CN104689313A - 大菱鲆cd83分子作为疫苗佐剂的应用 - Google Patents

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本发明涉及分子生物学领域，具体的说是大菱鲆CD83作为疫苗免疫佐剂的应用。大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用。本发明的CD83表达质粒能显著提高疫苗诱导的血清抗体效价和免疫保护效应。

Description

大菱鲆CD83分子作为疫苗佐剂的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是大菱鲆CD83作为疫苗免疫佐剂的应用。
背景技术
CD83分子属于Ⅰ型免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)超家族成员，分子量约为45kDa，由胞外段、跨膜区和胞内段组成，其中胞外部分含有典型的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)结构域。人CD83由205个氨基酸组成，其中胞外段128个氨基酸，含一个V型Ig功能区。在哺乳动物中，CD83是树突状细胞的特异性标志，参与T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化，激活吞噬细胞、中性粒细胞、NK辅助细胞和胸腺细胞。细菌脂多糖和细胞因子(如TNF-a和白介素1β)能够通过转录因子NF-kB促使CD83基因表达上调。CD83对CD4+T细胞的发育过程具有关键的调节作用，在CD83基因完全缺失的小鼠中，外周血CD4+T细胞数量大幅减少。除此之外，CD83还参与B细胞的成熟和T细胞的激活。因此，CD83在淋巴细胞的激活及信号传导中具有重要作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种大菱鲆CD83分子作为免疫佐剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用。
进一步的说，大菱鲆CD83分子作为DNA疫苗的免疫佐剂的应用。
所述CD83分子的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀释液按体积比为1:1比例混合。
所述CD83分子的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲液稀释至400ug/ml。
所述CD83表达质粒是以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物与载体pBS-T连接，获得质粒pBSCD83；用限制性内切酶EcoRV酶切pBSCD83后回收0.6kb片段，与质粒pCN3连接，得CD83表达质粒pSmCD83；
所述F1为5’-GATATCGCCACCATGTTCCCACATCACCTGA-3’；R1为5’-GATATCAACATACACGGGCTTCCC-3’。
本发明具有如下优点：本发明的CD83能够显著提高DNA疫苗的免疫保护效应，能显著提高疫苗诱导的血清抗体效价和免疫保护效应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell:MolecularCloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)。
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
实施例1
CD83的表达质粒pSmCD83的构建：
本发明的CD83分子的序列已公开(GenBank access ion No.ADM87603.1)。
以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,59℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃ 40s,64℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSCD83。将质粒pCN3(构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construct ion andevaluat ion of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine 2009；27:5195–202.)用EcoRV酶切,回收5.4kb片段，同时将pBSCD83用EcoRV酶切回收0.6kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pSmCD83。通过DNA测序分析证明了pSmCD83为含有Ig结构域的CD83序列的表达质粒，其中pSmCD83质粒中CD83序列与GenBank accession公开的No.ADM87603.1的序列一致。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCGCCACCATGTTCCCACATCACCTGA-3’；R1为5’-GATATCAACATACACGGGCTTCCC-3’。
实施例2
肿大细胞病毒DNA疫苗pCN75的构建
以已报导的肿大细胞病毒RBIV-C1(Zhang BC,Zhang M,Sun B,Fang Y,Xiao Z,Sun L.Complete genome sequence and transcription profilesof the rock bream iridovirus RBIV-C1.Dis Aquat Org.2013；104:203-14.)为模板，采用F2和R2为引物PCR扩增肿大细胞病毒的ORF75基因。该基因编码一个由444个氨基酸组成的蛋白，该蛋白有一个保守的ANK(ankyrin)结构域。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃40s,58℃ 60s,72℃ 90s,25个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素(Ap)、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(X-gal)和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBS444。将质粒pCN3用SmaI酶切，回收5.4kb片段，同时将pBS444用EcoRV酶切回收0.3kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含有Ap(100μg/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时，挑取转化子，提取质粒，命名为pCN75，即为DNA疫苗质粒。通过DNA测序分析证明了pCN75含有具有ANK结构域的ORF75序列。
所述F2为5’-GATATCATGGATGAGTACAATGCAGAGGGCT-3’；R2为5’-GATATCACACATGCCCATGTCAACAT-3’。
实施例3
CD83表达质粒pSmCD83的免疫应用
步骤1)免疫大菱鲆
将上述实施例1的pSmCD83和上述实施例2的DNA疫苗pCN75分别在PBS中稀释至400ug/ml，将二者等体积混合，即为pCN75+pSmCD83混合液。将pCN75和pSmCD83分别在PBS中稀释至200ug/ml，即为pCN75稀释液和pSmCD83稀释液。将120条大菱鲆(重约12.5g)随机分为4组，每组30条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A组的每条鱼肌肉注射0.1ml pCN75稀释液，将B组的每条鱼肌肉注射0.1ml pSmCD83稀释液，将C组的每条鱼肌肉注射0.1ml pCN75+pSmCD83混合液，将D组(对照组)的每条鱼肌肉注射0.1ml PBS。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
步骤2)病毒悬液制备
将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见Zhang M,Xiao Z,Hu Y,SunL.Characterizat ion of a megalocyt ivirus from cultured rock bream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege),in China.Aquac Res.2012；43:556–64)于PBS中稀释至1x106copies/ml，即为病毒悬液。
步骤3)抗体效价检测
在上述步骤1)免疫后第30天，自每组鱼中取5条鱼，用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测血清中疫苗特异抗体水平(具体方法参考文献Sun Y,Liu C,Sun L.Constructionand analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccineencoding a D15-l ike surface ant igen.Fish Shellfish Immunol.2011；30:273–9.)。结果表明，与对照鱼相比，免疫pCN75和pCN75+pSmCD83组鱼产生的抗体效价分别为64和128，后者显著(P<0.01)高于前者。
步骤4)攻毒感染和免疫保护效应检测
在上述步骤1)免疫后第30天，将4组的每条鱼腹腔注射100ul上述步骤2)的病毒悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，10条；B组，20条；C组，5条；D组，28条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
由此得出免疫pCN75、pSmCD83、pCN75+pSmCD83组鱼的RPS分别为64.3％,28.6％,82.1％，其中免疫pCN75+pSmCD83组鱼的RPS显著(P<0.01)高于其它组。
综上所述，pSmCD83是一种高效的疫苗佐剂,能显著提高疫苗诱导的血清抗体效价和免疫保护效应。

Claims (5)

1.一种大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用。
2.按权利要求1所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：大菱鲆CD83分子作为DNA疫苗的免疫佐剂的应用。
3.按权利要求1或2所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：所述CD83分子的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀释液按体积比为1:1比例混合。
4.按权利要求3所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：所述CD83分子的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲液稀释至400ug/ml。
5.按权利要求4所述的大菱鲆CD83分子作为疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于：所述CD83表达质粒是以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物与载体pBS-T连接，获得质粒pBSCD83；用限制性内切酶EcoRV酶切pBSCD83后回收0.6kb片段，与质粒pCN3连接，得CD83表达质粒pSmCD83；
所述F1为5’-GATATCGCCACCATGTTCCCACATCACCTGA-3’；R1为5’-GATATCAACATACACGGGCTTCCC-3’。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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