JP2015524397A - 診断及び処置の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
癌のタイプ 転移の主要部位
乳癌 肺、肝臓、骨
結腸癌 肝臓、腹膜、肺
腎臓癌 肺、肝臓、骨
肺癌 副腎、肝臓、肺
黒色腫 肺、皮膚/筋肉、肝臓
卵巣癌 腹膜、肝臓、肺
膵臓癌 肝臓、肺、腹膜
前立腺癌 骨、肺、肝臓
直腸癌 肝臓、肺、副腎
胃癌 肝臓、腹膜、肺
甲状腺癌 肺、肝臓、骨
子宮癌 肝臓、肺、腹膜
(i)I型IFNタンパク質又はその機能性断片;
(ii)I型IFN又はその機能性断片をコードする核酸分子;
(iii)例えば、I型IFN遺伝子の転写又は翻訳制御をモジュレートすることによってI型IFNの発現を上方制御するタンパク性分子又は非タンパク性分子;
(iv)例えば、TLR7/8アゴニストイミキモドを含むToll様受容体などのパターン認識受容体と相互作用するタンパク性分子又は非タンパク性分子
であってもよい。
方法
免疫精製
免疫精製は、α−マウス−Ep−CAM抗体で置換された上皮選択抗体(BD Pharmingen、クローンG818)を使用し、Parker and colleagues(Parker et al.2008)によって開発されたプロトコルにより実施した。CD31、vWF及びP1H12(内皮群)、CD45(造血群)、並びにEp−CAM、CK18及びCK19(上皮群)、並びにNeoR(腫瘍特異的群)についてRT−PCR分析を行うことによって、それぞれの群の純度を評価した(データは示さず)。
RNAは、RNeasyキット(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して抽出した。RNAは、GC遺伝子発現3’増幅、2サイクル標的標識キット(Affymetrix、Santa Clara、CA、USA)を使用して増幅、標識、断片化し、Megascript T7キット(Ambion、Austin、TX、USA)を使用して最初のIn Vitro転写を実施した。Affymetrixマウス430 v2.0遺伝子発現アレイを使用して発現レベルを判定した。データ分析は、Genespring GX 7.3(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA)で実施した。データは、RMAファイルプリプロセッサーを使用して取り込み、0.01未満の測定値は0.01にセットした。関連の原発腫瘍上皮試料に対してそれぞれマッチングした転移性上皮試料及び上皮原発腫瘍試料の遺伝子についての正規化を実施した。試料は、組織のタイプによって分類した。t検定のp値を0.05にセットした信頼フィルターを使用して、原発腫瘍上皮と転移性上皮の間の発現を変化させない、データ設定における遺伝子の数を最小限にした。偽発見率が0.03であるANOVA(パラメトリック検定、均等分散を仮定せず)を使用して、差次的に発現される遺伝子を同定した。完全なデータセットは、GEOでオンラインによりアクセスすることができる。遺伝子オントロジー分析は、GenBank、LocusLink及びUniGeneを使用して構築されたオントロジー表と、Genespring GX7.3内の遺伝子オントロジー特性を使用して実施した。Genomatix(Genomatix Software GmbH、Munchen、Germany)を使用する、集中プロモーター分析は、トップ3のオントロジーの中からランダムに選択された遺伝子を利用して実施した。次いで、インターフェロン刺激応答エレメント(ISRE)コンセンサス結合配列を使用し、MouseGenome9999配列ファイル(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA)から供給された配列データと共に、Genespring GT 1.0(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA)内で差別的に発現される遺伝子に対してアンフォーカスプロモーター分析を実施した。
p値を<0.05とし、変化倍率を>2とすることにより発現データをフィルタリングし、原発腫瘍上皮と転移性上皮の間で大きく差次的に発現されている遺伝子を同定した。遺伝子をEnsembl release59遺伝子モデルにマッピングし、INTERFEROMEのIFN制御遺伝子のデータベースを使用し、IFNシグネチャーについて得られた遺伝子リストを分析した。有意性は、Pearsonのカイ二乗検定を適用することにより決定した。
注釈付き転写開始部位に対して1500bpの5’上流及び200bpの下流である推定上の近位プロモーター配列をEnsemblのBioperl API(Culhane et al.2010、上掲)によりEnsembl release 59から抽出した。既に記載されているように(Matys et al.,Nucleic Acids Res 34:D108−110(2006))、Transfac Professional(ver.2010.3)、位置重みマトリックスを利用するCLOVERアルゴリズム(Frith et al.,Nucleic Acids Res 32:1372−1381(2004))を使用して、遺伝子セット内の転写因子の濃縮を同定した。完全なINTERFEROME遺伝子リストからのプロモーターと22732 Ensemblタンパク質コード遺伝子を、バックグラウンド設定として0.01及び1000のp値閾値ランダム化を適用して使用した。転写因子結合部位同定は、偽陽性の最小化に適用されるフィルターとTransfac Professional(ver.2010.3)のMATCHアルゴリズムを使用して実施した。転写因子結合部位は、INTERFEROMEプロモーター可視化スクリプトによって可視化した。
66cl4及び4T1細胞系はDr.Fred Miller(Karmanos Cancer Institute、Detroit、MI)の好意により提供された。4T1.2細胞系の誘導は、既に記載されている(Eckhardt et al.2005,上掲;Lelekakis et al.1999,上掲)。組換えインターフェロン−α1は、1000IU/mLの用量で使用した。インターフェロン−α受容体遮断抗体(MAR1−5A3)は、10μg/mL濃度で使用した(Leinco、St Louis、MO)。G−CSF ELISAは、メーカーの使用説明書により実施した(R&D Systems、Minneapolis、MN、USA)。フローサイトメトリーは、標準の技術を使用して実施した。MDSCは、Ly6G(クローンIA8)及びCD11b(クローンM1/70)特異抗体(BD Pharmingen、Franklin Lakes、NJ、USA)を1:200の希釈で使用して評価した。フローサイトメトリーは、LSR−II(BD Pharmingen、San Jose、CA)を使用して実施した。リアルタイムRT−PCRは、標準の技術を使用して実施した。in vitroでの増殖は、既に開示されているスルホロダミンB結合アッセイ(Eckhardt et al.2005、上掲)を使用して評価した。免疫組織化学は、標準の技術を使用し、α−マウスIrf7(Zymed/Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)及びα−ヒトIrf7(BD Pharmingen、Franklin Lakes、NJ、USA)を5μg/mLの濃度で使用して実施した。
MDSC及びCFSE標識脾細胞の混合物を、96ウェルの丸底プレートに三連でプレーティングした。サプレッサー細胞とキラー細胞は、1:1、1:2、1:4、1:8及び1:16の比で、各ウェル中のキラー細胞を同数とし(100,000細胞/ウェル)共培養した。細胞は、抗CD3(クローン145−2c11、BD Biosciences、San Jose、CA、USA)及び抗CD28(クローン37.51、BD Biosciences、San Jose、CA、USA)抗体を40ng/mlで使用して刺激した。各ウェル中の培地の全容量は175μlに調整した。細胞を72時間、37℃でインキュベートし、細胞増殖は、フローサイトメトリーを使用して、CFSE希釈により測定した。CD4+及びCD8+Tリンパ球は、特異抗体(抗マウスCD4−APC、クローンGK1.5、eBioscience;抗マウスCD8a PE−Cy7、クローン53−6.7、eBioscience)を使用して評価した。
メスのBalb/cマウス(6〜8週齢)は、ARC(Perth、WA、Australia)又はWalter and Eliza Hall Institute(Kew、Vic、Australia)の飼育施設から入手した。メスのNSGマウスは、Jackson Laboratoryからのライセンス下のWEHI飼育施設から入手し、Balb/c Ifnar1−/−(Hwang et al.1995、上掲)はハウス内で飼育した。組換えIFN−α1は、腹腔内に毎週3回105IU/用量の投与量で注射した。別のすべてのマウスアッセイは、標準の技術を使用して実施した。転移は既に記載されているアッセイを使用して評価した(Eckhardt et al.2005、上掲)。マウス検査は、Peter MacCallum Animal Ethics Experimentation Committeeの承認を得て実施した。
転移データは、可視化のためlog10変換した。特に明記しない限り、すべての統計は、変換していないデータに対して実施したスチューデントt検定である。ドットプロット及びヒストグラムは平均であり、誤差棒はS.E.M.である。すべての統計は、MicrosoftのExcel内のデータ分析パッケージ又はGraphPad Prism 5内の分析ツールを使用して実施した。Kaplan−Meier生存分析は、GraphPad Prism 5を使用して実施し、Gehan−Breslow−Wilcoxon検定を使用して有意性を決定した。Harrell et al.(2012、上掲)で記載されているように、遠隔再発の最初の部位が公知である、公的に入手可能な4種の乳癌マイクロアレイデータセット、GSE2034、GSE12276、GSE2603、NKI295を生存分析で使用した。Irf7遺伝子セットは連続変数として処理し、予測されるIrf7の推定上の結合部位を含有している、540 IRG内の208遺伝子のサブグループの平均遺伝子発現として定める(Irf7を含む、図7)。
免疫精製は、Parkerらによって開発されたプロトコルにより(Parker et al.2008、上掲;Parker et al.,Cancer Res 64:7857−7866(2004);St Croix et al.,Science(New York,N.Y)289:1197−1202(2000))、α−マウス−Ep−CAM抗体で置換された上皮選択抗体(BD Pharmingen、Franklin Lakes、NJ、USA)を用いて実施した。簡潔に説明すると、マウスを屠殺し、組織を回収した。3mg/mLのコラゲナーゼA(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)を含有するDMEM中で組織を分解させ、37℃で90分間消化した後、100μm及び70μmのナイロンフィルターを通して濾過し、アルカリ緩衝液(150mM NH4Cl、1mM KHCO3、0.1mM EDTA)で赤血球を溶解させた。Bリンパ球及びTリンパ球は、pan−B及びpan−T DynaBeads(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)と4℃で20分間インキュベーションすることにより除去した。次いで、上皮細胞は、ラット抗マウスEP−CAM抗体(BD Pharmingen、Franklin Lakes、NJ、USA)に予め結合させた、ヒツジ抗ラットDynaBeads(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)と4℃で30分間インキュベーションすることにより選択した。
本発明者らは、pMSCVレトロウイルス発現ベクター(Clonetech、Palo Alto、CA、USA)を使用してIrf7を強制的に発現させた。空のプラスミド又はフラッグタグIrf7構築物を含有するプラスミドは、リポフェクタミン(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用してHEK−293パッケージング細胞へトランスフェクトした。馴化培地を濾過し、標的4T1.2細胞とインキュベートした。次いで、ピューロマイシンを使用して4T1.2細胞を選択し、単離細胞をクローン化し、複数のクローンをプールした。
Harrell et al.(2012、上掲)で記載されているように、遠隔再発の最初の部位が公知である、公的に入手可能な4種の乳癌マイクロアレイデータセット、GSE2034、GSE12276、GSE2603、NKI295を生存分析で使用した。正規化遺伝子発現データはダウンロードした。Irf7遺伝子シグネチャーは連続変数として処理し、予測されるIrf7の推定上の結合部位を含有している、540 IRG内の208遺伝子の平均遺伝子発現として定めた(Irf7を含む、図7)。プローブをEntrezGeneIDにマッピングし、複数のプローブが存在した場合、分散が最も高いプローブを使用した。遺伝子発現値は、変位値2.5%及び97.5%がそれぞれ−1及び+1と等しくなるようにスケール変更した。このスケーリングは異常値に強く、マイクロアレイデータセット間を比較することができる(Haibe−Kains et al.,J Natl Cancer Inst 104:311−325(2012))。Cox比例回帰モデルを使用し、尤度比χ2値の変化を使用して、データセットによって重層化される、典型的な予後因子:腫瘍サイズ(T1対T2)、結節状態(陽性対陰性)、エストロゲン受容体状態(陽性対陰性)及び組織学的悪性度(グレード1対2対3)について調整した連続変数としてのIrf7シグネチャーの発現に関連した骨への遠隔再発の危険率と95%信頼区間を推定する。Kaplan−Meier法を使用して生存曲線を描き、log−rank p検定を使用し、階層を介して生存における差を評価した。合計で、855名の患者に関する患者データがあり、再発の最初の部位としては骨(n=238)、脳(n=49)、肺(n=101)及び肝臓(n=107)であった。骨再発のない生存分析については、骨以外の事象(すなわち、肝臓、肺及び脳)が検定された(骨以外の生存分析に関する逆解析)。脳、肺及び肝臓での再発の無い生存に関する個別の分析もまた有意ではなかった(log−rank P=それぞれ、0.4、0.8及び0.56)ことに注意されたい。相関は、SpearmanのRho統計値(Rs)を使用して実施した。分析は、Rバージョン2.9.2(http://www.r−project.org/)及びSPSS(SPSS Inc.Chicago、IL)バージョン20.0を使用して実施した。
RNAはTrizol(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用して抽出し、標準的技術を使用してcDNAを逆転写した。リアルタイムPCRは、SYBR試薬を使用して実施した(Applied Biosystems、Carlsbad、CA、USA)。以下のプライマー配列を使用した。
これらの技術は、既にEckhardtらによって開示されている(Eckhardt 2005)。簡潔に説明すると、マウスは、105個の細胞がメス6〜8週齢のBalb/cマウスの第4乳腺脂肪体に接種された。腫瘍体積は、週3回カリパス測定によりモニターした。いずれかの動物が苦痛の徴候を示した時に、動物全部にイソフルランを過剰投与し屠殺した(通常、28〜35日)。二次組織の中の転移量は、4T1.2細胞のゲノムに挿入されたリポーター配列を使用するQ−PCR系アッセイによって検出した。生存アッセイは、22日目に、塩酸ケタミン(1.2μg/マウスg)/塩酸キシラジン(3μg/マウスg)の組み合わせ又は100%の酸素中の2.5%エアロゾルイソフルランのいずれかを使用してマウスに麻酔し、原発腫瘍を外科的に摘出し秤量する以外は、同様の方法で実施した。マウスが苦痛の徴候を示した場合は、群としてではなく、個別に回収された。特に明記しない限り、屠殺時に、マウスはすべて、骨転移及び肺転移の証拠を示した。抗CD8(クローン53−6.7、インハウス産生)及び対照抗体ラットIgG2a(クローン2A3、インハウス産生)は、用量あたり50グラムで、−1、0、1、4、7日とその後7日毎に腹腔内に注射した。ウサギ抗アシアロGM1はWako chemicals社から購入し、メーカーの使用説明書により腹腔内注射した。
一つの例外を除いて、組織はすべて、24時間、10%中性緩衝ホルマリンで固定した。骨は、室温で14日間、20%EDTAで脱灰した。組織はすべて、Peter MacCallum Cancer Centreの組織部又はPeter MacCallum Cancer Centreの病理部でパラフィン包埋し切片化した。H&E染色は、同組織部により行った。例外は、既に開示されているようにして(Wu et al.2008;Cimino et al.,Breast Cancer Res Treat 123:701−708(2010))そのほとんどが迅速な剖検で採取された、同一患者由来の原発性乳癌と血行性転移ペアから得たJohns Hopkins病院のP.A.によって構築された個別の一連の組織マイクロアレイであった。標準的な免疫組織化学技術を使用して、染色用の切片を調製した。熱抗原賦活化は、圧力下、125℃で3分間、クエン酸緩衝液(10mMのクエン酸三ナトリウム、pH6.0)中で実施した。α−マウスIrf7抗体はInvitrogen(クローンzm7)から入手し、α−ヒト/マウスIrf9抗体はabcam(カタログ番号ab51634)から入手し、α−ヒトIrf7抗体はBD Pharmingen社(カタログ番号AHP1179)から入手した。
IFN−α ELISAは、標準的な分子生物学技術を用いて行った。抗体クローンRMMA−1は、捕獲抗体(PBL Interferon Source、Piscataway、NJ、USA)として使用し、ウサギポリクローナル抗マウスIFN−αは、検出抗体(PBL Interferon Source、Piscataway、NJ、USA)として使用した。細胞は50,000/mLの密度で播種し、4時間付着させた後、24時間、ビヒクル対照又は10μg/mLのpoly(I:C)で処理した。
マウス血液を心穿刺により回収し、脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した。赤血球は、5分間室温で、150mMのNH4Cl、1mMのKHCO3及び0.1mMのEDTAを含有する赤血球溶解緩衝液1ml中に細胞を再懸濁することにより溶解させた。次いで、細胞を2回洗浄し、0.1%のアジ化ナトリウム、2%のFCS及び2mMのEDTAを含有するFACS緩衝液に5×107細胞/mlで再懸濁させた。Ly6G+MDSC細胞は、Ly6G及びCD11bのそれらの発現に基づいて選択された(Ly6G+CD11b+)。細胞選別は、FACSDiVaセルソーター(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)及びFACSAria IIセルソーター(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)を使用して実施した。非標識試料及び各蛍光色素に対する単一標識対照も電圧及び補償パラメーターを設定するために含めた。
脾細胞単一細胞懸濁液を調製した。細胞を2mMのEDTAを含有する20mLのPBSに再懸濁し、続いて、1μMのCFSE(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)で標識した。室温で7分間インキュベーションした後、5%FCSを含有するα−MEMでチューブを満たし、5分間800gで遠心した。2回洗浄した後、次いで、5%のFCSを含有するα−MEM中に細胞を再懸濁させた。CFSEによる細胞の標識化は、フローサイトメトリーによって分析した。
DNA試料
切片は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)の正常な乳房組織、原発腫瘍及び対応骨転移を含む8つのブロックから切り出した。各ブロックからの3μm切片の1つをH&Eで染色し、腫瘍濃縮領域を識別した。すべての場合において、腫瘍細胞の含有量は、病理学者によって評価された。少なくとも80%の腫瘍細胞含有量からなる組織領域を、針によるマクロダイセクション用に選択した。各試料の7μm組織切片をメチルグリーンで染色し、続いて、針によるマクロダイセクションに供した。
完全メチル化対照DNAは、CpGメチルトランスフェラーゼM.SssI(New England BioLabs、Ipswich、MA)を利用することによって、正常BALB/cマウスの抽出肺DNA500ngから調製した。M.SssI処理は、別記(Mikeska et al.,Methods Mol.Biol.791:33−53(2011))のようにして実施した。調製物は、−35℃で保管した。
DNA500ngは、メーカーの使用説明書に従ってEpiTect重亜硫酸塩キット(Qiagen)を使用して重亜硫酸塩修飾した。SssI処理DNA(完全メチル化対照DNA)及び対応するゲノムDNA(非メチル化対照DNA)は、最終容量50μL溶出バッファーEBで2回溶出したが、FFPE誘導DNAは、最終容量40μL溶出バッファーEBで2回溶出した。溶出物は4℃で保管した。
DNAメチル化基準系列は、非メチル化対照DNAに完全メチル化対照DNAを希釈することによって調製した。DNAメチル化基準は、100%、50%、25%、10%、及び0%の完全メチル化対照DNAを含んでなる。MS−HRM(Wojdacz and Dobrovic,Nucleic Acids Res 35:e41(2007))は、Rotor−Gene 6000(Corbett、Sydney、Australia)で実施した。それぞれのDNAメチル化基準とそれぞれの試料は二連で実施したが、重亜硫酸塩処理していないゲノムDNA対照と非鋳型対照は1回だけ実施した。
マッチングした乳腺腫瘍及び脊椎転移のプロファイリング
腫瘍上皮細胞は、既に開示されているように(Parker et al.,J Pathol 214:337−346(2008))、乳腺で増殖している4T1.2原発腫瘍から単離し、これは脊椎転移とマッチした(Eckhardt et al.2005)。原発腫瘍と骨転移の4つのマッチドペアから単離された腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイルの相違(図1)は、遺伝子オントロジー分析によって調査され、免疫及び防御応答オントロジーに関して高度に増強されていることが確認された(信頼水準P<0.003)(表3a)。
骨転移におけるIrf7の機能上の寄与を判定するため、Irf7を過剰発現する4T1.2クローンを産生した(4T1.2−Irf7、図10a)。これは、IFN−α又はTLR3アゴニスト(PolyI:C)による経路刺激の存在下であっても(データは示さず)、in vitroでの増殖に変化を示さなかった(図3a)。ELISAによるIFN−α(図3b)とqRT−PCRによる、2つのIRG、Irf9及びSTAT1(図10b)の予想される発現の増加が確認された。後者はI型IFNによる二次シグナル伝達によるものであった。その理由は、Ifnar1中和抗体(Sheehan et al.,J Interferon Cytokine Res 26:804−819(2006))が4T1.2−Irf7細胞におけるIrf9及びSTAT1の発現を対照細胞(4T1.2−BV)で確認されたレベルにまで低減したからである(図10b)。実際、4T1.2−Irf7を4T1.2−BV細胞と比較する遺伝子発現のマイクロアレイ分析では、それらのプロモーターで予測されたIrf7結合部位を含有していた208のすべての遺伝子がIrf7発現により上方制御されたことが明らかになった(図11)。さらに、4T1.2−BV腫瘍と比較された乳腺腫瘍において、核Irf9発現の増加があった(図10c)。したがって、強制的Irf7発現によるIFNの産生は、IFN/Ifnarシグナル伝達経路を刺激する。
宿主IFN応答は転移抑制には重要であり、且つ先天性IFN経路は免疫エフェクター細胞の発達及び活性を制御するので(Dunn et al.2005、上掲)、NOD−SCID IL−2rγ−/−マウス(NSG)に4T1.2−BV又は4T1.2−Irf7細胞に接種することにより、このモデルにおけるそれらの潜在的役割を評価した。再度、原発腫瘍は同じ速度で増殖し、原発腫瘍の増殖が免疫系によって抑制されないことが示唆された。重要なことには、成熟リンパ球欠損NSGマウスでは、同系WT Balb/cマウスよりも急速に転移が発生し、無病生存期間はIrf7の発現によって延長されなかった(図4a)。これは、Irf7に有意な生存効果があった、免疫応答性マウスでの結果とは対照的であった(図4a)。これらのデータは、機能的免疫細胞が転移に対するIrf7保護に必要であることを示している。組織学的検査からは、すべての免疫不全動物における脊椎転移が明らかとなり(図4b)、これはそれらの生存期間の低下と一致している。これらの結果は、転移性腫瘍が免疫系によって抑制されることと、Irf7が、原発腫瘍の増殖に影響することなく、抗腫瘍免疫応答を回復することによって転移を抑制する可能性があることを示唆している。
原発腫瘍におけるIRF7の発現と、骨をはじめとする遠隔転移におけるその喪失は、迅速剖検プログラム、Johns Hopkins Hospitalの組織アレイを使用してIHCにより確認した(Wu et al.,Clin Cancer Res 14:1938−1946(2008))。これらの事例において、IRF7が正常な乳房組織(7/10)及び原発腫瘍(9/16)において頻繁に発現されたことが示された。重要なことには、転移にIRF7発現の低下が確認され、IRF7を発現する遠隔転移(3/18)はわずかに16.7%であった(原発腫瘍に対しP<0.04、表6)。このコホート内でマッチングした原発腫瘍及び骨転移の分析では、9対のうち、7つの原発性がIRF7を発現し、そのうちの1つだけがマッチングした骨転移での発現を保持していたことが明らかであった(図5a、b中の代表画像)。さらにマウス組織でも明らかなように(図2b)、骨細胞はIRF7を発現したが、腫瘍細胞はほとんどの場合、陰性であった。
Irf7の転移抑制はI型IFNに依存しているので、IFN投与が骨における転移負担を逆転するかどうかを判定することとした。IFN−α1処置は、in vitroにおける4T1.2細胞のIrf7、並びにIrf9及びSTAT1の発現を増加させたが(図6a)、これは、Irf7がIFNを介してIrf9及びSTAT1の発現を増加させたことを証明しているデータと一致している。本発明者らの上記データから予想されるように、IFNα1処置はin vitroにおける4T1.2細胞の増殖(図6b)又はin vivoにおける原発腫瘍の増殖(図6c)に影響を及ぼすことはなかった。全く対照的に、IFN処置は、検出不可能なレベルまで脊椎及び大腿骨への転移を有意に低減した(P<0.007)(図6d、e)。肺への転移の程度は低減されず(図17)、MDSC蓄積レベル及びG−CSFレベルの減少が、IFN処置したマウスの末梢血で観察された(図18)。転移のない生存試験については、4T1.2担持マウスを5週間、生理食塩水又はIFN−α1のいずれかで処置し、3週間目に原発腫瘍を切除した。この場合もやはり、IFN−α1は原発腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかったが、転移のない生存期間が有意に延長された(図6f)。終了時点では、この分析におけるすべてのマウスは骨転移及び肺転移のために死亡した。これらのデータは、IFN−α1の治療的投与は転移負荷を低減することができ、さらなる調査に値する実施可能な治療戦略であることを示すものである。
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Claims (39)
- IRF7機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置する方法であって、有効量の組成物を投与することを含み、該組成物が該個体のI型IFNのレベルを上方制御する薬剤を含む、上記方法。
- IRF7機能異常によって特徴付けられる、個体の転移性癌を処置するための医薬の製造におけるI型IFNのレベルを上方制御する薬剤の使用。
- 前記癌が請求項13から36までのいずれか一項に記載の方法によって診断可能である、請求項2又は3に記載の方法又は使用。
- 前記癌が乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮である、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記癌が乳癌である、請求項4に記載の方法又は使用。
- 前記I型IFNがIFNα又はIFNβである、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記薬剤がI型IFNタンパク質又はその機能性断片である、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記薬剤がI型IFN又はその機能性断片をコードしている核酸分子である、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記薬剤がパターン認識受容体と相互作用する分子である、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記パターン認識受容体がToll様受容体又はRLHである、請求項9に記載の方法又は使用。
- 前記薬剤がTLR7/8アゴニストである、請求項10に記載の方法又は使用。
- 前記TLR7/8アゴニストがイミキモドである、請求項11に記載の方法又は使用。
- 個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、そのプロモーター中にIRF7結合部位を含む1つ又は複数の遺伝子の該腫瘍による発現を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における該遺伝子の発現レベルに対する該遺伝子の発現レベルの低下が該腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法。
- 前記遺伝子が表1に列挙した遺伝子から選択される、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも10遺伝子、少なくとも20遺伝子、少なくとも30遺伝子、少なくとも40遺伝子、少なくとも50遺伝子、少なくとも60遺伝子、少なくとも70遺伝子、少なくとも80遺伝子、少なくとも90遺伝子、少なくとも100遺伝子、少なくとも110遺伝子、少なくとも120遺伝子、少なくとも130遺伝子、少なくとも140遺伝子、少なくとも150遺伝子、少なくとも160遺伝子、少なくとも170遺伝子、少なくとも180遺伝子、少なくとも190遺伝子、少なくとも200遺伝子、又は少なくとも208遺伝子についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 表2から選択される1つ又は複数の遺伝子についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 表2に列挙した遺伝子の全部についてスクリーニングすることを含む、請求項16に記載の方法。
- IFITM3、TLR3、IRF7及びIL13RA1についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- CALD1、RUNX1、YWHAZ及びHBEGFについてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- IL13RA1、CSF2RB、STAT1、CD44、IRF7、IFI44、TLR3及びIFITM3についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- IL13RA1、CD86、CSF2RB、STAT1、CD44、IRF7、IFI44、TLR3、IER3、IFITM3、RUNX3及びCTSSについてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- IFI44、IRF7、CSF2RB、STAT1、TLR3、IL13RA1及びIFITM3についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- IFI44、IRF7、CSF2RB、STAT1、TLR3、IFI202B、IER3、RUNX3、CTSS、IL13RA1、IFITM3及びCD86についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- RUNX1、SQLE、PDXK、YWHAZ、DDX3X、RBBP4、HBEGF、DAB2及びFAM120Aについてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- RUNX1、SQLE、PDXK、HNMT、CALD1、YWHAZ、DDX3X、RBBP4、THBS1、HBEGF、DAB2及びFAM120Aについてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- PTPRK及びSLC6A6についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- CSDE1、ATP6V1B2、PTPRK、LGMN、CXCL9、TGIF1、NIPA2、SLC6A6、ARG1、CFP、CTSH及びACSL4についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- DHX58、BST2、IFI44、IFIT3、IRF7、STAT1、DSP及びUSP18についてスクリーニングすることを含む、請求項13又は14に記載の方法。
- 1つ又は複数の追加の遺伝子マーカーについてスクリーニングすることを含む、請求項18から28までのいずれか一項に記載の方法。
- RNA転写産物又はそこから転写されるcDNAのいずれかについてスクリーニングすることを対象とする、請求項13から29までのいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質発現産物についてスクリーニングすることを対象とする、請求項13から29までのいずれか一項に記載の方法。
- 個体からの腫瘍の転移状態を評価する方法であって、該腫瘍におけるIRF7、IRF9又はSTAT1の機能性レベル(functional level)を検出することを含み、対応する非転移性腫瘍における該IRF7、IRF9又はSTAT1の機能性レベルの低下が該腫瘍の転移性表現型を示す、上記方法。
- 分析の対象である腫瘍が原発腫瘍である、請求項1から32までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍が乳房、結腸、腎臓、肺、皮膚、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、甲状腺又は子宮の腫瘍である、請求項33に記載の方法。
- 前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項34に記載の方法。
- 前記転移が骨転移である、請求項33から35までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記機能性レベルがIRF7、IRF9及び/又はSTAT1の絶対レベル(absolute level)についてスクリーニングすることにより評価される、請求項32に記載の方法。
- 前記機能性レベルがIRF7、IRF9及び/又はSTAT1の活性についてスクリーニングすることにより評価される、請求項32に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項1から38までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
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