CN106701904A - Acsl4基因和表达产物在胃癌诊断与治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ACSL4基因及其表达产物的应用，用于制备胃癌诊断及治疗的产品。本发明的ACSL4基因及其表达产物，可作为诊断胃癌的特异性标志基因；本发明的ACSL4基因及其表达产物，还可作为制备治疗胃癌药物的靶基因，提供新的胃癌治疗途径。

Description

ACSL4基因和表达产物在胃癌诊断与治疗中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及ACSL4基因和表达产物在胃癌检测方面的应用，尤其是在胃癌的检测的应用。本发明还涉及ACSL4基因、蛋白及其激动剂在胃癌治疗中的应用。
背景技术
胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，由于胃癌的发病率高、恶性程度高，已转移以及治愈率低等特征，是目前临床面对的主要健康问题之一。我国是胃癌高发国家，其发病率和死亡率分别高居全部恶性肿瘤的第3位和第2位。胃癌已成为严重威胁人民群众身体健康、阻碍社会经济发展的重大疾病。目前胃癌的治疗主要是手术切除，早期胃癌患者术后5年生存率可达90％以上,但绝大多数胃癌在确诊时已属进展期，失去手术根治机会，5年生存率仅为11％-40％。胃癌晚期主要采取以化疗为主的综合治疗，但化疗药物的严重不良反应限制了疗效，而且胃癌是受多种因素影响、发病机制也极其复杂的癌症。因此,提高胃癌早期诊断率、寻找新的分子靶向治疗药物及转移、复发预警指标等已成为当今胃癌研究中亟待解决的重大问题。
因此，本领域迫切需要开发可用于胃癌诊断的相关蛋白，为了有效地抑制胃癌细胞的生长，本领域迫切需要开发可用于抑制胃癌细胞生长的药物，以提高治疗的特异性和有效性。
发明内容
本发明公开了一种人ACSL4基因及其表达产物的应用，用于制备胃癌的诊断及治疗产品。
本发明的第一方面提供了一种ACSL4基因或ACSL4蛋白的用途，用于制备检测胃癌和/或判断胃癌易感性的试剂或试剂盒；
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：对ACSL4蛋白或mRNA进行定量检测的 试剂以及相应的标签或说明书。
在另一优选例中，所述的试剂包括ACSL4特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。
在另一优选例中，所述的试剂包括检测用芯片，包括核酸芯片和蛋白质芯片。
在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的胃癌相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的胃癌相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与ACSL4基因或mRNA特异性结合的探针。
在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的胃癌相关蛋白的特异性抗体，所述的胃癌相关蛋白的特异性抗体包括抗ACSL4蛋白的特异性抗体。
在另一优选例中，所述的ACSL4蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
本发明的第二方面，提供了一种用于检测胃癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测ACSL4蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测胃癌。
在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
当检测对象的ACSL4相对β-肌动蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的ACSL4相对β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≤1，则提示该检测对象患胃癌的几率高于普通人群。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括：特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片；
在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测人肿瘤组织样品或血液样品；
在另一优选例中，所述的肿瘤组织样品为胃癌样品。
本发明的第三方面，提供了一种ACSL4蛋白、ACSL4基因或其激动剂的用途，被用于制备抑制胃癌细胞生长、增殖和/或迁移的药物，或用于制备治疗胃癌和/或胃癌转移的药物。
本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的抑制胃癌细胞生长、增殖和/或迁移的方法，包括步骤：在ACSL4蛋白或其激动剂存在下，培养胃癌细胞，从而抑制胃癌细胞生长或增殖。
在另一优选例中，所述的方法包括向胃癌细胞的培养体系中添加ACSL4激动剂，从而抑制癌细胞生长或增殖。
在另一优选例中，所述的激动剂包括ACSL4基因或其蛋白或其片段的激动剂。
本发明的第五方面，提供了一种筛选治疗胃癌的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中ACSL4的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中ACSL4的表达量和/或活性；
其中，如果测试组中细胞的ACSL4的表达量和/或活性大于对照组，就表明该测试化合物是对ACSL4的表达和/或活性有促进作用的治疗胃癌的候选化合物。
在另一优选例中，所述的细胞包括：胃癌细胞或正常细胞；
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对胃癌细胞生长或增殖的抑制作用。
在另一优选例中，所述步骤(b)中包括步骤：测试组中，胃癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察胃癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在胃癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察胃癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中胃癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对胃癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗胃癌的候选化合物。
本发明的第六方面，还提供了一种抑制或治疗胃癌的方法，包括步骤：给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的ACSL4激动剂的用途。
在另一优选例中，所述的胃癌包括胃癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A为实施例1中实时定量PCR检测ACSL4mRNA在胃癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，其中，“N”指癌旁组织，“C”指胃癌组织。图片显示39例结果。病人的癌组织中ACSL4基因表达量低于相应的癌旁组织。 图1B显示了免疫组织化学手段检测ACSL4蛋白在人胃癌临床样本中的表达。
图2A显示了ACSL4基因的cDNA序列。图2B显示了ACSL4基因所编码蛋白的氨基酸序列。
图3A显示了过表达ACSL4抑制了胃癌细胞HGC27和SGC7901的细胞生长。Western图示显示ACSL4过表达情况。图3B显示了过表达ACSL4抑制了胃癌细胞HGC27的平板形成克隆的能力。图3C显示了过表达ACSL4抑制了胃癌细胞HGC27和SGC7901的体外迁移能力。
图4A显示了用RNA干扰技术敲低ACSL4在胃癌细胞株MGC-803和AGS中的表达后，细胞生长速度明显增快。Western图示显示ACSL4表达下调情况。图4B显示了在胃癌细胞MGC-803中下调ACSL4蛋白表达促进了该胃癌细胞株的平板克隆形成能力。
图5A，B显示了下调ACSL4促进了胃癌细胞HGC27和SGC7901的体外迁移能力。
图6A显示了下调ACSL4的胃癌细胞MGC-803在裸鼠皮下具有更强的成瘤能力。无论在肿瘤重量上ACSL4下调组比对照组重，同时两组具有统计学意义。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，ACSL4在癌组织中低表达，而在癌旁组织及正常组织中高表达，因此ACSL4可作为胃癌检测的标志物用于检测或辅助性检测胃癌。此外，ACSL4本身及其激动剂可抑制胃癌细胞的生长、增殖和迁移，可以用于作为治疗胃癌的靶点以及药物。在此基础上完成了本发明。
ACSL4蛋白和多核苷酸
在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“ACSL4蛋白”可互换使用，指简称为ACSL4)。应理解，所述术语还包括ACSL4的活性片段和衍生物。
在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码ACSL4蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。ACSL4基因的cDNA序列如SEQ ID NO.:1所示，编码的蛋白如SEQ ID NO.:2所示。
在本发明中，术语“ACSL4蛋白”、“ACSL4多肽”或“胃癌标志物ACSL4”可互换使用，都指具有人蛋白ACSL4氨基酸序列的蛋白或多肽。
ACSL4,长链脂酰CoA合成酶(Long chain acylCoA synthetase)属于多基因家族编码的酶，在体内催化合成脂酰CoA，是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应，因此ACSL在脂肪代谢中起着重要作用。ACSL4在肾上腺中表达最高，也在肝脏和类固醇生成组织中表达，在其他组织中表达很少。据研究ACSL4在部分癌症中有着差异性的表达。例如，在乳腺癌中，有关ACSL4的报道居多，ACSL4可以调控COX-2及前列腺素的表达，从而影响乳腺癌的恶性表型，在恶性度较高的MDA-MB-231中ACSL4的表达水平也较高。ACSL4也可以通过与花生四烯酸的代谢产物发生相互的调控作用，参与到乳腺癌细胞的增殖中。此外，在乳腺癌内分泌治疗耐药的过程中ACSL4也发挥了重要的作用。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的ACSL4蛋白或多肽”是指ACSL4蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化ACSL4蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，ACSL4蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码ACSL4的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发 生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ACSL4蛋白的多核苷酸。
本发明的人ACSL4核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ACSL4蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ACSL4蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人ACSL4蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人ACSL4编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、 高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
抗体
本发明还包括对人ACSL4蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ACSL4基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ACSL4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
抗人ACSL4蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本、或血液样本中的人ACSL4蛋白。
激动剂和药物组合物
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ACSL4蛋白发生相互作用的物质，尤其是激动剂等，如对ACSL4基因或蛋白的表达和/或活性具有促进作用的物质，例如小分子化合物；此外，外源性高表达的ACSL4载体也属于广义的ACSL4激动剂。
本发明ACSL4蛋白的激动剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进ACSL4蛋白的表达和/或活性，进而抑制癌细胞(包括胃癌)的生长或增殖。通常，可将这些激动剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：胃肠内、瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明ACSL4蛋白或其激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡 萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
检测方法和试剂盒
本发明还涉及定量和定位检测人ACSL4蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人ACSL4蛋白水平，可以用于诊断胃癌。
一种检测样品中是否存在ACSL4蛋白的方法是利用ACSL4蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与ACSL4蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在ACSL4蛋白。
ACSL4蛋白或其多核苷酸可用于ACSL4蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗ACSL4的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的ACSL4蛋白。
本发明还提供了一种检测胃癌的试剂盒，它含有特异性扩增ACSL4的引物对和/或ACSL4特异性抗体。
筛选方法
本发明还提供了基于ACSL4进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(促进)ACSL4表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞。一种筛选方法可基于ACSL4的mRNA的表达水平。
其中，代表性的癌细胞包括(但并不限于)：胃癌细胞。
通用方法：
(1)临床组织样本的获取
胃癌及癌旁组织取自手术治疗的胃癌患者，在获取样本前均与患者签订了知情同意书。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取肿瘤原发灶及周围5cm以外的癌旁组织，投入液氮中速冻并移至－80℃冰箱保存，运输时储存于液氮中。癌与癌旁组 织均通过病理专家做出最终诊断。
(2)组织及细胞RNA抽提
采用TRIzol Reagent(Invitrogen)试剂抽提RNA，具体操作如下：
1)研钵、碾杵和匀浆器等器皿洗净，分别再用ddH2O和DEPC H2O冲洗，然后在180℃烘箱中烘约4小时，以去除RNA酶；
2)在研钵中加入适量液氮使之预冷，将组织从液氮中迅速取出，切取约50-100mg大小，在研钵中研磨成粉末；
3)用刮匙将研磨好的组织粉末尽可能完全的移至无RNA酶的EP管中，EP管被预先加入适量体积(1ml)TRIzol试剂，充分匀浆；
4)室温放置5分钟，按比例向离心管中加入氯仿(200μl/1ml TRIzol)，迅速剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟，4℃，12000×g条件下离心15分钟；
5)将上层水相尽可能地转移至新的无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀5次，室温静置10分钟，4℃，12000×g条件下离心10分钟，此时可见RNA沉淀；
6)将上清倒掉，加入75％乙醇(1ml/1ml TRIzol)，混匀，洗涤RNA，离心4℃，7500×g条件下离心5分钟；
7)弃上清，尽可能除尽残留乙醇，沉淀自然干燥5-10min(注意切勿完全干燥)；加入30-50μl DEPC H2O，吹吸几次，溶解RNA沉淀；
8)酶标仪测定RNA浓度及纯度OD 260/280(1.8-2.0)；凝胶电泳观察有无降解，－80℃保存。
细胞株RNA抽提，取对数生长期的细胞，吸取培养液，根据培养皿的面积加入相应量的TRIzol试剂(1ml TRIzol/10cm2)裂解细胞，吹打几次，将裂解下来的细胞收集至无RNA酶的EP管中，其余按照上述步骤4)-8)完成氯仿-异丙醇法分离纯化RNA。
(3)RNA的逆转录
用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)逆转录，操作如下：
1)在无核酸酶的EP管中加入以下组分：
置于PCR仪中，70℃，5分钟，然后立即在冰上冷却5min。
2)在上述体系中再加入以下组分：
轻轻混匀后，置于PCR仪中，37℃，60min。
逆转得到的cDNA置于4℃保存。
(4)实时定量PCR
实时定量PCR反应使用Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd.Dalian,China)的反应体系，利用Thermal CyclerDiceTMReal Time System(TP800实时荧光定量PCR仪，TaKaRa)进行操作。定量PCR的扩增产物长度以80bp-150bp最为合适(可以延长至300bp)。
反应体系如下：
反应条件：
溶解曲线分析步骤：
95℃ 15sec
60℃ 30sec
95℃ 15sec
解离时间为4sec。
荧光本底信号和阈值采用仪器设置的默认值，每次PCR反应结束后会自动生成，Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定阈值(基线荧光强度的10倍)时所经历的循环数；目的基因ACSL4每个模板做3个复管，得到的Ct值取平均值；ACSL4基因的Ct平均值减去相应模板的内参基因(β-actin)的Ct平均值，得到ΔCt。胃癌组的ΔCt减去相应癌旁组织的ΔCt，得到ΔΔCt值，胃癌组和癌旁组中的ACSL4基因的倍数关系用2-ΔΔCt表示。
(5)真核表达载体构建
1)模板：胃癌细胞AGS的cDNA文库。
2)真核表达载体的选择：pcDNATM3.1/myc-His(-)A，5522nucleotides。
3)根据ACSL4mRNA(NM_003137.4)序列，结合表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A的酶切位点设计引物，引物序列为Forward:actggaattcccaccATGGCAAAGAGAATAAAAGCT-3(SEQID NO.:3)；Reverse:5-tccaTTTGCCCCCATACATTCGT-3(SEQ ID NO.:4)。其中反向引物中ACSL4的终止密码子被去除，使得ACSL4的C末端带上c-myc和6xHis标签。利用高保真性DNA聚合酶PrimeSTARTMHS DNA Polymerase(TaKaRa)，以AGS细胞cDNA为模板扩增基因ACSL4全长开放读码框，50μl总反应体系成分如下：
采用两步PCR法(98℃，10sec；60℃，90sec)，扩增35个循环。PCR产物大小约1.9kb，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，割胶回收(胶纯化试剂盒：MACHEREY-NAGEL)符合片段大小的PCR产物。
4)EcoRI，HindⅢ(TaKaRa Biotechnology Inc.Dalian，China)双酶切回收PCR产物及载体质粒pcDNATM3.1/myc-His(-)A，酶切反应体系如下：
37℃酶切反应1小时；割胶回收酶切产物。
5)连接：酶切回收的PCR产物与载体按照摩尔数比(4:1)的比例混合，DNA连接酶体系链接，体系中还包括2.5μl 4×SolutionⅠ(TaKaRa Code：D102A)，ddH2O补齐至10μl，16℃连接2h乃至过夜；
6)转化：取10μl连接产物与100μl感受态细菌(TOP10或DH5α)混合，冰上放置30min，42℃热激90sec，立即置于冰上5min，加入800μl不含抗生素的LB培养液，37℃、200rpm振荡培养30min，使菌体复苏且扩增一代，3000rpm离心2min，去除大部分上清，留50-100μl菌液，,轻轻吹打沉淀混匀，然后均匀涂于有氨苄青霉素抗性(Amp+)的LB平板上，37℃培养12-16小时。
7)克隆鉴定：挑取经过氨苄抗性筛选后生长的菌落在加氨苄青霉素的液体培养基中扩大培养，抽取质粒进行酶切鉴定：取1-2μg小抽质粒用EcoRI，HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段大小，载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A片段大小约5.5kb，ACSL4读码框片段大小约1968bp，符合大小的克隆送测序确认插入片段序列的正确性。
(6)细胞生长曲线的测定
1)将不同种类的胃癌细胞根据其生长特性按3-5×103/100μl/孔计算细胞总量，充分消化细胞后，稀释到所需浓度，接种于96孔板内。每天每组三复孔， 按5-7天接种细胞；
2)待细胞基本贴壁后观察细胞状态和数目。用CCK-8显色剂(Cell Counting Kit-8，DOJINDO，Japan)进行显色反应，每100μl培养液加10μl CCK-8，37℃，5％CO2培养箱放置孵育1h，酶标仪测定450nm处的吸光度，记录，确定细胞实际的起始密度，作为生长相对零点。
3)每天或隔天半量换液，具体视实验要求而定；
4)显微镜下观察细胞形态，固定时间间隔测量，记录细胞生长状况；
5)一般测5至7天。待测定结束后，收集数据进行处理，用Excel绘出图表。
(7)细胞克隆形成实验
1)采用慢病毒构建稳转细胞，过表达或沉默细胞中ACSL4基因的表达；
2)正常培养的稳转细胞，24h后消化计数，按一定数目接种至6孔板中用正常培养液培养不同细胞株数目不同；
3)培养2-3周，直至有肉眼可见的细胞克隆形成；
4)吸去培养皿内的培液，1×PBS洗两次，0.05％的结晶紫溶液中染色2小时；
5)克隆形成染色结果拍照，按照相同的标准(细胞克隆大小)对每个培养皿上的细胞克隆进行计数。
(8)肿瘤细胞体外迁移实验的步骤
1)将事先已被转染且转染效率肯定的胃癌细胞用胰蛋白酶消化，转移至1.5mlEP管中1000rpm，4min离心，弃上清；
2)在各管中加入1ml无血清的MEM培养基，并小心吹打细胞至密度均匀；用细胞计数板计算各管细胞的浓度；
3)向Transwell小室的上面加入5×104个细胞，并补加无血清的MEM至总体积400ul；24孔板孔内个加入800ul的带有10％FBS的MEM培养基；
4)将小室放入孔内，并将24孔板放入5％CO2的37℃恒温培养箱中培养48小时；
5)将小室取出，弃培养基，用多聚甲醛加以固定15min；将小室放入0.05％的结晶紫溶液中染色2小时；用棉花棒小心刮去小室内面的细胞；将小室置于显微镜下观察并计数。
(9)细胞划痕试验
1)器械灭菌，包括直尺和marker笔在操作前用紫外照射30min(生物安全柜内)；
2)用Marker笔在六孔板的背面沿直尺均匀画直线，直线距离0.5-1cm，且贯穿每孔，每孔画5条直线；
3)将稳转后的胃癌细胞按大约每孔4×105的密度接种于六孔板内，放入37℃恒温箱内培养过夜；
4)待细胞密度接近85％，用加样器枪头沿直尺，并垂直于Marker线方向在细胞层上划线，枪头需垂直于培养皿底面，每孔划3条划痕；
5)用PBS缓冲液洗2-3次培养皿，温和地冲洗掉漂浮的细胞，换成含0.1％FBS的MEM培养基2ml；立即置于倒置显微镜下拍照，此时的照片记为0h；
6)之后每12h拍照一次，并将同一位置的不同时间的照片归纳在一起，分别记为24h，36h等。测量细胞划痕的宽度并比较。
(10)蛋白质印迹(Western Blot)
1)蛋白样品制备：培养的细胞吸去培养上清后，用预冷的1XPBS洗两次，加入2×SDS裂解液(100mM Tris-Cl，pH＝6.8，4％SDS，20％甘油)，充分裂解后，沸水浴加热10min，12000×g离心10min，上清转移至新管中，BCA Protein Assay Kit对获得的蛋白进行定量，－80℃保存；
2)蛋白电泳分离：在蛋白样品加入适量含有200mM DTT的上样缓冲液(loadingbuffer)，沸水浴加热10min，稍作离心，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分离样品；
3)转膜：将电泳胶、硝酸纤维膜、厚(薄)滤纸垫板浸于转膜缓冲液中(24mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇)平衡15-20min。按正极–1层厚滤纸垫板–硝酸纤维膜–电泳胶–2层薄滤纸垫板–负极的顺序放好，湿转仪(XCell SureLock TM，invitrogen)30伏转膜30-40min；
4)封闭：5％脱脂奶粉/0.1％PBST作为封闭液，水平摇床，室温封闭30min-2h；
5)一抗：一抗用封闭液稀释(参考抗体说明书推荐浓度)，室温孵育2h或者4℃孵育过夜，0.1％PBST洗三次，每次5min；
6)二抗：荧光二抗用封闭液稀释(1:1000)，室温孵育30min，0.1％PBST洗三次，每次5min；
7)扫膜：ODYSSEY红外成像系统扫描硝酸纤维素膜，保存图像。
(11)裸鼠成瘤实验
1)所用小鼠为5-6周大小的雄性BLAB/c nu裸鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲养于南方模式动物培养中心；
2)取处理后的细胞，以相同数量接种于小鼠皮下(不同细胞种类接种数目不同)，为避免个体差异导致的误差，同种细胞不同处理可左右对称接种于同一只小鼠；
3)待出现可见肿瘤后，每3天监测肿瘤大小，游标卡尺读取肿瘤长径和短径，按以下公式计算肿瘤体积：体积＝长径×短径2；
4)持续监测约7-8次后，整理数据，统计。
(12)抗体获得和免疫检测
1)抗原蛋白获得
从Genebank数据库中获得人ACSL4基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达ACSL4蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白。
2)抗体制备
可采用以下几种方法制备抗体：
a细胞融合法：用上述制备的ACSL4蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。
b利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。
c利用纯化的蛋白免疫动物，制备多抗血清。
3)检测
a用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行胃癌的病理检测，阳性信号为胃癌。
b取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为胃癌可疑病人。
c将ACSL4抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。
实施例1：ACSL4在临床样本中的表达模式
在89对临床样本中，选取了39对临床样本抽提RNA，行实时定量PCR实验，结果显示ACSL4的表达在癌组织中显著低于对应的癌旁组织，且具有统计学意义(图1A)。图1B显示了89对临床样本中ACSL4的表达情况。
实施例2：过表达ACSL4基因抑制胃癌细胞的增殖
通过NCBI网上检索，检索到ACSL4的cDNA序列CCDS 14549.1(图2A，SEQ ID NO.:1)以及其编码的氨基酸序列NP_004449.1(图2B，SEQ ID NO.:2)。为了验证ACSL4在胃癌发生中的功能，首先构建了其真核表达载体，将ACSL4的cDNA克隆进pcDNATM3.1/myc-His(-)A，转染构建的质粒进入胃癌细胞后进行western blot检测，发现ACSL4成功的表达(图3A)。接下来的功能实验生长曲线和克隆形成实验测定结果表明，ACSL4的过量表达抑制胃癌细胞HGC27和SGC7901的增殖能力(图3A，B)；肿瘤细胞体外迁移实验结果显示ACSL4的过量表达抑制胃癌细胞HGC27和SGC7901的体外迁移能力(图3C)。用于构建ACSL4真核表达载体的引物序列为Forward:actggaattcccaccATGGCAAAGAGAATAAAAGCT-3(SEQ ID NO.:3)；Reverse:5-tccaTTTGCCCCCATACATTCGT-3(SEQ ID NO.:4)。
实施例3：沉默ACSL4的表达促进细胞生长
为了进一步验证ACSL4的细胞生长促进功能，我们采取RNA干扰沉默其表达的方式检测细胞生长情况的变化。用于干扰ACSL4表达的siRNA由上海吉码制药有限公司合成，Si-1：正义链5-GGAUAUUCUUCUCCGCUUAdTdT-3(SEQ ID NO.:5)，反义链5-UAAGCGGAGAAGAAUAUCCdTdT-3(SEQ ID NO.:6)；Si-2：正义链5-CUCAAAGACAUUGAACGAAdTdT-3(SEQ ID NO.:7)，反义链5-UUCGUUCAAUGUCUUUGAGdTdT-3(SEQ ID NO.:8)。作为干扰对照的NC非特异性核苷酸序列为：正义链5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3(SEQ ID NO.:9)，反义链5-UCGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3(SEQ ID NO.:10)。经Western blot检测蛋白表达显示，人工合成的干扰siRNA能够有效的下调ACSL4的表达水平(图4A)，生长曲线实验和克隆形成实验也证明了ACSL4的下调能够促进胃癌细胞MGC-803，AGS的 生长和形成克隆的能力(图4A，B)以及体外迁移的能力(图5A，B)，有力的支持ACSL4抑制胃癌肿瘤细胞生长的结论。
实施例4：ACSL4影响胃癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力
体外实验已经明确表明ACSL4抑制胃癌细胞的生长，接下来利用荷瘤裸鼠模型来研究ACSL4的表达对胃癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。将1×106个下调ACSL4的MGC803细胞和对照细胞对称注射入裸鼠腹部皮下，观察瘤体的生长情况。1个月后，杀死裸鼠取出瘤体称重。结果表明ACSL4的下调有效促进MGC803细胞在裸鼠皮下的成瘤能力(图5A)。
本发明实验证实ACSL4基因在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织，并且通过外源ACSL4基因过量表达可以显著抑制胃癌细胞的生长，通过RNAi干扰内源ACSL4表达可以明显促进胃癌细胞生长和克隆形成；动物实验也表明ACSL4表达抑制胃癌细胞的成瘤能力。因此ACSL4基因及其表达产物可作为诊断胃癌的标志物和用于胃癌治疗的药物靶点，使胃癌诊断更加准确、快速。总之，本发明ACSL4基因及其用途为防治胃癌提供了新的治疗靶点和有效新药。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种ACSL4基因或ACSL4蛋白或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备检测胃癌和/或判断胃癌易感性的试剂或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒包括：对ACSL4蛋白或mRNA进行定量检测的试剂以及相应的标签或说明书。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括ACSL4特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的标签或说明书中注明以下内容：
当检测对象的ACSL4相对β-肌动蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的ACSL4相对β-肌动蛋白的mRNA表达量之比≤1，则提示该检测对象患胃癌的几率和/或胃癌易感性高于普通人群。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有ACSL4基因或其蛋白作为活性成分，和药学上可接受的载体。
6.一种ACSL4蛋白、ACSL4基因或其激动剂的用途，其特征在于，被用于制备抑制胃癌细胞生长、增殖和/或迁移的药物，或用于制备治疗胃癌和/或胃癌转移的药物。
7.一种体外非治疗性的抑制胃癌细胞生长、增殖和/或迁移的方法，其特征在于，包括步骤：在ACSL4蛋白或其激动剂存在下，培养胃癌细胞，从而抑制胃癌细胞生长或增殖。
8.一种筛选治疗胃癌的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中ACSL4的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中ACSL4的表达量和/或活性；
其中，如果测试组中细胞的ACSL4的表达量和/或活性大于对照组，就表明该测试化合物是对ACSL4的表达和/或活性有促进作用的治疗胃癌的候选化合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对胃癌细胞生长或增殖的抑制作用。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中包括步骤：测试组中，胃癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察胃癌细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在胃癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察胃癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中胃癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对胃癌细胞的生长或增殖有抑制作用的治疗胃癌的候选化合物。
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JP3144905B2 (ja) シナプトフィジンに対する新規なモノクローナル抗体

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