CN108721603B - 干扰素α-1a在制备用于治疗癌症的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及干扰素α‑1a在制备用于治疗癌症的药物中的用途。具体地，本申请涉及干扰素α‑1a在制备用于治疗子宫颈癌、喉癌及胰腺癌的药物中的用途。干扰素α‑1a能够明显抑制HeLa、HeG2、SW1990及MIA‑PaCa‑2细胞的增殖，并促进其凋亡。这提示其可能具有抗宫颈癌、喉癌和胰腺癌的特性与潜力，为癌症的临床治疗提供了新的线索和理论依据。

Description

干扰素α-1a在制备用于治疗癌症的药物中的用途
技术领域
本申请涉及医药生物领域。更具体地，涉及干扰素α-1a在制备治疗子宫颈癌、喉癌或胰腺癌的药物中的用途。
背景技术
干扰素(IFN)属于一种具有广泛生物活性的细胞因子，因具有抗病毒、调节免疫系统、抑制肿瘤细胞增殖等作用而被研究用于治疗癌症。根据干扰素产生的细胞种类、与干扰素作用的受体、干扰素的生物活性等的不同，干扰素主要被分为三大类：干扰素I、干扰素II和干扰素III，其有结构相似性以及功能差异性。被用于临床上的干扰素，如干扰素α、干扰素β，主要属于I类干扰素。由于疾病种类、基因谱等的人种差异，东方市场上的干扰素主要是人干扰素α。
人干扰素α(IFN-α)属于I型IFN，其诱导对病毒感染和癌症的固有免疫反应[1-3]。鉴于其在抗病毒感染方面的免疫治疗功效，IFN-α已被研制成不同类型的药物，如重组型干扰素α-1、聚乙二醇化的干扰素α-2a和干扰素α-2b[3]。
目前，已知有至少23种不同的IFN-α变体或亚型，分子量从19kDa至26kDa 不等，长度约156至172个氨基酸残基。所有的IFN-α变体或亚型在第115至151 位都具有保守序列区域，而N段序列通常变异较大。
IFN-α通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡或抑制致癌基因的表达来展现其抗癌作用[4-9]。IFN-α被越来越多地用在临床当中来治疗各种恶性疾病，比如肝细胞性肝癌(HCC)、黑色素瘤和肾癌(RCC)[10-14]。
CN102614497A公开了一种采用人干扰素α来治疗或预防HPV相关疾病的方法，其中人干扰素α选自IFN-α1b、IFN-α2a、IFN-α2b。关燕清等人2005(功能高分子学报，2005第18卷210-214页)报道，将IFNα(Roche的Roferon-A)和 IFNγ固定在细胞培养聚苯乙烯板上，观察到了共固定化的IFNα和IFNγ对Hela 细胞产生了体外抑制活性。然而，目前尚未有干扰素α-1a(IFN-α-1a)单独或者和其它药物组合用于治疗子宫颈癌、喉癌和胰腺癌的报道。
子宫颈癌在世界范围内是女性健康的首要威胁，目前对于这种疾病尚无治愈的方法，尤其是对于HPV(HPV16和HPV18)感染的高风险患者[15、16]。标准的治疗方法比如子宫颈锥形切除，是早期宫颈癌治疗的常用策略，但是对于HPV 感染的高风险患者是不推荐的[32]。此外，大多数患者还要接受放疗和化疗。因为副作用大以及HPV感染仍然存在于癌组织中，这些治疗方法都不是理想的[33]。近期，免疫疗法备受关注，因为这种方法能够增强HPV特异性的细胞免疫应答，这对于消除HPV特异性的赘生物是非常重要的[16,34]。
有文献报道，宫颈腺癌预后较宫颈鳞癌差，这可能与其生物学行为、对治疗的反应与鳞癌不同有关。宫颈腺癌起源于宫颈管内膜，常向内浸润生长。患者早期可无症状或出现与其他妇科疾病症状相同的表现(如阴道排液、不规则出血等)，因此容易使患者没有及时就诊而延误病情。宫颈鳞癌倾向于局部浸润性生长，早期很少通过血行发生远处转移，而腺癌多为内生型，病变发生在宫颈间质的较深部位，易向宫颈组织深层浸润，侵犯血管淋巴间隙，故更易发生盆腹腔淋巴结及远处转移，这是宫颈腺癌预后较差的主要原因之一(董虹等人，宫颈腺癌与鳞癌生物学行为比较及宫颈腺癌预后相关因素分析.华中科技大学学报2010年39卷2 期254页)。因此，本领域仍然强烈地需要寻找新型且有效的治疗方法。
喉癌属于头颈部位第二大常见恶性肿瘤，喉癌分原发性和继发性两种。原发性喉癌指原发部位在喉部的肿瘤，以鳞状细胞癌最为常见。继发性喉癌指来自其他部位的恶性肿瘤转移至喉部，较为少见。喉癌因具有很强的转移侵袭能力并且患者的生存率较低，提高喉癌患者的生活质量甚至生存率是有重大医学意义的。目前治疗喉癌常规的方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗，生物治疗目前虽有部分报道，但其多数处于实验阶段，生物治疗包括重组细胞因子、过继转移的免疫细胞、单克隆抗体、肿瘤分子疫苗等。
胰腺癌是一种高侵袭性及高致命性的癌症。除具有高侵袭性特性外，胰腺癌病人在临床诊断时就已发现癌细胞呈局部或广泛性播散，并且也呈现治疗性抵抗等重要特性。世界范围内常见的癌症中，胰腺癌位列第12位，而死亡率则位列第 5位。胰腺癌的预后很差，确诊后病人的平均存活时间仅为2-8个月，五年生存率也低至5％。目前治疗胰腺癌的一线用药主要是五氟嘧啶-奥沙利铂-伊利替康 (FOLFIRINOX)或蛋白结合型紫杉醇(Nab-paclitaxel)加吉西他滨，这两种药物组合分别针对年龄小于或大于65岁的，无并发症，且体力状态(PS)评分为0～1的病人 (World J Gastrointest Oncol 2016 September 15；8(9):682-687)。胰腺癌治疗预后差的主要原因是病人很快出现对化疗药物的抵抗。目前二线用药主要要看病人的具体情况来制定，一般考虑吉西他滨单独给药或与其他化疗药物联合用药，但尚缺少标准规范的二线用药配方。也亟待发现可用于胰腺癌治疗的新型、特异、高效的二线用药组合。
干扰素能抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡的主要是激活肿瘤细胞相应的凋亡通路而促使肿瘤细胞凋亡的。
凋亡是维持机体稳态的一个基本生理反应，涉及许多基因及细胞因子的参与。通过细胞凋亡，机体可以消除体内受损、老化和突变的细胞以保持各种器官和系统的正常功能及稳态[17-20]。三种主要的凋亡途径包括线粒体诱导的内源性凋亡通路、ER应激诱导的凋亡通路、以及死亡受体诱导的外源性凋亡通路。凋亡的产生过程主要由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成员来执行，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活化是凋亡发生的重要标志。其他类型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化代表着不同的细胞凋亡通路[21-24]。例如，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8/10的邻近诱导活化主要出现在外源性凋亡途径，活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶分子被释放到胞浆，继而被切割、激活效应半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、6和7)，最终执行细胞的凋亡[25]。
细胞凋亡时会激活凋亡标志蛋白——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，它们的出现会通过水解400多种蛋白(如下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶蛋白、核蛋白、质膜蛋白、线粒体蛋白等)加速细胞的凋亡，因而被选做是凋亡检测的标志物。细胞凋亡主要有三大通路：内源线粒体凋亡通路、外源线粒体通路及内质网(ER)应激反应通路。三大通路都有相应的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活切割，无活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前体(即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)会被激活并切割成活性有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(即切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)。内源线粒体凋亡通路受Bcl-2蛋白家族的调控，其中Bcl-XL属于促凋亡调节蛋白，Bcl-2家族蛋白通过与线粒体蛋白相互作用调节内源线粒体凋亡通路决定细胞的凋亡与否。当细胞受环境因素刺激将要发生凋亡时，线粒体外膜的透化作用被看做是不可逆转的标志点，也即当线粒体外膜发生透化作用时，细胞即执行凋亡程序，线粒体内源通路激活。细胞色素C是线粒体外膜透化的标志物，线粒体外膜透化，细胞色素C以及凋亡其他相关蛋白从线粒体被释放至细胞质中，最终激活执行半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶—半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7，导致细胞凋亡。另外，89KD的PARP蛋白也被认为是一个非常可靠的凋亡标志物蛋白。当细胞发生凋亡时，PARP被活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白所切割，切割后PARP失活，进一步促进细胞的凋亡。
细胞凋亡的另一主要途径是外源凋亡通路，外源凋亡通路是由细胞膜上的死亡受体介导的。死亡受体如Fas、TNFR1或者TRAIL与死亡配体相互结合，死亡受体胞浆区的死亡结构域(DD)募集相应的衔接蛋白，如FADD，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10，最终诱导细胞的凋亡。
内质网应激(ER stress)，即ER应激，表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱,可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4(鼠相应的蛋白是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12)介导的凋亡通路等信号途径，既能诱导糖调节蛋白(glucose 2 regulated protein 78kD, GRP78)、GRP94等内质网分子伴侣表达而产生保护效应，亦能独立地诱导细胞凋亡。先前的研究也证明内质网应激通路是众多与内源线粒体凋亡通路相互联系的细胞内凋亡信号通路之一，在内质网应激凋亡通路中，内质网应激基因 (GRP78/BiP,CHOP,和ATF4)的表达会上调，位于内质网外膜上、胞浆侧的人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4蛋白(鼠相应的蛋白是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12) 在内质网应激凋亡通路激活中发挥主要作用，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4蛋白会被激活切割。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，本公开提供干扰素α-1a在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自子宫颈癌、喉癌和胰腺癌。
根据一些实施方式，本公开提供干扰素α-1a在制备治疗子宫颈癌的药物中的用途，尤其是人干扰素α-1a在制备治疗子宫颈癌的药物中的用途。
根据一些实施方式，本公开提供干扰素α-1a在制备治疗喉癌的药物中的用途，尤其是人干扰素α-1a在制备治疗喉癌的药物中的用途。
根据一些实施方式，本公开提供干扰素α-1a在制备治疗胰腺癌的药物中的用途，尤其是人干扰素α-1a在制备治疗胰腺癌的药物中的用途。
根据一些实施方式，人干扰素α-1a的氨基酸序列可以见于 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/13128950？report＝fasta。
根据一些具体的实施方式，人干扰素α-1a的氨基酸序列是SEQ ID No.1所示。
其具体序列如下：
MASPFALLMVLVVLSCKSSCSLGCDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSS CLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHELIQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLL DKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAVKKYFRRITLYLTEKK YSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE
在一些实施方式中，子宫颈癌选自：鳞癌、腺癌和腺鳞癌。
在一些实施方式中，子宫颈癌是HPV病毒感染型的；优选但不限于HPV16 或HPV18感染型。
在一些实施方式中，鳞癌包括但不限于高分化鳞癌、中分化鳞癌(也作非角化性大细胞型鳞癌)和低分化鳞癌(也作小细胞型鳞癌)。
在另一些实施方式中，腺癌包括但不限于黏液腺癌和恶性腺瘤(也作微偏腺癌)。
在具体的实施方式中，干扰素α-1a尤其治疗受试者的子宫颈腺癌。
在一些实施方式中，喉癌选自鳞癌。
在具体的实施方式中，干扰素α-1a尤其治疗受试者的喉鳞癌。
在一些实施方式中，喉癌包括但不限于HPV病毒感染型。在可选的实施方案中，所述喉癌是多因素引发的喉癌，包括但不限于HPV6和HPV11病毒感染引发的喉癌。
在一些实施方式中，胰腺癌是高分化、中分化或低分化的胰腺癌。
在一些实施方式中，胰腺癌是胰导管腺癌。
在一些实施方式中，提供了一种用于治疗子宫颈癌的药物组合物，其包含治疗有效量的干扰素α-1a。在另一些实施方式中，药物组合物还含有药学上可接受的基因的裸露核酸或重组蛋白质的载体，其选自：润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳剂、缓冲剂、着色剂、矫味剂和芳香剂。在另一些实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的基因治疗载体，包括重组病毒载体、非病毒载体，所述非病毒载体包括但不限于脂质体、脂类复合物、阳离子多聚物、壳聚糖多聚物、或无机纳米离子载体。
在针对子宫颈癌的一些实施方式中，药物组合物可制备成适合注射、喷雾、栓剂、膏剂、或口服的形式。所述口服的形式包括口服含片。
对子宫颈癌的治疗体现在选自以下的方面：抑制子宫颈癌细胞的增殖、促进子宫颈癌细胞的凋亡。
在一些实施方式中，提供了一种用于治疗喉癌的药物组合物，其包含治疗有效量的IFN-α-1a。在另一些实施方式中，药物组合物还含有药学上可接受的载体，其选自：润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳剂、缓冲剂、着色剂、矫味剂和芳香剂。在另一些实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的基因治疗载体，包括重组病毒载体、非病毒载体，所述非病毒载体包括但不限于脂质体、脂类复合物、阳离子多聚物、壳聚糖多聚物、或无机纳米离子载体。
在针对喉癌的一些实施方式中，药物组合物可制备成适合注射、喷雾、栓剂、膏剂、或口服的形式。所述口服的形式优包括口服含片。
对喉癌的治疗体现在选自以下的方面：抑制喉癌细胞的增殖、促进喉癌细胞的凋亡。
在一些实施方式中，提供了一种用于治疗胰腺癌的药物组合物，其包含治疗有效量的IFN-α-1a。在另一些实施方式中，药物组合物还含有药学上可接受的载体，其选自：润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳剂、缓冲剂、着色剂、矫味剂和芳香剂。在另一些实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的基因治疗载体，包括重组病毒载体、非病毒载体，所述非病毒载体包括但不限于脂质体，脂类复合物、阳离子多聚物、壳聚糖多聚物、或无机纳米离子载体。
在针对胰腺癌的一些实施方式中，药物组合物可制备成适合注射、喷雾、栓剂、膏剂、或口服的形式。所述口服的形式包括口服含片。
对胰腺癌的治疗体现在选自以下的方面：抑制胰腺癌细胞的增殖、促进胰腺癌细胞的凋亡。
在一些实施方式中，所述干扰素α-1a激活内源性线粒体途径和/或内质网应激途径。
附图说明
图1A至图1D：用MTT及CCK-8方法检测干扰素α-1a(下文简写为：IFN-α-1a) 对HeLa细胞增殖的影响。其中：
图1A：细胞增殖的MTT分析。用转染剂量的pcDNA3.0-IFN-α-1a(0、0.5、 3μg)分别处理HeLa细胞48小时。加入MTT试剂进行反应，用分光光度计在波长为490nm处测量反应产物。各数值代表三次平行试验的平均值±SD；
图1B：细胞增殖的MTT分析。用递增浓度的重组蛋白IFN-α-1a(0、50、 200ng/ml)分别处理HeLa细胞48小时。加入MTT试剂进行反应，在490nm处测量反应产物。各数值代表三次平行试验的平均值±SD；
图1C：细胞增殖的CCK-8分析。用转染剂量的pcDNA3.0-IFN-α-1a(0、0.5、 3μg)分别处理HeLa细胞48小时。加入CCK-8试剂进行反应，用分光光度计在波长为450nm处测量反应产物。各数值代表三次平行试验的平均值±SD；
图1D：细胞增殖的CCK-8分析。用递增浓度的重组蛋白IFN-α-1a(0、50、200ng/ml)分别处理HeLa细胞48小时。加入CCK-8试剂进行反应，在450nm处测量反应产物。各数值代表三次平行试验的平均值±SD。
图2A至图2D：流式细胞仪检测IFN-α-1a对HeLa细胞的促凋亡作用。其中：
图2A：转染IFN-α-1a基因表达载体促进HeLa细胞的凋亡。用 pcDNA3.0-IFN-α-1a转染后，对HeLa细胞的凋亡进行流式细胞术分析。HeLa首先接种在12孔板中，转染不同浓度的IFN-α-1a质粒DNA。48小时后，收集细胞进行膜联蛋白V/PI染色，用流式细胞仪进行检测；
图2B：转染IFN-α-1a基因表达载体后，对HeLa细胞凋亡的定量。各数值代表三次平行试验的平均值±SD。*表示p<0.05；**表示p<0.01；
图2C：IFN-α-1a加药促进HeLa细胞的凋亡。IFN-α-1a处理之后，对HeLa 细胞的凋亡进行流式细胞术分析。HeLa首先接种在12孔板中，用不同浓度的 IFN-α-1a处理。48小时后，收集细胞进行膜联蛋白V/PI染色，用流式细胞仪进行检测；
图2D：IFN-α-1a加药处理之后，对HeLa细胞凋亡的定量。各数值代表三次平行试验的平均值±SD。*表示p<0.05；**表示p<0.01。
图3A至图3B：IFN-α-1a可激活HeLa细胞内源性凋亡通路。其中：
图3A：IFN-α-1a表达质粒介导的HeLa细胞凋亡与内源性凋亡途径相关。用pcDNA3.0-IFNα-1a处理HeLa细胞48小时，内源性凋亡途径相关的关键因子的表达的western印记分析。所用探针为Bim抗体、Bcl-xL抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、细胞色素c抗体、PARP1 抗体、切割的PARP1的抗体。β-肌动蛋白的表达作为内对照；
图3B：重组蛋白IFN-α-1a介导HeLa细胞凋亡与内源性凋亡途径相关。用递增浓度的重组蛋白IFN-α-1a(0、50、200ng/ml)分别处理HeLa细胞48小时，内源性凋亡途径相关的关键因子的表达的western印记分析。所用探针为抗Bim抗体、抗Bcl-xL抗体、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、抗细胞色素c抗体、抗PARP1抗体、抗切割的PARP1的抗体。β-肌动蛋白和GAPDH蛋白的表达作为内对照。
图4A至图4B：IFN-α-1a可激活HeLa细胞内质网应激相关的凋亡通路。其中：
图4A：IFN-α-1a表达质粒介导的细胞凋亡和ER应激诱导的凋亡有关。转染 IFN-α-1a表达质粒(pcDNA3.0-IFNα-1a)激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4相关的 ER应激诱导的凋亡。所用探针为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4的抗体；
图4B：重组蛋白IFN-α-1a介导的细胞凋亡和ER应激诱导的凋亡有关。用递增浓度的重组蛋白IFN-α-1a(0、50、200ng/ml)分别处理HeLa细胞48小时，可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4相关的ER应激诱导的凋亡。所用探针为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4的抗体。
图5A至图5B：IFN-α-1a促HeLa细胞凋亡作用不依赖于外源性凋亡通路。其中：
图5A：转染IFN-α-1a质粒到HeLa细胞不能激活外源性凋亡途径。所用探针包括：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10的抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的抗体。β-肌动蛋白和GAPDH的表达作为内对照；
图5B：重组蛋白IFN-α-1a处理HeLa细胞不激活外源性凋亡途径。所用探针包括：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10的抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抗体、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的抗体。β-肌动蛋白和GAPDH的表达作为内对照。
图6A和图6B：RT-PCR及Western印记杂交验证IFN-α-1a的表达。其中：
图6A琼脂糖凝胶图显示IFN-α-1a的RT-PCR产物与pcDNA3.0载体进行连接前的电泳图；
图6B为检测IFN-α-1a蛋白表达的Western印记杂交结果。
图7A至图7D：IFN-α-1a抑制Hep2细胞增殖。其中：
图7A：MTT实验检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞的增殖。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞，继续培养48 小时，收集细胞用MTT检测，用酶标仪在490nm检测不同剂量IFN-α-1a处理的 Hep2细胞的O.D.值大小。图中每个值代表不同剂量IFN-α-1a处理的3次独立重复实验的平均值以及标准差；
图7B：CCK-8实验检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞的增殖。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞，继续培养 48小时，收集细胞用CCK-8检测，用酶标仪在450nm检测不同剂量IFN-α-1a处理的Hep2细胞的O.D.值大小，并且不同剂量IFN-α-1a处理的数量根据O.D.值与细胞数量标准曲线换算得出。图中每个值代表不同剂量IFN-α-1a处理的3次独立重复实验的平均值以及标准差；
图7C：MTT实验检测外加药IFN-α-1a的Hep2细胞的增殖。外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，Hep2细胞继续培养48小时，收集细胞用MTT检测，用酶标仪在490nm检测不同剂量IFN-α-1a处理的Hep2细胞的O.D. 值大小。图中每个值代表不同剂量IFN-α-1a处理的3次独立重复实验的平均值以及标准差；
图7D：CCK-8实验检测外加药IFN-α-1a的Hep2细胞的增殖。外加不同剂量 IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，Hep2细胞继续培养48小时，收集细胞用CCK-8检测，用酶标仪在450nm检测不同剂量IFN-α-1a处理的Hep2细胞的 O.D.值大小，并且不同剂量IFN-α-1a处理的数量根据O.D.值与细胞数量标准曲线换算得出。图中每个值代表不同剂量IFN-α-1a处理的3次独立重复实验的平均值以及标准差；统计分析p<0.05(**,p<0.01)被认为有统计学意义。
图8A至图8D：IFN-α-1a促进Hep2细胞的凋亡。其中：
图8A：流式分析检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞的凋亡。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞，继续培养48 小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析Hep2细胞的凋亡情况；
图8B：流式分析检测外加药IFN-α-1a的Hep2细胞的凋亡。外加不同剂量 IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，Hep2细胞继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析Hep2细胞的凋亡情况；
图8C-图8D：不同剂量IFN-α-1a处理的Hep2细胞流式分析结果定量。图8A、图8B中不同实验组处理的Hep2细胞流式分析定量，图中每个值代表不同剂量 IFN-α-1a处理的3次独立重复实验的平均值以及标准差。统计分析p<0.05(**,p< 0.01)被认为有统计学意义。
图9A及图9B：IFN-α-1a激活Hep2细胞内源线粒体凋亡通路。其中：
图9A：Western印记检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞的内源线粒体凋亡通路主要的标志物。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a 质粒的Hep2细胞，继续培养48小时，收集细胞做western印记，孵育抗Bcl-xL、抗细胞色素C、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、抗PARP抗体，β-肌动蛋白做内参；
图9B：Western印记检测外加药IFN-α-1a的Hep2细胞的内源线粒体凋亡通路主要的标志物外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，Hep2细胞继续培养48小时，收集细胞做western印记孵育抗Bcl-xL、抗细胞色素C、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、抗PARP抗体，β-肌动蛋白做内参。
图10A至图10B：IFN-α-1a激活Hep2内质网应激凋亡通路。其中：
图10A：Western印记检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞的内质网应激凋亡通路主要的标志物。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a 质粒的Hep2细胞，继续培养48小时，收集细胞做western印记，孵育抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4、抗GRP78、抗CHOP、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体，β-肌动蛋白做内参；
图10B：Western印记检测外加药IFN-α-1a的Hep2细胞的内质网应激凋亡通路主要的标志物外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，Hep2细胞继续培养48小时，收集细胞做western印记孵育抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4、抗GRP78、抗CHOP、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体，β-肌动蛋白做内参。
图11A和图11B：IFN-α-1a未激活Hep2外源凋亡通路。其中：
图11A：Western印记检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的hep2细胞的外源凋亡通路主要的标志物。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的Hep2细胞，继续培养48小时，收集细胞做western印记孵育抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 10抗体，β-肌动蛋白做内参；
图11B：Western印记检测外加药IFN-α-1a的Hep2细胞的外源凋亡通路主要的标志物外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，Hep2细胞继续培养48小时，收集细胞做western印记孵育抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10抗体，β-肌动蛋白做内参。
图12A至图12D：IFN-α-1a促进胰腺癌MIA PaCa-2细胞的凋亡。其中：
图12A：流式分析检测外加药IFN-α-1a的MIA PaCa-2细胞的凋亡。外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，MIA PaCa-2细胞继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析MIA PaCa-2细胞的凋亡情况；
图12B：流式分析检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的MIA PaCa-2细胞的凋亡。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒到MIA PaCa-2细胞，继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析MIA PaCa-2细胞的凋亡情况；
图12C：Western印记检测外加药IFN-α-1a的MIA PaCa-2细胞的凋亡情况。外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，MIA PaCa-2细胞继续培养48小时，收集细胞做western印记，分别用抗PARP，抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体孵育，β-肌动蛋白做内参。
图12D：Western印记检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的MIA PaCa-2细胞的外源凋亡通路主要的标志物。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a 质粒的MIAPaCa-2细胞，继续培养48小时，收集细胞做western印记杂交，分别用抗PARP，抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 抗体孵育，β-肌动蛋白做内参；
图13A至图13B：IFN-α-1a促进胰腺癌SW1990细胞的凋亡。其中：
图13A：流式分析检测外加药IFN-α-1a的SW1990细胞的凋亡。外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，SW1990细胞继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析SW1990细胞的凋亡情况；
图13B：流式分析检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒的SW1990细胞的凋亡。转染了不同剂量0、0.5、3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒到SW1990细胞，继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析SW1990 细胞的凋亡情况。
图14A至图14F：IFN-α-1a对其他细胞的凋亡的影响。其中：
图14A至图14C：流式分析检测转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒对HEK293T(图 14A)、HepG2(图14B)和A549细胞(图14C)凋亡的影响。转染了不同剂量0、0.5、 3ug的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒到上述各细胞中，继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析各细胞的凋亡情况；
图14D至图14F：流式分析检测外加药IFN-α-1a对HEK293T(图14D)、 HepG2(图14E)和A549细胞(图14F)凋亡的影响。外加不同剂量IFN-α-1a至培养基浓度0、50、200ng/ml，细胞继续培养48小时，收集细胞用膜联蛋白V/PI双染色，并用流式细胞术分析各细胞的凋亡情况。
具体实施方式
实施例1：IFN-α-1a对人宫颈癌的作用
材料和方法
1.细胞系、细胞培养和试剂
人宫颈癌细胞系HeLa来自基础医学研究所。HeLa细胞在37℃、5％CO2的环境中生长在DMEM高葡萄糖培养基(Gibco)中，其中补充有10％FBS。
兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体、兔抗Bim抗体、兔抗Bcl-xL抗体、兔抗细胞色素c抗体、小鼠抗β-肌动蛋白抗体和兔抗GAPDH抗体购自Santa Cruz Biotechnology。兔抗PARP1和兔抗切割的PARP1抗体购自Epitomics Inc。小鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抗体、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10抗体购自 Bioworld Technology Inc。兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4、兔抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抗体、兔抗切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体购自 Proteintech Group Inc。过氧化物酶缀合的二抗购自中山生物。
pcDNA3.0-IFN-α-1a由本实验室构建。用下列引物以人脑总RNA文模板进行 RT-PCR扩增，得到PCR产物，用HindIII/EcoRI双酶切后回收，连接到pcDNA3.0 (Invitrogen，A150228)的HindIII/EcoRI位点，获得pcDNA3.0-IFN-α-1a。
正向引物：(SEQ ID NO:2)
5-TTAAGCTTATGGCCTCGCCCTTTGCTTTA-3
反向引物：(SEQ ID NO:3)
5-TTGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTCCTTCCTC CTTAATCTTT-3.
人IFN-α-1a购自ProSpec-Tany TechnoGene Ltd(Ness Ziona)。
2.细胞增殖分析
通过MTT或CCK-8分析评价细胞的增殖能力。等量的细胞接种在96孔板中，用IFN-α-1a处理24或48小时。MTT溶液或者细胞计数试剂盒-8(Cell-counting kit-8，CCK-8)溶液(日本Dojindo)加入各孔。孵育2.5-3小时，在490nm或450nm 处测量读值。
3.流式细胞术
通过膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(Biotool公司)检测细胞的凋亡。用 IFN-α-1a处理48小时，收集细胞并用预冷的1×PBS漂洗。细胞沉淀用50μl的1×结合缓冲液(10mMHEPES、pH 7.4、140mM NaCl、1mM MgCl2、5mM KCl、 2.5mM CaCl2)重悬，之后添加5μl膜联蛋白V-FITC和5μl碘化丙啶(PI)。在室温下，将反应混合物避光孵育15分钟。然后，将150μl的上述结合缓冲液加入混合物中。反应产物通过Accuri C6(BD Biosciences)进行流式细胞分析。
4.实时定量逆转录PCR
用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA。qRT-PCR中所用的引物总结于表1中。
使用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒II(Takara Biotechnology公司) 将100ng总RNA进行qRT-PCR。在iQ7实时PCR系统(Bio-Rad)上实施qRT-PCR，条件如下：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃30s，重复40个循环。反应产物的离解发生在55至95℃，温度每10s提高0.2℃。β-肌动蛋白的表达作为内对照。
表1.PCR所用引物
Figure DEST_PATH_GDA0001315416780000111
5.Western印记
在裂解缓冲液(1％NP-40、50mM Tris-HCl pH 7.5、120mM NaCl、200μM NaVO4、1μg/ml亮抑酶肽、1μg/ml抑肽酶、1μM PMSF)中，轻微震荡来裂解经过处理的细胞。各个样本的细胞裂解物上样至12％的SDS-PAGE，之后转移至 Hybond硝酸纤维素膜(AmershamBiosciences)。用一抗和二抗相继对膜进行孵育，通过化学发光(Santa CruzBiotechnology)进行检测。
6.统计学分析
所有数据以均值±标准偏差的形式进行计算。通过t检验(双侧，未配对)评价实验组和对照组之间的统计学差异。p值<0.05(*)或0.01(**)时认为差异显著。
结果
1、IFN-α-1a抑制HeLa细胞的增殖
IFN-α已被证明在某些肿瘤细胞类型中具有抑制细胞增殖、诱导凋亡的作用[27]。因此，发明人希望验证IFN-α-1a在HeLa细胞中是否也能够发挥类似的功效。
用pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒转染和IFN-α-1a重组蛋白处理HeLa细胞，细胞增殖抑制(MTT分析结果见图1A至1B)及活细胞数量显著减少(CCK-8分析结果见图1C至1D)，且二者均呈剂量依赖性的降低。上述结果说明，IFN-α-1a能够在一定程度上抑制HeLa细胞的增殖。
2、IFN-α-1a诱导HeLa细胞的凋亡
细胞的增殖抑制往往伴随着凋亡的发生。细胞凋亡时常伴随着细胞形态以及生化指标的变化，其中细胞膜不对称性丧失是细胞凋亡的早期标志，细胞膜不对称性丧失时磷脂酰丝氨酸和核酸出现非正常表现。磷脂酰丝氨酸 (Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将膜联蛋白V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的膜联蛋白V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶 (propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将膜联蛋白V与 PI匹配使用，利用流式分析就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
为了验证IFN-α-1a是否诱发了HeLa细胞凋亡，发明人将处理48h后的HeLa 细胞收集，进行膜联蛋白V/PI双染色，随后的流式细胞检测结果显示，随着 IFN-α-1a剂量增加，膜联蛋白V+/PI+的细胞明显增加(图2A和2B)，这表明 IFN-α-1a诱导了晚期细胞凋亡。
为了验证重组蛋白IFN-α-1a是否诱发了HeLa细胞凋亡，发明人将 pcDNA3.0-IFN-α-1a转染48h后的HeLa细胞收集，进行膜联蛋白V/PI双染色，随后的流式细胞检测结果显示，随着pcDNA3.0-IFN-α-1a转染剂量增加，膜联蛋白 V+/PI+的细胞明显增加(图2C和2D)，这表明IFN-α-1a诱导了晚期细胞凋亡。
3、IFN-α-1a激活线粒体凋亡途径
为了探讨IFN-α-1a诱导的HeLa细胞凋亡究竟涉及到哪些凋亡途径，发明人用IFN-α-1a处理后的全细胞裂解液进行了Western印记，检测了内源性线粒体途径中的重要蛋白：Bim、Bcl-xL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3前体、细胞色素c和切割的PARP-1。
Bcl-xL属于BCL2家族成员，通过阻止线粒体外膜上的Bax/Bak寡聚体的形成来发挥其抗凋亡作用。Bim也属于BCL2家族成员，但功能与Bcl-xL截然相反 [28]。寡聚化的Bax/Bak蛋白复合体插入线粒体外膜，引起膜通透性改变以及细胞色素c的释放，最终激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3而导致细胞凋亡[29]。图3A 和3B显示，分别用pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒转染和重组蛋白IFN-α-1a处理的细胞，随着IFN-α-1a浓度的提高，Bim蛋白表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-XL表达下降，细胞色素c释放增加，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3前体的表达显著降低，切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达提高，PARP表达下调。说明IFN-α-1a可诱导HeLa 细胞内源性凋亡通路的激活。
4、IFN-α-1a激活ER应激诱导的凋亡途径，而非外源性凋亡途径
除了内源性线粒体凋亡途径，外源性凋亡途径和ER应激诱导的凋亡也可能参与到IFN-α-1a诱导的HeLa细胞凋亡过程中。
为此，评价了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、10以及4的表达。如前文中提到，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8和10的激活标志着外源性凋亡通路的发生，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4特异性地定位于内质网的外膜，在ER应激诱导的凋亡中发挥作用[30、31]。
图4A和图4B显示随着pcDNA3.0-IFN-α-1a转染剂量的提高以及重组蛋白 IFN-α-1a加入量的增加，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4的切割显著增加，GRP78和 CHOP表达水平显著上调，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3也被激活，说明IFN-α-1a 可激活内质网(ER)应激反应引起的细胞凋亡。
图5A显示，pcDNA3.0-IFN-α-1a转染剂量的提高，并没有显著改变半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8和10的切割与激活。此外，随着重组蛋白IFN-α-1a的加入剂量提高，也不能显著促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8和10的切割与激活(图5B)。上述结果表明，IFN-α-1a可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4相关的ER应激诱导的凋亡，而不能激活外源性凋亡途径。
以上结果初步证明，除了内源性线粒体凋亡途径，IFN-α-1a的处理还激活了 ER应激诱导的凋亡途径，但不能激活外源性凋亡通路。
实施例2：IFN-α-1a对喉癌的作用
材料与方法
人喉癌细胞系Hep2细胞来自基础医学研究所。Hep2细胞在37℃、5％CO2的环境中生长在DMEM高葡萄糖培养基(Gibco)中，其中补充有10％FBS。
其余同实施例1中的材料与方法。
结果
1、pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒转染Hep2细胞后IFN-α-1a表达验证
不同剂量的构建的pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒被瞬时转染到Hep2细胞中，培养 48小时后收集Hep2细胞并提取RNA。RT-RCR获得有HA标签的IFN-α-1a基因片段，经琼脂糖凝胶电泳验证，实验组获得正确分子大小的IFN-α-1a-HA(参见图 6A)。实验证明pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒成功转染到Hep2细胞中，并且外源 IFN-α-1a-HA基因得到表达(图6B)。
2、转染pcDNA3.0-IFN-α-1a表达质粒可抑制Hep2细胞的增殖
MTT及CCK-8实验是用来分析细胞代谢活性的比色分析方法，其都可间接反映活细胞的数量。MTT及CCK-8实验结果如图7A至图7B所示，实验组转染 pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒到Hep2细胞数量明显少于对照组未经IFN-α-1a处理的 Hep2细胞，并且随着IFN-α-1a剂量的增大，细胞数量减少的越多。由此可见， IFN-α-1a抑制hep2细胞的增殖。
图7C和图7D分别为MMT和CCK-8的检测结果，结果显示：在细胞培养液中加入重组蛋白IFN-α-1a可显著抑制Hep2细胞的增殖，并呈现剂量依赖性效应。
3、IFN-α-1a诱导Hep2细胞的凋亡
流式结果分析发现，实验组转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒(如图8A和图8B所示)或外加药IFN-α-1a(如图8C和图8D所示)共培养的Hep2细胞凋亡的数量明显多于对照组未经IFN-α-1a处理的Hep2细胞，并且随着IFN-α-1a剂量的增大，细胞早期凋亡与晚期凋亡的增加的越多。结果说明IFN-α-1a可以诱导Hep2细胞的凋亡。
4、IFN-α-1a激活内源线粒体凋亡通路
Western印记实验证明，实验组转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒(图9A)或外加药IFN-α-1a(图9B)共培养的Hep2细胞相比较于对照组未经IFN-α-1a处理的 Hep2细胞，内源线粒体凋亡通路的标志物蛋白：Bcl-XL、细胞色素C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、PARP都有激活现象的相应变化。IFN-α-1a处理后的Hep2细胞Bcl-XL表达下调，细胞色素C从线粒体释放量上调，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3被活化切割且量减少，激活切割后的切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3量上调，PARP被激活切割且量减少。Western印记的实验结果说明，IFN-α-1a激活Hep2细胞的内源线粒体凋亡通路，进而诱导Hep2 细胞的凋亡。
5、IFN-α-1a激活内质网应激(ER stress)凋亡通路
Western印记实验证明，如图10A至图10B，实验组转染pcDNA3.0-IFN-α-1a 质粒或外加药IFN-α-1a共培养的Hep2细胞相比较于对照组未经IFN-α-1a处理的 Hep2细胞，内质网应激通路的标志物蛋白：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4、GRP78、 CHOP都有激活现象的相应变化。IFN-α-1a处理后的Hep2细胞GRP78、CHOP都表达上调，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4被活化切割且量减少。最终，凋亡标志物蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3被活化切割且量减少，激活切割后的切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3量上调。Western印记的实验结果说明，IFN-α-1a激活Hep2 细胞的内质网应激凋亡通路，进而诱导Hep2细胞的凋亡。
6、IFN-α-1a未激活外源性凋亡通路
Western印记实验证明，如图11A至图11B，实验组转染pcDNA3.0-IFN-α-1a 质粒或外加药IFN-α-1a共培养的Hep2细胞相比较于对照组未经IFN-α-1a处理的 Hep2细胞，外源凋亡通路的标志物蛋白：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10都没有激活现象的相应变化。IFN-α-1a处理后的Hep2细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶10表达没有变化，未被激活切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8量也未变化。 Western印记的实验结果说明，IFN-α-1a未激活Hep2细胞的外源凋亡通路。
综上，数据表明半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4相关的ER应激诱导的凋亡途径和内源性线粒体凋亡途径彼此独立地被IFN-α-1a所诱导，两条凋亡途径可能处于相互独立的状态。
实施例3：IFN-α-1a对胰腺癌的作用
材料与方法
胰腺癌MIA PaCa-2细胞来自基础医学研究所。MIA PaCa-2细胞在37℃、5％ CO2的环境中生长在DMEM高葡萄糖培养基(Gibco)中，其中补充有10％FBS。
其余同实施例1中的材料与方法。
结果
1、IFN-α-1a对低分化胰腺癌细胞MIA PaCa-2(Int.J.Cancer:19,128-135(1977))具有显著的促凋亡作用。流式结果分析发现，实验组外加药IFN-α-1a(如图12A所示)共培养的MIA PaCa-2细胞,细胞凋亡的数量明显多于对照组未经IFN-α-1a处理的MIA PaCa-2细胞，并且随着IFN-α-1a剂量的增大，细胞早期凋亡与晚期凋亡的增加的越多。但是,实验组转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒(如图12B所示)虽然做增加了凋亡率，但并未显著诱导MIAPaCa-2的凋亡。蛋白印记杂交显示外加药 IFN-α-1a(如图12C所示)和实验组转染pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒(如图12D所示)均显著激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3及PARP，但对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8 的激活没有影响，说明IFN-α-1a可引发胰腺癌细胞MIAPaCa-2的凋亡，并且这种凋亡不依赖于外源性凋亡通路。
2、IFN-α-1a对转移型的胰导管腺癌细胞SW1990(Cancer Research 43, 4393-4401,September 1983)有一定的促凋亡作用。流式结果分析发现，实验组外加药IFN-α-1a(如图13A所示)共培养SW1990细胞，在高剂量时细胞凋亡的数量明显多于对照组未经IFN-α-1a处理的SW1990细胞。但是,实验组转染 pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒(如图13B所示)并未显著诱导SW1990的凋亡。
实施例4：IFN-α-1a对其他细胞的促凋亡作用检测
材料与方法
人胚肾HEK293T细胞，肝癌细胞系HepG2细胞和肺癌细胞系A549细胞来自基础医学研究所。各细胞在37℃、5％CO2的环境中生长在DMEM高葡萄糖培养基(Gibco)中，其中补充有10％FBS。
其余同实施例1中的材料与方法。
结果
为了探究IFN-α-1a对其他细胞是否有促凋亡作用，我们将递增剂量的 pcDNA3.0-IFN-α-1a质粒分别转染人胚肾HEK293T细胞，肝癌细胞系HepG2细胞和肺癌细胞系A549细胞中；或外加药IFN-α-1a到上述细胞中。流式检测显示随着pcDNA3.0-IFN-α-1a转染剂量的增加，HEK293T细胞(如图14A所示)、HepG2 细胞(如图14B所示)和A549细胞(如图14C所示)均未发生明显的凋亡；流式检测还发现随着外加药IFN-α-1a剂量的增加，HEK293T细胞(如图14D所示)、 HepG2细胞(如图14E所示)和A549细胞(如图14F所示)均未发生明显的凋亡。说明IFN-α-1a在HEK293T、HepG2和A549细胞的促调亡作用不敏感。
讨论
传统的治疗喉癌的方法有手术切除、放疗、化疗，这几种方法的预后效果并不十分理想，迫切需要更有疗效的喉癌治疗方法，新型的免疫综合疗法备受关注，有一定的应用前景。干扰素是一种能够调节机体免疫，并被报道参与癌症免疫治疗过程当中。研究干扰素的促凋亡分子机制，有利于进一步阐明干扰素的抗癌机制，为癌症治疗提供一种思路。另外，本发明的结果显示，IFN-α-1a能够抑制Hela 细胞、Hep2细胞和MIA PaCa-2细胞的增殖，促进Hela细胞、Hep2细胞和MIA PaCa-2细胞的凋亡，为IFN-α-1a治疗喉癌、宫颈癌及胰腺癌的动物实验以及临床实验奠定基础。
参考文献：
1.McNab,F.；Mayer-Barber,K.；Sher,A.；Wack,A.；O'Garra,A.Type iinterferons in infectious disease.Nat Rev Immunol 2015,15,87-103.
2.Zitvogel,L.；Galluzzi,L.；Kepp,O.；Smyth,M.J.；Kroemer,G.Type iinterferons in anticancer immunity.Nat Rev Immunol 2015,15,405-414.
3.Caraglia,M.；Dicitore,A.；Marra,M.；Castiglioni,S.；Persani,L.；Sperlongano, P.；Tagliaferri,P.；Abbruzzese,A.；Vitale,G.Type i interferons:Ancient peptides with still under-discovered anti-cancer properties.ProteinPept Lett 2013,20,412-423.
4.Bake,V.；Roesler,S.；Eckhardt,I.；Belz,K.；Fulda,S.Synergisticinteraction of smac mimetic and ifnalpha to trigger apoptosis in acutemyeloid leukemia cells.Cancer Lett 2014,355,224-231.
5.Manna,S.K.；Mukhopadhyay,A.；Aggarwal,B.B.Ifn-alpha suppressesactivation of nuclear transcription factors nf-kappa b and activator protein1 and potentiates tnf-induced apoptosis.J Immunol 2000,165,4927-4934.
6.Omori,R.；Eguchi,J.；Hiroishi,K.；Ishii,S.；Hiraide,A.；Sakaki,M.；Doi,H.； Kajiwara,A.；Ito,T.；Kogo,M.,等人Effects of interferon-alpha-transducedtumor cell vaccines and blockade of programmed cell death-1on the growth ofestablished tumors. Cancer Gene Ther 2012,19,637-643.
7.Shigeno,M.；Nakao,K.；Ichikawa,T.；Suzuki,K.；Kawakami,A.；Abiru,S.；Miyazoe,S.；Nakagawa,Y.；Ishikawa,H.；Hamasaki,K.,等人Interferon-alphasensitizes human hepatoma cells to trail-induced apoptosis through dr5upregulation and nf-kappa b inactivation.Oncogene 2003,22,1653-1662.
8.Yang,B.；Lu,Y.；Zhang,A.；Zhou,A.；Zhang,L.；Gao,L.；Zang,Y.；Tang,X.；Sun,L.Doxycycline induces apoptosis and inhibits proliferation and invasionof human cervical carcinoma stem cells.PLoS One 2015,10,e0129138.
9.Zuo,C.；Qiu,X.；Liu,N.；Yang,D.；Xia,M.；Liu,J.；Wang,X.；Zhu,H.；Xie, H.；Dan,H.,等人Interferon-alpha and cyclooxygenase-2inhibitor cooperativelymediates trail-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma.Exp Cell Res2015,333, 316-326.
10.Gomez-Benito,M.；Balsas,P.；Carvajal-Vergara,X.；Pandiella,A.；Anel,A.； Marzo,I.；Naval,J.Mechanism of apoptosis induced by ifn-alpha in humanmyeloma cells:Role of jak1and bim and potentiation by rapamycin.Cell Signal2007,19, 844-854.
11.Herzer,K.；Hofmann,T.G.；Teufel,A.；Schimanski,C.C.；Moehler,M.；Kanzler,S.；Schulze-Bergkamen,H.；Galle,P.R.Ifn-alpha-induced apoptosis inhepatocellular carcinoma involves promyelocytic leukemia protein and trailindependently of p53.Cancer Res 2009,69,855-862.
12.Krasagakis,K.；Kruger-Krasagakis,S.；Tzanakakis,G.N.；Darivianaki,K.；Stathopoulos,E.N.；Tosca,A.D.Interferon-alpha inhibits proliferation andinduces apoptosis of merkel cell carcinoma in vitro.Cancer Invest 2008,26,562-568.
13.Lesinski,G.B.；Raig,E.T.；Guenterberg,K.；Brown,L.；Go,M.R.；Shah,N.N.；Lewis,A.；Quimper,M.；Hade,E.；Young,G.,等人Ifn-alpha and bortezomibovercome bcl-2 and mcl-1 overexpression in melanoma cells by stimulating theextrinsic pathway of apoptosis.Cancer Res 2008,68,8351-8360.
14.Li,T.；Dong,Z.R.；Guo,Z.Y.；Wang,C.H.；Tang,Z.Y.；Qu,S.F.；Chen,Z.T.；Li,X.W.；Zhi,X.T.Aspirin enhances ifn-alpha-induced growth inhibition andapoptosis of hepatocellular carcinoma via jak1/stat1pathway.Cancer Gene Ther2013,20, 366-374.
15.Trimble,C.L.；Frazer,I.H.Development of therapeutic hpvvaccines.Lancet Oncol 2009,10,975-980.
16.Lee,S.J.；Yang,A.；Wu,T.C.；Hung,C.F.Immunotherapy for humanpapillomavirus-associated disease and cervical cancer:Review of clinical andtranslational research.J Gynecol Oncol 2016,27,e51.
17.Jin,Z.；El-Deiry,W.S.Overview of cell death signalingpathways.Cancer Biol Ther 2005,4,139-163.
18.Klener,P.,Jr.；Andera,L.；Klener,P.；Necas,E.；Zivny,J.Cell deathsignalling pathways in the pathogenesis and therapy of haematologicmalignancies: Overview of therapeutic approaches.Folia Biol(Praha)2006,52,119-136.
19.Plati,J.；Bucur,O.；Khosravi-Far,R.Apoptotic cell signaling incancer progression and therapy.Integr Biol(Camb)2011,3,279-296.
20.Yang,Z.；Zhang,X.Q.；Dinney,C.N.；Benedict,W.F.Direct cytotoxicityproduced by adenoviral-mediated interferon alpha gene transfer in interferon-resistant cancer cells involves er stress and caspase 4activation.Cancer GeneTher 2011,18, 609-616.
21.Johnson,G.G.；White,M.C.；Grimaldi,M.Stressed to death:Targetingendoplasmic reticulum stress response induced apoptosis in gliomas.Curr PharmDes 2011,17,284-292.
22.Xiong,S.；Mu,T.；Wang,G.；Jiang,X.Mitochondria-mediated apoptosis inmammals.Protein Cell 2014,5,737-749.
23.Ashkenazi,A.Targeting the extrinsic apoptosis pathway in cancer.Cytokine Growth Factor Rev 2008,19,325-331.
24.Krelin,Y.；Zhang,L.；Kang,T.B.；Appel,E.；Kovalenko,A.；Wallach,D.Caspase-8deficiency facilitates cellular transformation in vitro.Cell DeathDiffer 2008, 15,1350-1355.
25.Sayers,T.J.Targeting the extrinsic apoptosis signaling pathway forcancer therapy.Cancer Immunol Immunother 2011,60,1173-1180.
26.Wallach,D.；Kang,T.B.；Kovalenko,A.The extrinsic cell death pathwayand the elan mortel.Cell Death Differ 2008,15,1533-1541.
27.Bekisz,J.；Baron,S.；Balinsky,C.；Morrow,A.；Zoon,K.C.Antiproliferative properties of type i and type ii interferon.Pharmaceuticals(Basel) 2010,3,994-1015.
28.Kang,M.H.；Reynolds,C.P.Bcl-2 inhibitors:Targeting mitochondrialapoptotic pathways in cancer therapy.Clin Cancer Res 2009,15,1126-1132.
29.Cosentino,K.；Garcia-Saez,A.J.Mitochondrial alterations inapoptosis. Chem Phys Lipids 2014,181,62-75.
30.Hitomi,J.；Katayama,T.；Eguchi,Y.；Kudo,T.；Taniguchi,M.；Koyama,Y.；Manabe,T.；Yamagishi,S.；Bando,Y.；Imaizumi,K.,等人Involvement of caspase-4 inendoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and abeta-induced cell death.JCell Biol 2004,165,347-356.
31.Obeng,E.A.；Boise,L.H.Caspase-12 and caspase-4 are not required forcaspase-dependent endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis.J Biol Chem2005, 280,29578-29587.
32.Hampson,L.；Martin-Hirsch,P.；Hampson,I.N.An overview of earlyinvestigational drugs for the treatment of human papilloma virus infectionand associated dysplasia.Expert Opin Investig Drugs 2015,24,1529-1537.
33.De Lorenzo,B.H.；Ramos,M.D.；Michelin,M.A.；Murta,E.F.C.Progress inthe use of immunotherapy to treat uterine cervical cancer.Tumori 2009,95,1-7.
34.Van de Wall,S.；Nijman,H.W.；Daemen,T.Hpv-specific immunotherapy:Key role for immunomodulators.Anticancer Agents Med Chem 2014,14,265-279.
35.Kurabayashi,A.；Inoue,K.；Fukuhara,H.；Karashima,T.；Fukata,S.；Kawada,C.；Shuin,T.；Furihata,M.Combination with third-generationbisphosphonate (ym529)and interferon-alpha can inhibit the progression ofestablished bone renal cell carcinoma.Cancer Sci 2015,106,1092-1099.
36.Qu,J.；Zhao,M.；Teng,Y.；Zhang,Y.；Hou,K.；Jiang,Y.；Yang,X.；Shang, H.；Qu,X.；Liu,Y.Interferon-alpha sensitizes human gastric cancer cells to trail-induced apoptosis via activation of the c-cbl-dependent mapk/erkpathway.Cancer Biol Ther 2011,12,494-502.
37.Nihal,M.；Wu,J.；Wood,G.S.Methotrexate inhibits the viability ofhuman melanoma cell lines and enhances fas/fas-ligand expression,apoptosisand response to interferon-alpha:Rationale for its use in combinationtherapy.Arch Biochem Biophys 2014,563,101-107.
38.Alao,H.；Jake Liang,T.Alternative interferons and immunomodulatorsin the treatment of hepatitis c.Liver Int 2014,34Suppl 1,133-138.
39.Caraglia,M.；Marra,M.；Pelaia,G.；Maselli,R.；Caputi,M.；Marsico,S.A.；Abbruzzese,A.Alpha-interferon and its effects on signal transductionpathways.J Cell Physiol 2005,202,323-335.
40.Yokoyama,M.；Nakao,Y.；Iwasaka,T.；Pater,A.；Sugimori,H.Retinoic acidand interferon-alpha effects on cell growth and differentiation in cervicalcarcinoma cell lines.Obstet Gynecol 2001,98,332-340。
序列表
<110> 中国医学科学院基础医学研究所
<120> 干扰素α-1a在制备用于治疗癌症的药物中的用途
<130> 360112CG
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 189
<212> PRT
<213> 人类Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu
20 25 30
Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu
65 70 75 80
His Glu Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser
85 90 95
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu
100 105 110
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg
115 120 125
Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys
130 135 140
Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser
165 170 175
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
180 185
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 2
ttaagcttat ggcctcgccc tttgcttta 29
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 3
ttgaattcct aagcgtagtc tgggacgtcg tatgggtatt ccttcctcct taatcttt 58
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白的正向引物
<400> 4
tccatcatga agtgtgacgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白的反向引物
<400> 5
ctcaggagga gcaatgatct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4的正向引物
<400> 6
ttgctttctg ctcttcaacg 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶4的反向引物
<400> 7
gtgtgatgaa gatagagccc att 23

Claims (18)

1.SEQ ID No.1所示的人干扰素α-1a在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自子宫颈癌、喉癌和胰腺癌。
2.根据权利要求1所述的用途，所述子宫颈癌选自：鳞癌、腺癌和腺鳞癌。
3.根据权利要求1所述的用途，所述子宫颈癌是腺癌型的子宫颈癌。
4.根据权利要求2所述的用途，所述鳞癌选自：高分化鳞癌、中分化鳞癌和低分化鳞癌。
5.根据权利要求2所述的用途，所述腺癌选自：黏液腺癌和恶性腺瘤。
6.根据权利要求1所述的用途，所述子宫颈癌是HPV病毒感染型子宫颈癌。
7.根据权利要求6所述的用途，所述HPV病毒感染型是HPV16感染型或HPV18感染型。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述喉癌是鳞癌。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述喉癌是HPV6病毒感染型喉癌或HPV11病毒感染型喉癌。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述胰腺癌是高分化、中分化或低分化的胰腺癌。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述胰腺癌是胰导管腺癌。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，所述药物还含有药学上可接受的基因的裸露核酸或重组蛋白质的载体，其选自：润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳剂、缓冲剂、着色剂、矫味剂和芳香剂。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，所述药物还含有药学上可接受的基因治疗载体，其选自：重组病毒载体、非病毒载体；
所述非病毒载体选自：脂质体、脂类复合物、阳离子多聚物、壳聚糖多聚物、或无机纳米离子载体。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，其中所述药物选自以下剂型：注射剂、喷雾剂、栓剂、膏剂、或口服剂型。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述口服剂型是口服含片。
16.根据权利要求1、2至7中任一项所述的用途，所述治疗是指抑制子宫颈癌细胞的增殖和/或促进子宫颈癌细胞的凋亡。
17.根据权利要求1、8和9中任一项所述的用途，所述治疗是指抑制喉癌细胞的增殖和/或促进喉癌细胞的凋亡。
18.根据权利要求1、10和11中任一项所述的用途，所述治疗是指抑制胰腺癌细胞的增殖和/或促进胰腺癌细胞的凋亡。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111097049A (zh) * 2020-01-15 2020-05-05 中国医学科学院基础医学研究所 IFN-α与HDACi在制备治疗肿瘤药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1832755A (zh) * 2003-05-23 2006-09-13 佩斯特卡生物医疗实验室公司 使用干扰素治疗严重急性呼吸综合征及其他病毒感染
CN1833721A (zh) * 2006-04-21 2006-09-20 北京国丹药物技术开发有限公司 一种胸腺五肽与干扰素的组合物
CN101671390A (zh) * 2008-09-10 2010-03-17 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途
CN104703620A (zh) * 2012-07-20 2015-06-10 拉筹伯大学 诊断和治疗方法
CN104994866A (zh) * 2013-01-07 2015-10-21 远东超级实验室有限公司 用空间构象改变的重组干扰素治疗肿瘤的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8048849B2 (en) * 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1832755A (zh) * 2003-05-23 2006-09-13 佩斯特卡生物医疗实验室公司 使用干扰素治疗严重急性呼吸综合征及其他病毒感染
CN1833721A (zh) * 2006-04-21 2006-09-20 北京国丹药物技术开发有限公司 一种胸腺五肽与干扰素的组合物
CN101671390A (zh) * 2008-09-10 2010-03-17 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途
CN104703620A (zh) * 2012-07-20 2015-06-10 拉筹伯大学 诊断和治疗方法
CN104994866A (zh) * 2013-01-07 2015-10-21 远东超级实验室有限公司 用空间构象改变的重组干扰素治疗肿瘤的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Interferon Therapy in Juvenile Laryngeal Papillomatosis;Lundquist,P.等;《Otolaryngology-Head and Neck Surgery》;19840831;第92卷(第4期);第386页第1段 *
Interferon α Induces the Apoptosis of Cervical Cancer HeLa Cells by Activating both the Intrinsic Mitochondrial Pathway and Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Pathway;Wei-Ye Shi等;《International Journal of Molecular Sciences》;20161102;第17卷(第1期);第2页2结果部分2.1-2.5和第8页讨论部分、第9页4材料和方法 *
Synergistic effects of interferon-alpha in combination with chemoradiation on human pancreatic adenocarcinoma;Jian-Hua Ma等，;《World J Gastroenterol》;20050314;第11卷(第10期);第1521页方法和结论部分 *

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