病点使人虚弱并导致较差的预后结果，原因在于与晚期疾病相关并可使晚期治疗有效性降低的一系列其他临床问题。迄今为止，还没有治疗转移性疾病的有效方法。目前主要的治疗方法是化疗，其极不特异且仅具有中等效果。由于副作用，在还没有出现转移性疾病的临床指标时，临床医生也不愿意让患者接受该治疗方案。通常的情况是，当转移癌可被诊断时，其已经变得相对晚期且预后不良。本发明的方法首次同时提供了精确并简单地确定原发肿瘤是否变得有转移性的方法(甚至在非常早期)和基于靶向这些细胞(含有无功能性IRF7)中特定缺陷的治疗方案来治疗转移性肿瘤的方法，这在癌症领域中是一大进步。

如前文所详述的那样，本发明基于对于原发肿瘤中功能性IRF7的缺失诱导了向转移性表型的转变的确定。因此，除了已基于筛选原发肿瘤中IRF7相关基因签名的状态来研发诊断方法外，还证明了IRF7通路的恢复提供了有效的治疗方案。

因此，本发明的这一方面涉及一种治疗个体中转移性癌症的方法，该癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

“异常的IRF7功能”应理解为对来源于特定类型的原发肿瘤的转移性癌症的参照，所述原发肿瘤类型可以通过本发明第一方面所述的方法诊断。即，简言之，IRF7在原发肿瘤中变得无功能或功能较小并因此导致了肿瘤转变为转移性表型。诊断上的特征是表1中6个或更多个基因的表达缺失或IRF7、IRF9和STAT1的功能性水平下降。在不将本发明限制于任意一种作用模式或理论的情况下，已证明在原发肿瘤中表现出该缺陷的患者对I型IFN治疗作出了有益的响应，所述治疗用于恢复IRF7通路功能，从而有效地治疗转移性疾病。

“转移性”和“单个”应理解为具有相同含义，如前文所定义。

在一个实施方式中，所述转移性癌症是乳腺、结肠、肾、肺、皮肤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、胃、甲状腺或子宫的癌症。

在另一个实施方式中，本发明更具体地涉及一种治疗个体中乳腺、肾或前列腺转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

“乳腺、肾、前列腺”或其他转移性癌症应理解为由这些器官之一中存在的原发肿瘤产生的转移性癌症。本发明不限于这些器官，而是可以扩展至任意器官所产生的转移性癌症，如前文所述的那些器官，其特征是IRF7功能缺失，目前可对其进行常规诊断。

在另一个实施方式中，提供了一种在个体中治疗转移性癌症的方法，所述转移存在于骨中且所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予治疗有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

在不将本发明限制于任意一种作用模式或理论的情况下，人I型IFN结合特定的细胞表面受体复合物(其被称作IFN-α受体(IFNAR)，由IFNAR1和IFNAR2链组成)。哺乳动物I型IFN标注为IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为limitin)。因此，“I型IFN”应理解为落入该类别的任意干扰素类型，包括所有前体、原蛋白或中间体形式。其还包括来源于I型IFN mRNA的可变剪接或I型IFN的多晶型形式的任何异构体。I型IFN扩展至任何I型IFN蛋白，无论其存在形式是二聚体、多聚体或融合蛋白。在一个实施方式中，所述I型IFN是IFN-α或IFN-β。

因此，在一个实施方式中，提供了一种治疗患者中转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述患者中IFN-α水平的试剂。

在另一个实施方式中，提供了一种治疗个体中转移性癌症的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中IFN-β水平的试剂。

“有效量”指至少部分实现所需免疫应答的量，或者预防或延迟治疗中特定疾病的发生或抑制治疗中特定疾病的进展或停止治疗中特定疾病的发生或发展的量。该量视待治疗的个体的健康和生理状况、待治疗个体的分类学组、个体免疫系统刺激特异性免疫应答的能力、希望的保护程度、疫苗的制剂、医学状态的评估和其它相关因素而变化。预期该量将落入可通过常规试验测定的较宽范围内。

在另一个实施方式中，所述癌症的特征是骨转移癌的发生。

在另一个实施方式中，所述I型IFN是IFN-α或IFN-β。

对于上调I型IFN水平的试剂，其可以是任何合适的分子，包括但不限于：

(i)I型IFN蛋白或其功能片段；

(ii)编码I型IFN或其功能片段的核酸分子；

(iii)上调I型IFN表达的蛋白或非蛋白分子，例如通过调节I型IFN基因的转录或翻译调控；

(iv)与模式识别受体(如Toll样受体，包括例如TLR7/8激动剂咪喹莫特)相互作用的蛋白或非蛋白分子。

上述蛋白分子可来源于任何合适来源(如天然、重组或合成来源)并包括例如天然产物筛选后鉴定到的融合蛋白或分子。非蛋白分子可以是例如核酸分子，或者其可以是来源于天然来源的分子(例如天然产物筛选)，或者其可以是化学合成的分子。本发明包括I型IFN表达产物的类似物或能够作为激动剂的小分子。化学激动剂不必来源于I型IFN表达产物，但可共有某些构象类似性。或者，可特异性设计化学激动剂以符合某些生理化学特性。

上文点(i)-(iv)中所指蛋白和非蛋白分子在本文中统称为“调节剂”。

前文中定义的对调节剂的筛选可通过若干合适方法中的任一种实现，这些方法包括但不限于使包含I型IFN基因或其功能等同物或衍生物的细胞接触试剂并对I型IFN蛋白生产或功能活性的调节、编码I型IFN的核酸分子表达的调节或者下游I型IFN细胞靶标的活性或表达的调节进行筛选。这类调节的检测可通过采用例如如下技术来实现：Western印迹、电泳迁移率变动试验和/或I型IFN活性报告子读出(例如荧光素酶、CAT等)。

应理解I型IFN基因或其功能等同物或衍生物可以是作为测试对象的细胞中天然产生的，或者可将其转染至宿主细胞中用于测试目的。此外，就I型IFN核酸分子转染进入细胞而言，该分子可包含完整I型IFN基因或其可仅包含该基因的部分，例如调节I型IFN产物表达的部分。例如，可将该I型IFN启动子区域转染进入测试对象细胞。就此而言，当仅采用启动子时，可实现对该启动子活性调节的检测，例如，通过将该启动子接合至报告基因来进行所述检测。例如，可将该启动子连接至荧光素酶或CAT报告子上，可分别通过荧光强度或CAT报告子活性的调节来检测该基因的表达调节。另一个示例包括连接至最小报告子的I型IFN结合位点。

这些方法提供了对推定的调节剂(如包含合成、组合、化学和天然文库的蛋白或非蛋白试剂)进行高通量筛选的机制。这些方法还将促进对结合I型IFN核酸分子或其表达产物的试剂或调节上游分子表达的试剂进行检测，所述上游分子后续调节I型IFN表达或表达产物活性。因此，这些方法提供对直接或间接调节I型IFN表达和/或活性的试剂进行检测的机制。

根据本发明方法采用的试剂可以是任何合适的形式。例如，蛋白试剂可以是不同程度糖基化的或未糖基化的、不同程度磷酸化的或去磷酸化的，和/或可包含一定范围的与所述蛋白同用、连接、结合或其它情况下相关联其它分子，例如氨基酸、脂质、碳水化合物或其它肽、多肽或蛋白。类似地，对象非蛋白分子也可具有任何合适形式。本文所述的蛋白和非蛋白试剂均可与任何其它蛋白或非蛋白分子连接、结合或其它情况下相关联。例如，在本发明的一个实施方式中，所述试剂与允许其靶向局部区域的分子相关联。

对象蛋白或非蛋白分子可直接或间接发挥作用以调节I型IFN的表达或I型IFN表达产物的活性。若所述分子与I型IFN核酸分子或表达产物相关联以分别调节表达或活性，则所述分子直接作用。若所述分子与除I型IFN核酸分子或表达产物以外的其它分子相关联，所述其它分子直接或间接调节所述I型IFN核酸分子或表达产物的表达或活性，则所述分子间接作用。因此，本发明方法涵盖通过诱导调节步骤级联反应对I型IFN核酸分子表达或表达产物活性进行调节。

本文所述分子的“衍生物”包括天然或非天然来源的片段、部分、部或变体。非天然来源包括，例如，重组或合成来源。“重组来源”指使获得的对象分子的细胞来源已经过遗传改变。例如，这将被用以增加或其它情况下增强特定细胞来源的生产速率和体积。部分或片段包括，例如，分子的活性区域。衍生物可源自氨基酸插入、缺失或取代。氨基酸插入的衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及单氨基酸或多氨基酸的序列内插入。插入的氨基酸序列变体是其中一个或多个氨基酸残基被导入蛋白内的预定位点的那些，尽管在对所得产物进行合适筛选的情况下随机插入也是可取的。缺失变体以从序列去除一个或多个氨基酸为特征。取代氨基酸变体是序列中至少一个残基已被去除并在其位置插入不同残基的那些。对氨基酸序列的添加包括与其它肽、多肽或蛋白融合，如上文详述。

衍生物还包括具有与肽、多肽或其它蛋白或非蛋白分子融合的完整蛋白的特定表位或部分的片段。本文设想的分子的类似物包括但不限于，侧链修饰、非天然氨基酸和/或其衍生物在肽、多肽或蛋白合成中的纳入以及交联剂的应用，以及对蛋白分子或其类似物的构象限制的其它方法。

可用于本发明方法的核酸序列的衍生物可类似地衍生自单核苷酸或多核苷酸取代、缺失和/或添加，包括与其它核酸分子融合。本发明中所用的核酸分子的衍生物包括寡核苷酸、PCR引物、反义分子、适用于核酸分子的共同抑制和融合的分子。核酸序列的衍生物还包括简并变体。

I型IFN的“变体”或“突变体”应理解为指具有作为本体的I型IFN形式的至少一些功能活性的分子，该分子是变体或突变体。变异或突变可以是任何形式，并可以是天然产生或非天然产生的。

“同源物”指某分子来源于本发明的方法所治疗的物种以外的物种。例如，出现以下情况时可确定为同源物：所治疗物种以外的物种产生了一种形式的I型IFN，该I型IFN例如具有与经历治疗的对象在天然情况下产生的I型IFN类似和合适的功能特征。

化学和功能等同物应理解为具有对象分子的任何一种或多种功能活性的分子，所述功能等同物可来源于任何来源，例如化学合成或通过筛选方法(如天然产物筛选)鉴定。例如，化学或功能等同物可采用熟知方法设计和/或鉴定，所述方法是例如组合化学或重组文库的高通量筛选或按照天然产物筛选。

例如，可筛选含有小型有机分子的文库，其中使用了具有大量特异性亲代基团(parent group)取代的有机分子。总合成方案可遵循已发表的方法(例如Bunin BA等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:4708-4712；DeWitt SH等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6909-6913)。简言之，在各依次进行的合成步骤中，向阵列中各所选管的亚组添加多种不同选定的取代基之一，同时选择管的亚组为，例如，在所述文库生成过程中产生所有可能的所用不同取代基的置换。一个合适的置换方案在如下文献中有描述：美国专利号5,763,263。

目前在使用随机有机分子的组合文库以筛选生物活性化合物方面具有广泛兴趣(参见例如美国专利号5,763,263)。通过筛选该类型的文库发现的配体可用于模拟或阻断天然配体或干扰生物靶标的天然产生的配体。例如，在本发明中，其可被用作起始点，用于开发具有诸如更强药效的特性的I型IFN类似物。根据本发明，I型IFN或其功能部分可用于各种固相或溶液相合成方法所形成的组合文库中(参见例如美国专利号5,763,263和其中所引用的文献)。通过采用例如美国专利号5,753,187公开的技术，可在少于数周的时间内常规筛选出数百万新化学物和/或生物化合物。在鉴定出的大量化合物中，仅进一步分析具有适当生物学活性的那些。

对于高通量文库筛选方法，使用组合文库装置筛选能够与所选生物剂(如生物分子、大分子复合物或细胞)发生特异性相互作用的寡聚或小分子文库化合物，所述组合文库装置可由本领域技术人员从熟知的方法(如上文所述的那些方法)中容易地进行选择。在这类方法中，对文库中各成员的与选定试剂发生特异性相互作用的能力进行筛选。在该方法的实践中，将生物试剂置入含有化合物的管中并允许其与各管中的单一文库化合物相互作用。该相互作用被设计成产生可检测的信号，这可用于监测所需相互作用的存在。优选地，该生物剂存在于水溶液中并根据所需相互作用适用其他条件。可通过例如任意熟知的用于检测底物的功能性或非功能性方法进行检测。

本文的I型IFN类似物包括但不限于，侧链修饰、非天然氨基酸和/或其衍生物在肽、多肽或蛋白合成中的纳入以及交联剂的应用，以及对类似物进行构象限制的其它方法。这类修饰所采用的具体形式取决于对象分子是蛋白性质的还是非蛋白性质的。可由本领域技术人员常规地确定特定修饰的性质和/或适用性。

所述I型IFN功能性水平的调节可经由给予I型IFN、编码I型IFN的核酸分子或对I型IFN活性或I型IFN基因表达进行调节的试剂(本文中统称为“调节剂”)来实现。

可通过任意便利的方法以药物组合物的形式给予本发明的组合物。考虑药物组合物的组分在以基于具体病例确定的量给予时显示治疗或预防活性。差异取决于例如人或动物。可使用宽范围的剂量。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可每天、每周、每月或采取其它合适的时间间隔给予数个分开的剂量，或者该剂量可按情况危急程度的指示按比例减少。

可以便利的方式给予组合物，例如通过口服、吸入、腹膜内、皮下、栓剂途径或植入(例如使用缓释分子)。在适当之处，还可经由非粘膜途径进行给药，如经由静脉内或其他这类途径。该组合物可以药学上可接受的非毒性盐形式给予，例如酸加成盐或金属络合物，例如锌、铁等的金属络合物(其被认为是出于本申请目的的盐)。此类酸加成盐的说明性示例有：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。若待给予的活性成分是片剂形式，该片剂可包含：粘合剂例如黄芪胶、谷物淀粉或明胶；崩解剂例如海藻酸；以及润滑剂，例如硬脂酸镁。

本发明的调节剂可与药学上可接受的运载体(赋形剂)合并以形成药物组合物。药学上可接受的运载体可含有生理学上可接受的化合物，其作用是例如稳定或提高或降低本发明的药物组合物的吸收或清除率。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或右旋糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白、降低肽或多肽的清除或水解的组合物，或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。去垢剂也可用于稳定或提高或降低药物组合物的吸收，包括脂质体运载体。用于肽和多肽的药学上可接受的运载体和制剂是本领域技术人员已知的且详细地描述于科学和专利文献，参见例如最新版本的《雷明顿药物科学》，宾夕法尼亚州伊顿的麦克出版公司(MackPublishing Company)(《雷明顿》)。

其他生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，防腐剂对于避免微生物生长或作用特别有用。各种防腐剂是熟知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员应理解，包含生理学上可接受的化合物的药学上可接受的运载体的选择取决于例如本发明的肽或多肽的给药途径及其特定的生理化学特性。

固体制剂可用于肠道(口服)给药。其可配制为例如丸剂、片剂、粉末剂或胶囊剂。对于固体组合物，可使用传统的无毒固体运载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过纳入任意正常使用的赋形剂(如前文所列的那些运载体)来形成药学上可接受的无毒组合物。非固体制剂也可用于肠道给药。运载体可选自各种油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物赋形剂包括，例如，淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇。

在口服给予时，可保护本发明的组合物免于被消化。这通常通过将组合物与使其耐受酸性和酶促水解的组合物复合，或通过将这些分子包装在合适的耐受性运载体(如脂质体)内来完成。保护化合物免受消化的方法是本领域熟知的，参见例如Fix(1996)Pharm Res.13:1760-1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119-135；美国专利5,391,377，描述了用于口服给予治疗剂的液体组合物(脂质体递送更详细地讨论于下文中)。

本发明的组合物还可以缓释递送或缓释释放机制给予，其可在内部递送制剂。例如，本发明的制剂中可包括能够缓释递送肽的生物可降解微球或胶囊或者其他生物可降解聚合物结构(参见例如Putney(1998)Nat.Biotechnol.16:153-157)。

对于吸入，可使用本领域已知的任何系统来递送本发明的组合物，包括干粉气溶胶、液体提送系统、喷气喷雾器、喷射剂系统等。参见例如，Patton(1998)Biotechniques 16:141-143；由例如以下生产商提供的用于多肽大分子的产物或吸入式递送系统：杜拉制药公司(Dura Pharmaceuticals)(加利福尼亚州圣地亚哥)、阿拉迪姆公司(Aradigm)(加利福尼亚州海沃德)、产气菌公司(Aerogen)(加利福尼亚州圣克拉拉)、吸入治疗系统公司(Inhale Therapeutic Systems)(加利福尼亚州圣卡洛斯)等。例如，I型IFN制剂可以气溶胶或雾气形式给予。就气溶胶给药而言，该制剂可以精细分离形式与表面活性剂和推进物一同供给。在另一个方面，用于递送该制剂至呼吸组织的装置是使其中制剂汽化的吸入器。其它液体递送系统包括，例如，喷气喷雾器。

可在适用于肺部或呼吸递送至患者的药学上可接受的组合物中配制I型IFN。具体的制剂包括干粉、适用于喷雾的液体溶液或悬浮液以及适用于在计量剂量吸入器(MDI)中使用的喷射剂制剂。这类制剂的制备详细地描述于专利、科学和医学文献中，以下描述仅作为示例。

用于喷雾器系统的I型IFN液体制剂可包含组分以增强或维持化学稳定性，包括螯合剂、蛋白酶抑制剂、等渗改性剂、惰性气体等。

为在计量剂量吸入器中使用，将本发明的I型IFN溶解或悬浮在合适的气溶胶喷射剂(如氯氟烃(CFC)或氢氟烃(HFC))中。合适的CFC包括三氯单氟甲烷(喷射剂11)、二氯四氟乙烷(喷射剂114)和二氯二氟甲烷(喷射剂12)。合适的HFC包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。

优选地，为纳入至气溶胶喷射剂，本发明的I型IFN可加工成下文所述可呼吸颗粒以用于干粉制剂。随后将颗粒悬浮在喷射剂中，通常使用表面活性剂包被以增强其分散。合适的表面活性剂包括油酸、去水山梨糖醇三油酸酯和各种长链甘油二酯和磷脂。

这类气溶胶喷射剂制剂还可包含低级醇(如乙醇，以重量计最多30％)和其他添加剂以维持或增强化学稳定性和生理可接受性。

干粉制剂通常包含干燥(通常是冻干)形式的I型IFN，其具有优选范围内的特定尺寸用于沉积于肺的肺泡区域中。优选尺寸范围内I型IFN的可呼吸粉末可通过各种常规技术生产，如喷射研磨、喷雾干燥、溶剂沉淀等。随后可在常规的干粉吸入器(DPI)中将干粉给予患者，其通过装置使用吸气呼吸以分散粉末，或者在使用外部粉末源的空气辅助装置中使用吸气呼吸以使粉末分散成气溶胶云团。

干粉装置通常需要粉末物质在约1mg至10mg的范围内以生产单一的气溶胶剂量(“喷(puff)”)。由于I型IFN的所需剂量可小于该量，可将I型IFN与药学上可接受的干燥膨胀粉末合并。优选的干燥膨胀粉末包括蔗糖、乳糖、海藻糖、人血清白蛋白(HSA)和甘氨酸。其他合适的干燥膨胀粉末包括纤维二糖、右旋糖、麦芽三糖、果胶、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、甘露醇等。通常，在颗粒形成之前，可使用合适的缓冲剂和盐以稳定溶液中的I型IFN。合成的缓冲剂包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和tris-HCl，通常浓度为约5mM至50mM。合适的盐包括氯化钠、碳酸钠、氯化钙等。其他添加剂(如螯合剂、肽酶抑制剂等)也是适用的，所述添加剂一旦溶解在肺中后即可促进I型IFN的生物活性。例如，乙二胺四乙酸(EDTA)可用作作为肽酶辅因子的二价阳离子的螯合剂。

在制备本发明的药物时，可使用和操作各种制剂修饰以改变药代动力学和生物分布。改变药代动力学和生物分布的多种方法是本领域技术人员已知的。这类方法的示例包括保护由基质组成的囊泡中本发明的组合物，所述基质是例如蛋白、脂质(如脂质体，参见下文)、碳水化合物或合成的聚合物(上文所述)。对于药代动力学的一般讨论，参见例如《雷明顿》，第37-39章。

本发明的药物组合物可根据给药方法以多种单位剂型给予。典型的调节性药物组合物的剂量是本领域技术人员熟知的。这类剂量通常建议是天然的并根据特定治疗环境、患者耐受性等进行调节。适用于实现该治疗的调节剂的量被定义为“治疗有效剂量”。对该应用有效的剂量安排和量(即“剂量方案”)可取决于多种因素，包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重程度、患者健康的一般状态、患者的身体状态、年龄、活性剂的浓度和药物制剂等。在计算用于患者的剂量方案时，还应考虑给药模式。剂量方案中还必须考虑到药代动力学，即药物组合物的吸收速率、生物利用度、代谢、清除等。参见例如，最新版本的《雷明顿》；Egleton(1997)“Bioavailability and transport of peptides andpeptide drugs into the brain(肽和肽药物至大脑的生物利用度和运输)”Peptides18:1431-1439；Langer(1990)Science 249:1527-1533。

适用于可注射应用的药物形式包括无菌水溶液(水溶性)或分散体和用于临用前制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，或者可以是乳膏或其他适用于局部应用的形式。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用涂覆材料(如卵磷脂)、通过在分散体情况下保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等带来对微生物作用的防止。在很多情况中，优选包括等张剂，例如糖类或氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注射组合物的吸收。

通过将合适溶剂中所需量的活性化合物掺入不同的其它上述组分后过滤灭菌制得无菌注射液。通常，将不同的无菌活性成分纳入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散液。当制备无菌注射液制备所需的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。

下面参照以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1

方法

免疫纯化

根据Parker及其同事开发的方案(Parker等，2008)进行免疫纯化，其中使用α-小鼠-Ep-CAM抗体(BD法敏进公司(BD Pharmingen)，克隆G818)代替上皮选择抗体。通过CD31、vWF和P1H12(内皮群体)、CD45(造血群体)和Ep-CAM、CK18和CK19(上皮群体)和NeoR(肿瘤特异性群体)的RT-PCR分析评估群体的纯化(数据未显示)。

微阵列分析

使用RNeasy试剂盒(德国希尔敦的凯杰公司(Qiagen))提取RNA。使用GC基因表达3’扩增、双循环目标标记试剂盒(美国加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞公司(Affymetrix))对RNA进行扩增、标记和片段化，其中使用MegascriptT7试剂盒(美国德克萨斯州奥斯汀的安碧公司(Ambion))进行第一次体外转录。使用昂飞小鼠430v2.0基因表达阵列以测定表达水平。在Genespring GX 7.3(美国加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦技术公司(Agilent Technologies))中进行数据分析。使用RMA文件处理器导入数据并将小于0.01的测量设置为0.01。使各匹配的脊椎转移性上皮样品和各原发肿瘤上皮样品对相应的原发肿瘤上皮样品进行标准化。各样品根据组织类型进行分组。使用t检验p值设为0.05的置信过滤器以最小化数据组中在原发肿瘤上皮和转移性上皮之间不发生表达变化的基因的数目。使用错误发生率为0.03的ANOVA(参数测试，不假定等方差)以鉴定差异表达的基因。可在GEO上在线评估整个数据组。使用Genespring GX 7.3中的基因本体学特征进行基因本体学分析，使用GenBank、LocusLink和UniGene构建本体学表。进行使用Genomatix(德国慕尼黑的GS公司(Genomatix Software GmbH))的集中启动子分析，其中使用顶部三个本体中随机选择的基因。随后使用干扰素刺激反应元件(ISRE)共有结合序列以在Genespring GT 1.0(美国加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦技术公司)中对差异表达基因进行非集中启动子分析，其中序列数据来源于MouseGenome9999序列文件(美国加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦技术公司)。

INTERFEROME分析

通过p值<0.05和倍数变化>2来过滤表达数据以鉴定原发肿瘤上皮和转移性上皮之间显著差异表达的基因。将基因定位于Ensembl release 59基因模型并使用INTERFEROME(IFN调节基因的数据库)分析所得基因列表的IFN签名。通过应用Χ²检验测定显著性。

转录因子结合位点富集分析

通过Ensembl Bioperl API从Ensembl release 59中提取推定的近端启动子序列，其是相对于标注的转录起始位点5’上游1500bp和下游200bp(Culhane等2010，同上)。使用先前描述的Transfac Professional(版本2010.3)位置权矩阵(Matys等，Nucleic Acids Res 34:D108-110(2006))的CLOVER算法(Frith等，Nucleic Acids Res 32:1372-1381(2004))鉴定基因集合中的转录因子富集。来自完整INTERFEROME基因列表和22732个Ensembl蛋白编码基因的启动子被用作背景集合，其中应用了0.01的p值阈值和1000随机化。使用TransfacProfessional(版本2010.3)的MATCH算法进行转录因子结合位点的鉴定，其中应用过滤器以最小化假阳性。通过INTERFEROME启动子可视化脚本显示转录因子结合位点。

对通过INTERFEROME分析鉴定的540个受抑制基因进行启动子富集分析和结合位点鉴定。CLOVER和MATCH算法中都应用了Transfac Pro 2010.3矩阵。

细胞培养和分子技术

66cl4和4T1细胞系由Fred Miller博士(密歇根州底特律的卡尔马诺斯癌症研究所(Karmanos Cancer Institut))友情提供。4T1.2系的来源已在先前描述(Eckhardt等2005，同上；Lelekakis等1999，同上)。以1000IU/mL的剂量使用重组干扰素α₁。干扰素α受体阻断抗体(MAR1-5A3)的使用浓度为10μg/mL(密苏里州圣路易斯的莱科公司(Leinco))。根据生产商的指导进行G-CSF ELISA(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&DSystems))。使用标准技术进行流式细胞术。以1:200的稀释使用Ly6G(克隆IA8)和CD11b(克隆M1/70)特异性抗体(美国新泽西州富兰克林湖市的BD法敏进公司(BD Pharmingen))来评估MDSC。使用LSR-II进行流式细胞术(加利福尼亚州圣何塞的BD法敏进公司)。使用标准技术进行实时RT-PCR。使用磺基罗丹明B结合试验来评估体外扩增，如先前所述(Eckhardt等2005，同上)。使用标准技术进行免疫组化，使用浓度为5μg/mL的抗小鼠Irf7(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的甾酶/英杰公司(Zymed/Invitrogen))α-人Irf7(美国新泽西州富兰克林湖市的BD法敏进公司)。

CFSE T淋巴细胞抑制试验

将MDSC和CFSE标记的脾细胞混合物一式三份地置于96孔圆底板中。以1:1、1:2、1:4、1:8和1:16的比例共同培养抑制细胞和反应细胞，其中各孔中的反应细胞数目相同(100,000个细胞/孔)。使用40ng/ml的抗CD3(克隆145-2c11，美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences))和抗CD28抗体(克隆37.51，美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BDBiosciences))刺激细胞。将各孔中培养基的总体积调节为175μl。将细胞在37℃下孵育72小时，使用流式细胞术通过CFSE稀释测量细胞增殖。使用特异性抗体(抗小鼠CD4-APC，克隆GK1.5，电子生物科学公司(eBioscience)；抗小鼠CD8a PE-Cy7，克隆53-6.7，电子生物科学公司)评估CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞。

小鼠试验

雌性Balb/c小鼠(6-8周龄)获自ARC(澳大利亚珀斯)或沃尔特与伊丽莎-霍尔研究所(Walter and Eliza Hall Institute)(澳大利亚基尤)繁育设施。雌性NSG小鼠获自得到Jackson实验室许可的WEHI繁育设施且Balb/c Ifnar1^–/–(Hwang等1995，同上)在内部繁育。以10⁵IU/剂量的剂量每周3次经腹膜内注射重组IFN-α1。所有其他小鼠试验均使用标准技术进行。使用先前描述的试验来评估转移(Eckhardt等2005，同上)。小鼠研究得到了Peter MacCallum动物伦理学实验委员会的批准。

统计

对转移数据进行log₁₀转化以用于显示。除非另有说明，否则所有统计都是对未转化的数据进行的斯氏T检验。点图和直方图是平均值且误差线是S.E.M.。所有统计都是使用Microsoft Excel中的数据分析包和GraphPad Prism 5中的分析工具进行的。使用GraphPad Prism 5进行卡普兰-迈耶存活分析并使用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验以确定显著性。存活分析中使用了四个公众可得的具有已知远端复发第一位点的乳腺癌微阵列数据集：GSE2034、GSE12276、GSE2603、NKI295，如Harrell等(2012，同上)所述。将Irf7基因集合作为连续变量处理并定义为包含预测的Irf7推定结合位点的540个IRG内208个基因亚组的平均基因表达(包括Irf7，图7)。

免疫纯化

免疫纯化根据Parker及其同事的实验方案进行(Parker等2008，同上；Parker等，Cancer Res 64:7857-7866(2004)；St Croix等，Science(New York,N.Y)289:1197-1202(2000))，其中使用α-小鼠-Ep-CAM抗体(美国新泽西州富兰克林湖市的BD法敏进公司)代替上皮选择抗体。简言之，处死小鼠并收集组织。在含有3mg/mL胶原酶A(德国曼海姆的罗氏诊断公司(Roche DiagnosticsGmbH))的DMEM中分解组织并在37℃下消化90分钟，随后通过100μm和70μm尼龙滤器过滤并在碱性缓冲液(150mM NH₄Cl，1mM KHCO₃，0.1mMEDTA)中裂解血红细胞。通过与pan-B和pan-T DynaBeads(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen))在4℃下孵育20分钟来除去B淋巴细胞和T淋巴细胞。随后通过与预偶联至大鼠抗小鼠EP-CAM抗体(美国新泽西州富兰克林湖市的BD法敏进公司)的绵羊抗大鼠DynaBeads(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)在4℃下孵育30分钟来选择上皮细胞。

增强的基因表达

我们使用了pMSCV逆转录病毒表达载体(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆泰克公司(Clontech))来增强Irf7的表达。使用脂质转染胺试剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)将空质粒和含有带flag标签的Irf7构建体转染至HEK-293包装细胞中。过滤调节培养基并与目标4T1.2细胞孵育。随后使用嘌呤霉素选择4T1.2细胞，克隆单个细胞并收集多个克隆。

使用基因表达数据集的远端转移存活分析

存活分析中使用了四个公众可得的具有已知远端复发第一位点的乳腺癌微阵列数据集：GSE2034、GSE12276、GSE2603、NKI295，如先前Harrell等(2012，同上)所述。下载标准化的基因表达数据。将Irf7基因签名作为连续变量处理并定义为包含预测的Irf7推定结合位点的540个IRG内208个基因亚组的平均基因表达(包括Irf7，图7)。将探针定位至EntrezGeneID并在存在多个探针时使用具有最高变异的探针。依比例调整基因表达值，使得分位数2.5％和97.5％分别等于-1和+1。该缩放比例对异常值是稳健的并允许各微阵列数据集之间的比较(Haibe-Kains等，J Natl Cancer Inst 104:311-325(2012))。使用Cox比例回归模型以预测与作为连续变量的Irf7签名表达相关的骨远端复发的危险比和95％置信区间，并调节经典预后因素：肿瘤尺寸(T1对比T2)、结状态(阳性对比阳性)、雌激素受体状态(阳性对比阳性)和组织学评级(1级对比2级对比3级)，其根据数据集分组并使用似然比χ2值的变化。卡普兰-迈耶方法用于绘制存活曲线且对数秩p检验用于评估跨级的存活差异。总的来说，存在855名患者的患者数据，其中第一复发位点是骨(n＝238)、大脑(n＝49)、肺(n＝101)和肝(n＝107)。对于骨无复发存活的分析，检查非骨事件(即肝、肺和大脑)(对于非骨存活的分析，反之亦然)。注意，单独对大脑、肺和肝非复发存活的分析也是不显著的(对数秩P分别为0.4、0.8和0.56)。使用斯皮尔曼(Spearman's)ρ统计(R_s)进行校正。使用R 2.9.2版(http://www.r-project.org/)和SPSS 20.0版(伊利诺伊州芝加哥的SPSS公司)进行分析。

实时RT-PCR(RNA表达分析)

使用Trizol(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)提取RNA并使用标准技术逆转录cDNA。使用SYBR试剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行实时PCR。使用以下引物序列：

GAPDH正向5’-TCCCACTCTTCCACCTTCGA-3’(SEQ ID NO:1)

反向5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ ID NO:2)，

Irf7正向5’-CCACACCCCCATCTTCGA-3’(SEQ ID NO:3)

反向5’-CCTCCGAGCCCGAAACTC-3’(SEQ ID NO:4)，

Irf9正向5’-GCTCTAGCCATAGCCAAGAGAATC-3’(SEQ ID NO:5)

反向5’-TCCAGTAAATGTCGGGCAAAG-3’(SEQ ID NO:6)，

STAT1正向5’-CGCGCATGCAACTGGCATATAACT-3’(SEQ ID NO:7)

反向5’-AAGCTCGAACCACTGTGACATCCT-3’(SEQ ID NO:8)，

G-CSF正向5’-AGGTACGAAATGGCCAGGACA-3’(SEQ ID NO:9)

反向5’-TGGCAGCAGATGGAAAACCTAG-3’(SEQ ID NO:10)。

基于设置在DNA扩增的线性区域内的循环阈值(CT)计算各基因的表达水平。相对转录本丰度(RTA)形式的表达水平(任意单位)的计算公式为RTA＝10000/(2^ΔCT)，其中ΔCT＝CT(感兴趣的基因)–CT(GAPDH)。

小鼠转移、存活试验和体内抗体消耗

这些技术先前由Eckhardt及同事描述(Eckhardt 2005)。简言之，将10⁵个细胞接种至雌性6-8周龄Balb/c小鼠的第4个乳房脂肪垫中。每周三次通过卡钳测量监测肿瘤体积。当任何动物都显示不适迹象(通常是第28-35天)时通过过量的异氟烷处死所有动物。通过基于Q-PCR的试验检测次级组织中的瘤荷，其中使用插入4T1.2细胞基因组的报告序列。以相同方式进行存活试验，不同之处在于第22天时使用盐酸氯胺酮(1.2μg/g小鼠)/盐酸阿密替林(xylaxilhydrochloride)(3μg/g小鼠)的组合或100％氧气中2.5％气溶胶异氟烷来麻醉小鼠并通过手术移出原发肿瘤并称重。在小鼠显示不适迹象后，单个而非以组为单位收集小鼠。处死时，除非另有说明，所有小鼠都具有骨和肺转移癌的迹象。以50μg/剂量在第-1、0、1、4、7和随后的每7天腹膜内注射抗CD8(克隆53-6.7，内部生产)和对照抗体大鼠IgG2a(克隆2A3，内部生产)。兔抗唾液酸基GM1购自瓦克化学品公司(Wako chemicals)并根据生产商说明书进行腹膜内注射。

组织学和免疫组化

除了一例外，所有组织都在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时。在室温下，在20％EDTA中对骨脱钙，持续14天。通过Peter MacCallum癌症中心组织学设施或Peter MacCallum癌症中心病理部对所有组织进行石蜡包埋并切片。还通过相同的组织学设施进行H&E染色。该例外是在约翰霍普金斯医院由P.A.对配对的原发乳腺癌和来自相同患者的造血转移癌进行独立系列的组织微阵列，大多数样品在先前所述的快速尸体解剖中收获(Wu等2008；Cimino等，Breast Cancer Res Treat 123:701-708(2010))。使用标准免疫组化技术以制备用于染色的切片。热抗原修复在柠檬酸盐缓冲液(10mM柠檬酸三钠，pH 6.0)中进行，在125℃和压力下持续3分钟。α-小鼠Irf7抗体获自英杰公司(克隆zm7)，α-人/小鼠Irf9抗体获自阿柏堪穆公司(abcam)(目录号#ab51634)且α-人Irf7抗体获自BD法敏进公司(目录号#AHP1179)。

干扰素αELISA

IFN-αELISA使用标准分子生物学技术进行。抗体克隆RMMA-1用作捕获抗体(美国新泽西州皮斯卡塔韦的PBL干扰素源公司(PBL InterferonSource))且兔多克隆抗鼠IFN-α用作检测抗体(美国新泽西州皮斯卡塔韦的PBL干扰素源公司)。以50,000/mL的密度接种细胞并在使用载剂对照或10μg/mL的聚(I:C)处理24小时前允许粘附4小时。

Ly6G⁺细胞制备(MDSC制备)

通过心脏穿刺采集小鼠血液并取出脾并制备单细胞悬液。通过将细胞重悬在1ml的血红细胞裂解缓冲液(含有150mM NH₄Cl，1mM KHCO₃和0.1mMEDTA)中在室温下反应5分钟以裂解血红细胞。随后将细胞清洗两次并以5×10⁷个细胞/ml重悬在FACS缓冲液(含有0.1％叠氮化钠，2％FCS和2mMEDTA)中。基于Ly6G和CD11b的表达(Ly6G⁺CD11b⁺)选择Ly6G⁺MDSC细胞。使用FACSDiVa细胞分选器(美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)和FACSAria II细胞分选器(美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)进行细胞分选。包括了各荧光染料的未标记样品和单个标记对照，用于调定电压和补偿参数。

CFSE标记

制备了脾细胞单细胞悬液。将细胞重悬于含2mM EDTA的20mL PBS中并随后使用1μM CFSE(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)进行标记。在室温下孵育7分钟后，使用含5％FCS的α-MEM充满试管并在800g下离心5分钟。清洗两次后，将细胞重悬于含5％FCS的α-MEM中。通过流式细胞术分析CFSE对细胞的标记。

MS-HRM

DNA样品

从含有福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的正常乳腺组织、原发肿瘤和匹配的骨转移癌的八个块状材料中切割切片。使用H&E对来自各块状材料的一块3μm切片进行染色以鉴定肿瘤富集区域。由病理学家评估所有病例中的肿瘤细胞含量。选择由至少80％肿瘤细胞含量组成的组织区域用于针手工解剖(needlemacrodissection)。使用甲基绿对各样品的7μm组织切片进行染色并随后进行针手工解剖。

根据Wu等(Wu等，Appl Immunohistochem Mol Morphol 10:269-274(2002))(有轻微改变)使用QIAamp DNA血液小型试剂盒(德国希尔敦凯杰公司(Qiagen))提取DNA。简言之，将来自各样品的针手工解剖的组织立即转移至含有100μL组织裂解缓冲液ATL(凯杰公司)的1.5mL螺纹管中并在98℃下孵育15分钟。随后将管冷却至室温，添加12μL蛋白酶K(20mg/mL)(新泽西州雷克伍德的沃明顿生物化学公司(Worthington BiochemicalCorporation))并在56℃下孵育72小时。每24小时添加额外的12μL蛋白酶K(20mg/mL)。孵育后，添加110μL裂解缓冲液AL并在72℃下孵育10分钟。将反应混合物冷却至室温，添加110μL乙醇并将混合物转移至QIAamp小型离心柱(凯杰公司)以根据生产商说明书进行DNA洗脱。

使用NanoDrop分光光度计2000(特拉华州威名顿市的纳诺乔浦技术公司(NanoDrop Technologies)，赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific))对DNA进行定量并评估其纯度。所有提取的DNA样品的纯度均为1.8-1.9的吸光度A₂₆₀/A₂₈₀比例。

SssI处理

使用CpG甲基转移酶M.SssI(马萨诸塞州伊普斯维奇的NEB公司(NewEngland BioLabs))从正常BALB/c小鼠的500ng提取的肺DNA中制备完全甲基化的对照DNA。如他处所述进行M.SssI处理(Mikeska等，Methods Mol.Biol.791:33-53(2011))。将制备物在-35℃储存。

亚硫酸氢盐处理

根据生产商说明书使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒(凯杰公司)对500ng的DNA进行亚硫酸氢盐修饰。将SssI处理的DNA(完全甲基化的对照DNA)和相应基因组DNA(未甲基化的对照DNA)在终体积为50μL的洗脱缓冲液EB中洗脱两次，而将FFPE来源的DNA在体积为40μL的洗脱缓冲液EB中洗脱两次。将洗脱物在4℃储存。

甲基化敏感的高分辨率解链(MS-HRM)

通过在未甲基化的对照DNA中稀释完全甲基化的对照DNA来制备DNA甲基化标准系列。该DNA甲基化标准品包含100％、50％、25％、10％和0％的完全甲基化的对照DNA。在Rotor-Gene 6000(澳大利亚悉尼的考百特公司(Corbett))上进行MS-HRM(Wojdacz和Dobrovic,Nucleic Acids Res 35:e41(2007))。各DNA甲基化标准品和各样品运行两次，而亚硫酸氢盐未处理的基因组DNA对照和无模板对照仅运行一次。

用于跨Irf7的外显子1的富CpG区域分析的引物序列是：

5’-GAGTGGTTTAAGAGTTTTATATATTTGGTAT-3’(SEQ ID NO:11)和

5’-ACCACACCCTACCTAAACTCTA-3’(SEQ ID NO:12)(区域1)。扩增的区域对应于GenBank登录号AC163434，核苷酸62597-62727。用于与Irf7的内含子1/外显子2边界相关CpG岛分析的引物序列是：

5’-AGATAGCGGGAAGTTAGTAGTTAT-3’(SEQ ID NO:13)和

5’-CTAAATAAACTATCACAAA-CTAAACCCTA-3’(SEQ ID NO:14)(用于区域2)和5’-GGTTTAGTTTGTGATAGTTTATTTAGGT-3’(SEQ ID NO:15)和

5’-CTCAATATAAATTCCTCTACCAAAATAACTA-3’(SEQ ID NO:16)(用于区域3)。扩增的区域对应于GenBank登录号AC163434，核苷酸62250-62388(区域2)和核苷酸62152-62275(区域3)。PCR在0.1mL管中进行，最终反应体积为20μL，在所附缓冲液(1x)(凯杰公司)中含有200nmol/L的各引物、200μmol/L的各dNTP、5μmol/L SYTO 9(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司，生命技术公司)、2.5mmol/L MgCl₂(对区域3是2.0mmol/L)、0.5U HotStarTaq DNA聚合酶以及1μL(对区域3是1.5μL)亚硫酸氢盐修饰的DNA。PCR扩增条件如下：1个循环的95℃反应15分钟，50个循环的95℃反应25秒(对区域3是20秒)、60℃(对区域2是57℃且对区域3是57.5℃)反应20秒(对区域3是15秒)和72℃(对区域3是70℃)反应25秒(对区域3是20秒)。随后立即在97℃保持1分钟，60℃保持1.5分钟并进行60-95℃的HRM步骤，其中每秒上升0.2℃并在每次升温后保持1秒。

用于与Stat1的启动子区域相关的CpG岛分析的引物序列是：

5’-GGTGNGTTGATGGAATAGT-3’(SEQ ID NO:17)和

5’-CNAAAATCTCC-AAAAAACTTTAACAA-3’(SEQ ID NO:18)(N对应于碱基A、C、G和T的混合物)。扩增的区域对应于GenBank登录号AC123752，核苷酸146569-146709。PCR在0.1mL管中进行，最终反应体积为20μL，在所附缓冲液(1x)(凯杰公司)中含有200nmol/L的各引物、200μmol/L的各dNTP、5μmol/L SYTO 9(英杰公司，生命技术公司)、1.75mmol/L MgCl₂、0.5U HotStarTaq DNA聚合酶以及1μL亚硫酸氢盐修饰的DNA。PCR扩增条件如下：1个循环的95℃反应15分钟，50个循环的95℃反应25秒、56℃反应20秒和72℃反应25秒。随后立即在97℃保持1分钟，60℃保持1.5分钟并进行60-95℃的HRM步骤，其中每秒上升0.2℃并在每次升温后保持1秒。

结果

匹配的乳腺肿瘤和脊椎转移癌的概况

肿瘤上皮细胞分离自乳腺中生长的4T1.2原发肿瘤和匹配的脊椎转移癌(Eckhardt等2005)，如先前所述(Parker等，J Pathol 214:337-346(2008))。通过基因本体学分析研究分离自四对匹配的原发肿瘤和骨转移癌的肿瘤细胞的基因表达概况差异(图1)，结果发现免疫和防御应答本体的高度富集(置信水平P<0.003)(表3a)。

代表3061个基因的3547个探针集在脊椎中显著下调了大于等于2倍(P<0.05)，而代表1012个基因的1530个探针集上调(图1)。通过Ensemble标注明确地鉴定基因(Culhane等，Nucleic Acids Research 38:D716-D725(2010))。使用INTERFEROME数据库对3061个受抑制基因的分析鉴定了大量(540)IRG(图1，表4)——显著的代表性过度(over-representation)(P<0.001)。相反地，在上调的基因列表中没有显著的IRG富集。INTERFEROME基因集(540个基因)的启动子富集分析鉴定到了显著的IRF和ISGF-3富集(P<0.001)和IRF/Irf7富集(P<0.001)且进一步分析的鉴定结果是540个IRG中的208个(包括Irf7)含有Irf7结合位点(图7，8)。

Irf7是I型IFN通路的主要调节因子(Honda等，Nature 434:772-777(2005))且本身在来自骨转移癌的肿瘤细胞中受到显著抑制(表5)。原发肿瘤上皮细胞中Irf7的表达且其在匹配的骨转移癌中的缺失通过上皮mRNA的实时RT-PCR(图2a，P<0.001)和免疫组化(图2b)来验证。Irf7转录因子和208个推定目标基因的显著抑制提供了该先天信号转导通路功能重要性的有力证据。

Irf表达缺失的机制可以是直接的表观遗传修饰(甲基化)或直接调控Irf7表达的ISGF3复合物(含有STAT1、STAT2和Irf9)的组分的表达降低(Lu等，J Biol Chem 275:31805-31812(2000))。这些结果显示了后者。对从原发肿瘤和匹配的脊椎转移癌中手工解剖的肿瘤细胞的分析显示跨Irf7的外显子1或Irf7的内含子1和外显子2的边界上没有富CpG甲基化区域(图9a-c)。然而，ISGF3组分(STAT1、Irf9和STAT2)的表达在骨转移癌中下降，与Irf7下调相关(表5)。STAT1表达的缺失不是由于甲基化(图9d)。因此，Irf7表达的抑制机制可能是其上游调节因子ISGF3转录调节因子复合物的下调。与该假说一致，我们检测到原发4T1.2肿瘤中Irf9的细胞核定位(图2b)表示ISGF3易位至细胞核。相反地，在骨转移癌中细胞核染色几乎不可检测，反映了Irf7的表达(图2b)。

Irf7恢复I型IFN信号转导并抑制转移癌

为确定骨转移癌中Irf7的功能贡献，制备过表达Irf7的4T1.2克隆(4T1.2-Irf7，图10a)，其未显示体外增殖的变化(图3a)，即时在使用IFN-α或TLR3激动剂(聚I:C)进行通路刺激的情况也是如此(数据未显示)。通过ELISA确认了预期的IFN-α表达上升(图3b)，并通过qRT-PCR确认了预期的两个IRG(Irf9和STAT1)的表达上升(图10b)。后者是因为I型IFN的二次信号转导，因为Ifnar1中和抗体(Sheehan等，J Interferon Cytokine Res26:804-819(2006))将4T1.2-Irf7细胞中Irf9和STAT1表达降低至对照细胞(4T1.2-BV)中看到的水平(图10b)。实际上，比较4T1.2-Irf7和4T1.2-BV细胞的基因表达的微阵列分析显示在其启动子中含有预测的Irf7结合位点的所有208个基因都受Irf7表达的上调(图11)。此外，与4T1.2-BV肿瘤相比，乳腺肿瘤中细胞核Irf9表达上升(图10c)。因此，通过增强的Irf7表达进行的IFN生产刺激了IFN/Ifnar信号转导通路。

通过增强的Irf7表达对I型IFN通路的恢复被证明降低瘤荷但不影响原发肿瘤生长率(图3c)。重要的是，Irf7过表达导致向脊椎的转移显著减少(图3d)，如PCR和组织学方法所测量的那样。在60％携带4T1.2-BV肿瘤的小鼠中检测到了脊椎大转移癌(macrometastases)，而在携带4T1.2-Irf7肿瘤的小鼠中未检测到(图3e)。

为确认Irf7介导的转移减少可延长存活并依赖向宿主细胞的I型IFN信号转导，将4T1.2-BV或4T1.2-Irf7细胞接种至Balb/c野生型或Ifnar1^–/–(Hwang等，Proc Natl Acad Sci USA 92:11284-11288(1995))小鼠。虽然所有组之间都不存在原发肿瘤生长的差异(图3f)，但增强的Irf7表达导致了野生型小鼠中显著延长的无转移存活(图3g)。相反地，Ifnar1^–/–小鼠较快地死于转移癌且增强的Irf7表达没有抑制转移癌(图3g)，这在所有Ifnar1^–/–动物中都是明显的(图3h)。

综上所述，这些结果显示，Irf7驱动的肿瘤细胞IFN信号转导减少了向骨的转移，且通过Ifnar1的宿主应答对转移癌抑制和相关的存活延长至关重要。

Irf7表达恢复抗转移癌免疫应答

由于宿主IFN应答对转移癌抑制至关重要且先天IFN通路调节了免疫效应细胞的发育和活性(Dunn等2005，同上)，通过接种4T1.2-BV或4T1.2-Irf7细胞至NOD-SCID IL-2rγ^–/–小鼠(NSG)来评估其在该模型中的潜在作用。同样，原发肿瘤以相同速率生长，表明原发肿瘤生长不受免疫系统的约束。重要的是，缺失成熟淋巴细胞的NSG小鼠比同系WT Balb/c小鼠更快地死于转移癌且Irf7的表达不会延长无病存活(图4a)，这与有免疫力的小鼠中的结果相反，其中Irf7具有显著的存活益处(图4a)。这些数据表明，功能性免疫细胞是针对转移癌的Irf7保护所必需的。组织学检查揭示了所有免疫低下动物中的脊椎转移癌(图4b)，这与其存活率下降一致。这些结果显示转移性肿瘤受到免疫系统的限制且Irf7可能通过恢复抗肿瘤免疫应答来抑制转移癌而不影响原发肿瘤生长。

为确定介导Irf7调控的骨转移癌调节的免疫细胞，检测了免疫功能的系统性参数。与原始小鼠相比，携带4T1.2-BV肿瘤的小鼠中外周白细胞(WBC)显著升高并具有脾肿大。该应答在携带4T1.2-Irf7肿瘤的小鼠中下降(图12)。先前4T1模型中的研究检测到了髓系来源抑制细胞(MDSC)的增加，其抑制免疫监督以促进肿瘤生长(Yang等，Cancer Cell 13:23-35(2008)；DuPre和Hunter,Exp Mol Pathol 82:12-24(2007))。Gr1⁺CD11b⁺MDSC在肿瘤携带小鼠的外周血中测量，并检测到相对于4T1.2-Irf7或非骨转移性变体66cl4，该群体在携带高度转移性4T1.2肿瘤的小鼠中显著增加(图4c)。通过对Gr1表达细胞进行免疫组化染色还可观察到MDSC浸润至4T1.2-Irf和4T1.2-BV肿瘤(图13a)。在携带4T1.2-BV肿瘤的小鼠的骨转移癌中检测到较大量的Gr1⁺细胞(图13b)。未检测到来自4T1.2-Irf肿瘤携带小鼠的骨转移癌。由于MDSC由两种主要亚组(Ly6G⁺CD11b⁺中性粒细胞样MDSC和Ly6G^–CD11b⁺单核细胞MDSC)组成(Youn等，J Immunol 181:5791-5802(2008))，在所有4T1.2肿瘤携带小鼠中都检测到两种群体显示显著的Ly6G^hi中性粒细胞MDSC升高。与4T1.2-BV小鼠相比，在4T1.2-Irf7中Ly6G⁺CD11b⁺细胞百分比显著下降(图14)。为证明Ly6G⁺CD11b⁺MDSC活性，将其从4T1.2携带小鼠中分离并证明其抑制CD4⁺或CD8⁺T淋巴细胞的增殖(图4d)。这些数据表明4T1.2-Irf7肿瘤携带小鼠中减少的MDSC群体在功能上能够抑制淋巴细胞活性。

先前的报道将肿瘤MDSC与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)相联系(Waight等，PLoS One 6:e27690(2011)；Adeegbe等，Cell Transplant 20:941-954(2011))。与4T1.2-BV或非骨转移性66cl4肿瘤携带动物相比，在4T1.2-Irf7肿瘤携带小鼠中发现了显著较低的原发肿瘤和血浆G-CSF水平(图15)。4T1.2-Irf7肿瘤携带小鼠中MDSC的减少以及I型IFN能够直接增强T细胞和NK细胞效应功能的能力(Hervas-Stubbs等，Clin Cancer Res 17:2619-2627(2011))表明Irf7介导的转移癌抑制中涉及增强的肿瘤细胞识别。与此一致，在早期时间点，与携带4T1.2-BV肿瘤的小鼠相比，携带4T1.2-Irf7肿瘤的小鼠的外周血中观察到CD4⁺、CD8⁺和NK细胞群体的显著增加(图4e)，此时细胞可能已经内渗进入循环但尚未形成转移癌。为测试其功能，消耗了4T1.2-Irf7肿瘤和4T1.2-BV肿瘤携带小鼠中的CD8⁺T细胞和NK细胞。如同所有先前的体内实验，各种或全部两种细胞类型的消耗都不会改变原发肿瘤生长(图4f)。然而，CD8⁺T细胞和NK细胞的同时消耗显著加速了转移并缩短了存活(图4g)，表明这些效应细胞都参与Irf7/IFN介导的转移控制。重要的是，观察到这些小鼠中骨转移癌发展所导致的瘫痪显著增多，这得到了组织学实验的确认(图16)。总之，这些数据确定Irf7诱导IFN依赖的针对骨转移的免疫抑制依赖于CD8⁺T细胞和NK细胞。

人乳腺癌中的IRF7通路

原发肿瘤中IRF7的表达及其在远端转移癌(包括骨)中的缺失得到了IHC的验证，所述IHC使用了来源于约翰霍普金斯医院快速尸体解剖项目的组织阵列(Wu等，Clin Cancer Res 14:1938-1946(2008))。在这些情况下，显示IRF7在正常乳腺组织(7/10)和原发肿瘤(9/16)中频繁表达。重要的是，在转移癌中观察到IRF7表达下降，其中仅16.7％的远端转移癌表达IRF7(3/18)(相对于原发肿瘤P<0.04，表6)。该组中匹配的原发肿瘤和骨转移癌的分析显示9对、7主要者(primary)表达IRF7，其中仅一个在匹配的骨转移癌中保留了表达(图5a，b中的代表性图像)。还如小鼠组织中所示(图2b)，在大多数情况下骨细胞表达IRF7而肿瘤细胞是阴性的。

为确定人乳腺癌中IRF7通路的临床相关性，使用了具有已知第一远端转移癌位点的855个主要肿瘤的公开可得的基因表达数据集(Minn等，Nature436:518-524(2005)；Harrell等，Breast Cancer Res Treat 132:523-535(2012))。使用先前被描述为Irf7调控的208个基因(图1，图7)与该Irf7签名之间的联系，评估了以第一位点的形式复发为骨和非骨远端转移癌。有趣的是，发现Irf7签名与无骨转移癌存活显著地线性相关，其中与增加的骨转移癌事件相关的Irf7基因集的表达较低(图5c)，而对于其他位点没有观察到关系(大脑、肺和肝，图5d)。预测骨转移癌的能力与雌激素受体状态、淋巴结的参与、肿瘤尺寸和组织学评级不相关(调节的风险比例HR:0.63(95％CI:0.42-0.93)P＝0.021)。总之，这些结果支持小鼠中的数据，即人乳腺癌中Irf7通路对骨转移癌的抑制是重要的。

使用IFN-α₁治疗抑制转移癌

由于Irf7转移癌抑制依赖I型IFN，因此寻求确定IFN给药是否会在骨中反转转移瘤荷。IFN-α₁治疗在体外提高了Irf7的表达，以及4T1.2细胞中Irf9和STAT1的表达(图6a)，这与显示Irf7通过IFN增加Irf9和STAT1表达的数据一致。如同从我们的上述数据中预期的那样，IFN_α1治疗不会影响体外的4T1.2细胞增殖(图6b)和体内的原发治疗生长(图6c)。完全相反地，IFN治疗将向脊椎和股骨的转移降低至不可检测的水平(P<0.007)(图6d，e)。向肺的转移程度未下降(图17)，在IFN治疗的小鼠外周血中观察到下降的MDSC累积和G-CSF水平(图18)。对于无转移存活研究，使用盐水或IFN-α₁对4T1.2携带的小鼠治疗五周，在3周时切除原发肿瘤。同样，IFN-α₁对于原发肿瘤的生长没有影响，但导致显著的无转移存活延长(图6f)。在终点处，该分析中的所有小鼠都死于骨和肺转移癌。这些数据表明治疗性给予IFN-α1可降低转移瘤荷并且是一种值得进一步研究的有效治疗策略。

为具体提供对IFN抑制骨转移癌机制的认识，测量了肿瘤携带动物中IFN治疗对免疫细胞群体的效果。与肺和乳腺相比，骨髓中CD11b⁺Ly6G⁺MDSC的百分比显著较高(图19)。重要的是，IFN治疗显著减少了骨髓和外周血中的MDSC(图18，19a)而非乳腺/原发肿瘤或肺中的MDSC(图19)。此外，IFN治疗后骨髓中的NK细胞显著增加，这是在肿瘤携带动物的原发位点或肺中没有观察到的效果(图19a)。这些数据显示，IFN在骨髓中特异性减少了免疫抑制细胞并增加了效应细胞。此外，来自乳腺和肺的NK细胞主要是CD11b^高/CD27^低(图19b)，表示具有较高刺激阈值的末端分化的细胞(Hayakawa和Smyth,J Immunol 176:1517-1524(2006))。相反地，来自骨髓的大部分NK细胞是CD11b^低/CD27^低(图10b)，表示NK细胞具有较高的效应功能且被报道为对细胞因子(如IFN)的刺激更敏感。

总之，这些数据表明IFN特异性抑制乳腺癌的骨转移的机制是通过选择性调节骨髓中的MDSC和NK效应细胞。

这些研究表明一种这类I型IFN(IFNα1)可以抑制向骨的转移。为确定使用刺激多种I型IFN表达的通路激活剂后转移癌抑制是否会更有力，使用模拟双链病毒感染的TLR3激动剂聚I:C治疗4T1.2携带小鼠。使用聚I:C治疗携带4T1.2肿瘤的小鼠不会改变原发肿瘤生长，如生物发光成像所确认的那样(图20a)。然而，在原发肿瘤切除后，生物发光实验清楚地表明聚I:C治疗抑制了向多个器官的转移(图20b)。通过远端器官中肿瘤细胞标记的PCR检测对其进行确认和定量，其中我们观察到治疗组中肺和骨中转移瘤荷的显著下降(图20c)。

原发肿瘤移除后通过模拟早期治疗环境并起始治疗来减少聚I:C的剂量，仅持续2周，之后检测大的转移癌。还评价了将聚I:C治疗与常用的化疗剂(阿霉素)联用时的值。虽然该短期治疗环境中，单个试剂不会单独地显著影响转移癌，但联合治疗是非常有效的，在终点处出现了明显的转移癌减少(图21)。该项工作表明将IFN激动剂与化疗剂联用具有有力的抗转移癌效果，甚至在剂量减少时也是如此。

本领域技术人员应理解，本文所述发明易于进行除说明书中所述的那些以外的变化和修改。应理解本发明包含所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意和全部组合。

表3

高度转移性的原发肿瘤对比骨转移癌中观察到的全局性基因变化。(a)最重要的20种基因本体。灰色高亮的是涉及免疫调节的类别。(b)在对所有已知的ORF上游启动子区域的初步分析中，免疫相关类别中在原发肿瘤和转移癌之间显著变化的基因的非翻译上游区域中观察到的干扰素刺激反应元件(ISRE)频率。该结果导致使用INTERFEROME分析包分析数据组。

表4

表5

骨转移癌中Irf7的抑制伴随ISGF3复合物表达的下降。倍数变化表示与匹配的原发肿瘤(n＝4)相比，纯化自骨转移癌的肿瘤细胞中表达的下降(由昂飞(Affymertix)微阵列信号测量)。

表6

正常人乳腺、原发肿瘤和远端转移癌中的IRF7表达。使用组织化学方法评价正常乳腺、原发乳腺肿瘤和匹配的转移癌(包括7个骨转移癌)的归档的石蜡包埋切片中的IRF7表达。与原发肿瘤相比，转移癌中的IRF7表达出现了显著的下降(费歇尔精确检验，p<0.04)。

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Claims

1.一种治疗个体中转移癌的方法，所述癌症的特征是异常的IRF7功能，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含上调所述个体中I型IFN水平的试剂。

2.一种上调I型IFN水平的试剂在制造药物中的应用，所述药物用于治疗个体中的转移癌，所述癌症的特征是异常的IRF7功能。

3.如权利要求2或3所述的方法或应用，所述癌症可通过权利要求13-36中任一种所述方法诊断。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法或应用，所述癌症是乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。

5.如权利要求4所述的方法或应用，所述癌症是乳腺癌。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法或应用，所述I型IFN是IFNα或IFNβ。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法或应用，所述试剂是I型IFN蛋白或其功能片段。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法或应用，所述试剂是编码I型IFN或其功能片段的核酸分子。

9.如权利要求1-7中任一项所述的方法或应用，所述试剂是与模式识别受体相互作用的分子。

10.如权利要求9所述的方法或应用，所述模式识别受体是Toll样受体或RLH。

11.如权利要求10所述的方法或应用，所述试剂是TLR7/8激动剂。

12.如权利要求11所述的方法或应用，所述TLR7/8激动剂是咪喹莫特。

13.一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测一个或多个基因在所述肿瘤中的表达，所述基因在其启动子中包含IRF7结合位点，其中，相对于所述基因在相应非转移性肿瘤中的表达水平，所述基因表达水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

14.如权利要求13所述的方法，所述基因选自表1所列基因。

15.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选涉及至少10个基因、至少20个基因、至少30个基因、至少40个基因、至少50个基因、至少60个基因、至少70个基因、至少80个基因、至少90个基因、至少100个基因、至少110个基因、至少120个基因、至少130个基因、至少140个基因、至少150个基因、至少160个基因、至少170个基因、至少180个基因、至少190个基因、至少200个基因或至少208个基因。

16.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选选自表2中的一个或多个基因。

17.如权利要求16所述的方法，所述方法包括筛选筛选表2所列全部基因。

18.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选IFITM3、TLR3、IRF7和IL13RA1。

19.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选CALD1、RUNX1、YWHAZ和HBEGF。

20.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选IL13RA1、CSF2RB、STAT1、CD44、IRF7、IFI44、TLR3和IFITM3。

21.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选IL13RA1、CD86、CSF2RB、STAT1、CD44、IRF7、IFI44、TLR3、IER3、IFITM3、RUNX3和CTSS。

22.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选IFI44、IRF7、CSF2RB、STAT1、TLR3、IL13RA1和IFITM3。

23.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选IFI44、IRF7、CSF2RB、STAT1、TLR3、IFI202B、IER3、RUNX3、CTSS、IL13RA1、IFITM3和CD86。

24.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选RUNX1、SQLE、PDXK、YWHAZ、DDX3X、RBBP4、HBEGF、DAB2和FAM120A。

25.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选RUNX1、SQLE、PDXK、HNMT、CALD1、YWHAZ、DDX3X、RBBP4、THBS 1、HBEGF、DAB2和FAM120A。

26.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选PTPRK和SLC6A6。

27.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选CSDE1、ATP6V1B2、PTPRK、LGMN、CXCL9、TGIF1、NIPA2、SLC6A6、ARG1、CFP、CTSH和ACSL4。

28.如权利要求13或14所述的方法，所述方法包括筛选DHX58、BST2、IFI44、IFIT3、IRF7、STAT1、DSP和USP18。

29.如权利要求18-28中任一项所述的方法，所述方法包括筛选一个或多个其他基因标记。

30.如权利要求13-29中任一项所述的方法，所述方法涉及筛选RNA转录本或由其转录的cDNA。

31.如权利要求13-29中任一项所述的方法，所述方法涉及筛选蛋白表达产物。

32.一种评估来自个体的肿瘤的转移状态的方法，所述方法包括检测所述肿瘤中IRF7、IRF9或STAT1的功能水平，其中，相应非转移性肿瘤中所述IRF7、IRF9或STAT1功能水平的下降表示所述肿瘤的转移性表型。

33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中，作为分析对象的所述肿瘤是原发肿瘤。

34.如权利要求33所述的方法，所述肿瘤是乳腺、结肠、肾、肺、皮肤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、胃、甲状腺或子宫的肿瘤。

35.如权利要求34所述的方法，所述肿瘤是乳腺肿瘤。

36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，所述转移癌是骨转移癌。

37.如权利要求32所述的方法，所述功能水平是通过筛选IRF7、IRF9和/或STAT1的绝对水平来评估的。

38.如权利要求32所述的方法，所述功能水平是通过筛选IRF7、IRF9和/或STAT1的活性来评估的。

39.如权利要求1-38中任一项所述的方法或应用，所述个体是人。