CN104688895B - 一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，由中药提取液和益生菌的菌粉复配而成，所述中药提取液的质量浓度为0.1‑1g/mL，是由以下重量份的原料药经水煎煮制成的：乌梅14‑18份、石榴皮10‑14份、甘草6‑10份、陈皮6‑10份、厚朴6‑10份、鱼腥草2‑6份、连翘2‑6份、茯苓2‑6份；所述益生菌为芽孢杆菌或乳酸菌的一种或两种的混合，该中药益生菌复合制剂中每种益生菌的活菌数均为10⁵cfu/mL‑10⁹cfu/mL。本发明还公开了该中药益生菌复合制剂的制备方法。本发明的中药益生菌复合制剂将中药与益生菌合理配伍，其中，中药可以促进益生菌的增殖，益生菌可以促进中药的吸收和利用，中药和益生菌的复合使用能够起到更好的防治效果。

Description

一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂

技术领域

本发明涉及一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂。

背景技术

一直以来禽类呼吸道疾病是家禽养殖业的棘手问题，在我国许多地区的集约化养禽场几乎都有发生，严重影响到养禽业的经济效益。该病主要表现为呼吸道症状，发病率高，病程长，传播速度快，且易反复发生。以肉鸡为例，肉鸡的呼吸道疾病会导致鸡群饲料利用率降低，虽用药后可以控制，但很难根治，因此呼吸道疾病在禽养殖生产中是一类不容忽视的疾病。目前，治疗禽呼吸道疾病主要依靠各种西药类药物，其主要成分大多为阿奇霉素、林可霉素、大观霉素等。在禽呼吸道疾病大肆流行的今天，抗生素的使用量大大增加，虽然可以短期控制呼吸道疾病，但长期使用会造成耐药菌株的出现，反而使疫病更难控制。

中药是现代兽医临床中应用最为广泛的一类，特别是在集约化养殖中对禽传染病的预防和治疗方面有着独特的优势。目前证实，中药大多数具有抗菌或抗病毒作用，而且这类中药还具有明显的免疫增强作用，在人们日益关注食品安全和兽药残留的今天，使用中药防治禽病更具有深远意义。但到目前为止，用于治疗肉鸡呼吸道传染病的中药产品种类有限，价格昂贵，而且一旦呼吸道疾病暴发，中药治疗疗效缓慢，并不被养殖户所青睐。

另外，众所周知，呼吸道正常菌群是机体的天然屏障。在正常情况下，呼吸道正常菌群在数量上和种类上总是保持平衡的，能够防止外源性病原菌的侵入或内源性条件致病菌的大量繁殖，从而避免感染发生。尤其是上呼吸道有着特殊的生境环境，受多种因素的影响，维持其微生态平衡是机体呼吸系统健康的关键。因此，开发一种起效快，而且能够有助于维持呼吸道微生态平衡的复合制剂是目前亟待解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，该复合制剂将中药与益生菌合理配伍，其中，中药可以促进益生菌的增殖，益生菌可以促进中药的吸收和利用，中药和益生菌的复合使用能够起到更好的预防和治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，由中药提取液和益生菌的菌粉复配而成。

所述中药提取液的质量浓度为0.1-1g/mL，是由以下重量份的原料药经水煎煮制成的：

乌梅14-18份、石榴皮10-14份、甘草6-10份、陈皮6-10份、厚朴6-10份、鱼腥草2-6份、连翘2-6份、茯苓2-6份。

优选的，所述中药提取液的质量浓度为0.1-1g/mL，是由以下重量份的原料药制成的：乌梅16份、石榴皮12份、甘草8份、陈皮8份、厚朴8份、鱼腥草4份、连翘4份、茯苓4份。

进一步优选的，所述中药提取液的质量浓度为1g/mL。

所述益生菌为芽孢杆菌或乳酸菌的一种或两种。

该中药益生菌复合制剂中每种益生菌的活菌数均为10⁵cfu/mL-10⁹cfu/mL，优选为10⁷cfu/mL。

优选的，所述益生菌为枯草芽孢杆菌B7348(Bacillus subtilis B7348)和植物乳杆菌LP(Lactobacillus plantarum)。其中，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260，记载在中国专利CN102120975B中；植物乳杆菌LP(Lactobacillus plantarum)，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150，记载在中国专利CN101914475B中。

中药益生菌复合制剂中，各中药的有益作用如下：

乌梅：归肝、脾、肺、大肠经。敛肺止咳、涩肠止泻、生津止渴。用于肺虚久咳。乌梅中含有丰富的有机酸，如柠檬酸、苹果酸、草酸、延胡索酸等，对大肠埃希杆菌、金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果，另外乌梅具有清除毒素，净血的功能，能促进新陈代谢。

石榴皮：归大肠经。抗菌、止痢。含有多种被称为糅质的多元酚类化合物，这种化合物能够沉淀创口表面的蛋白质，从而防止创口的感染与刺激，对于创面的愈合有很好的促进作用，同时石榴的果皮水煎剂，具有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌等多种病原菌具有杀灭作用。

甘草：归脾、胃、肺经。性平、味甘。有解毒、祛痰、止痛、解痉以至抗癌等药理作用。在中医上，甘草补脾益气、祛痰平喘、滋咳润肺、缓急解毒、调和百药。甘草酸、甘草次酸及甘草的黄酮类化合物是甘草对呼吸系统药理作用的活性成分，能保护发炎的咽喉和气管粘膜，消除病原菌对呼吸道造成的损伤，能提高吞噬细胞的吞噬功能，调节淋巴细胞数量与功能。

鱼腥草：归肺经、膀胱、大肠经。清热解毒，主入肺经，以清肺见长。鱼胆草素是鱼腥草的主要抗菌成分，对卡他球菌、流感杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌等有明显抑制作用，另外能增强机体免疫功能，增加白细胞吞噬能力，特别是对上呼吸道感染、支气管炎、肺炎、慢性气管炎等均有较好的疗效。

大青叶：归肝、心、胃经。清热、解毒、凉血、止血。抗菌、抗炎、增强免疫力。

桔梗：归肺经。宣肺、祛痰、利咽、排脓、利五脏、补气血、补五劳、养气。

秦皮：归肝经、胆经、大肠经。清热燥湿、清肝明目、收涩止痢、止带。

陈皮：归脾、肺经。具有健脾和胃，行气宽中，降逆化痰的功效。陈皮能调和百药，其与甘草配伍是化痰下气、消滞健胃的良药。

连翘：归肺、心、胆经。苦，微寒。连翘有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、贺氏痢疾杆菌有很强的抑制作用，对其他致病菌、流感病毒、真菌都有一定抑制作用。有抗炎作用。

厚朴：归脾经、胃经、大肠经。主要用于食积气滞、腹胀便秘、湿阻中焦、脘痞吐泻、痰壅气逆、胸满喘咳等症状。

组方中，以乌梅为君药，石榴皮为臣药，各味中药协同作用，共同起到抗菌消炎、提高吞噬细胞的吞噬能力，显著增强机体的免疫力，对于呼吸道感染、支气管炎、肺炎、慢性气管炎等均有显著的预防和/或治疗效果。

该中药益生菌复合制剂的制备方法，步骤如下：

(1)中药提取液的制备：

按组分量称取各原料药，混合，向混合后的原料药中加8-10倍体积(g/mL)的水，浸泡1-2h后，煎煮1-2h，过滤，得初滤液；药渣中加入4-6倍体积(g/mL)的水进行复煎，煎煮30-60min，过滤，得二级滤液；药渣中再加入4-6倍体积(g/mL)的水进行第二次复煎，煎煮30-60min，过滤，得三级滤液，合并二、三级滤液，先低温浓缩后再与初滤液混合，最终浓缩为质量浓度为0.1-1g/mL的中药提取液，即每1mL相当于生药0.1-1g，冷藏备用。

(2)向步骤(1)制备的中药提取液加入益生菌的菌粉，混合，制备得到含每种益生菌的活菌数均为10⁵cfu/mL-10⁹cfu/mL的中药益生菌复合制剂。

本发明的有益效果：

本发明的中药益生菌复合制剂中，中药成分可以促进益生菌的增殖，有利于维持呼吸道正常菌群的平衡，防止外源性病原菌的侵入或内源性条件致病菌的大量繁殖，从而避免感染发生；而益生菌成分可以促进中药的吸收和利用，解决了纯中药制剂起效慢的问题；中药和益生菌配伍使用，起到了更好的预防和治疗效果。

附图说明

图1为鸡源大肠杆菌分子进化树；

图2为鸡源金黄色葡萄球菌分子进化树；

图3a-图3d为致病力测定病理解剖观察图；其中，图3a：喉管处有明显血斑；图3b：气管充血、肿胀；图3c：气管布满血点；图3d：心脏、肝脏包裹黄色干酪样物质，气囊黄色，不透明；

图4a-图4d为致病力测定气管显微结构观察图；其中，图4a：假复层纤毛柱状上皮细胞结合紧密，错落有致，纤毛紧密完整，粘膜层厚度均一；图4b：假复层纤毛柱状上皮各种细胞结合疏松，纤毛少量片状缺失；图4c：气管粘膜炎性细胞增多，粘膜下层增厚，部分粘膜层脱落，薄厚不均一，上皮细胞破损严重，气管纤毛脱落严重；图4d：大部分上皮细胞脱落，气管纤毛脱落严重，有的部位仅剩固有层与下面的软骨组织相连；

图5a-图5d为中药益生菌复合制剂筛选动物试验气管显微结构观察图；其中，图5a：CK组假复层纤毛柱状上皮细胞结合紧密，错落有致，纤毛紧密完整，粘膜层厚度均一；图5b：感染组G组大部分上皮细胞脱落，气管纤毛脱落严重，有的部位仅剩固有层与下面的软骨组织相连；图5c：F1p组气管部分区域上皮细胞脱落，气管纤毛脱落严重，有的部位仅剩固有层与下面的软骨组织相连；图5d：F2p组上皮细胞结合紧密，粘膜层增厚，纤毛完整，杯状细胞清晰可见。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：致病菌的分离

1.试验材料：

1.1病料：无菌采集泰安市周边患有呼吸道疾病鸡的喉管、气管、气囊、肺脏。

1.2培养基：普通营养肉汤琼脂培养基(NA)、鲜血琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基(EMB)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、SS培养基、麦康凯培养基(MAC)、巧克力琼脂培养基，上述培养基均购于青岛海博公司。

0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，购于北京陆桥技术有限责任公司。

1.3生化微量鉴定管：乳糖、葡萄糖、精氨酸、木糖-明胶、MR-VP、丙二酸盐、甘露醇、卫矛醇半固体、ONPG、西蒙氏枸橼酸盐、尿素酶、赖氨酸、无菌液体石蜡、Kovacs氏靛基质试剂盒，均购自青岛海博公司。

1.4分子生物学鉴定试剂：Taq DNA聚合酶(5IU/μL)、蛋白酶K、dNTPs、DNA提取试剂盒，均由宝生物(大连)有限公司提供，-20℃保存。

1.5试验动物：1日龄健康肉鸡若干，购自泰安大宇种禽厂。

1.6试验日粮：购自泰安六合饲料厂，饲料型号为510、511。1-21日龄饲喂510，22-42日龄饲喂511。

2.试验方法：

2.1细菌的分离培养：将无菌采集的病料喉管、气管、气囊、肺组织分别划线接种于EMB、MAC、TSA、鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基中，37℃恒温培养。鲜血琼脂培养基与巧克力琼脂培养基于5％(v/v)CO₂培养箱中厌氧培养。

2.2染色镜检：从各种选择性培养基中挑取具有代表性的典型菌落涂片、革兰氏染色镜检、纯化培养。保存菌种并标记好作为生化鉴定、PCR检测与药敏试验的菌种。

2.3生化鉴定：将分离所得可疑杆菌的纯培养物分别接种于乳糖、葡萄糖、精氨酸、木糖-明胶、MR-VP、丙二酸盐、甘露醇、卫矛醇半固体、ONPG、西蒙氏枸橼酸盐、尿素酶、赖氨酸生化微量鉴定管中，24h后观察结果。另外对分离球菌进行培养特性观察。

2.4引物设计与合成：16S rDNA通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：

F:5′-CGGCAACGAGCGCAACCC-3′，

R:5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′。

2.5分子鉴定：细菌DNA的提取按照细菌DNA提取试剂盒提取说明操作。以上述方法提取得到的菌株DNA为模板，PCR反应体系为50μL：模板2μL，PCR Master mix 25μL，ddH₂O21μL，上、下游引物(浓度均为10μmoL/L)各1μL，反应条件为预变性94℃4min，94℃30s、56℃80s、72℃30s，30个循环，72℃8min。取10μL PCR产物用1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳，观察PCR反应结果。剩余PCR产物送至铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

2.6同源性比对分析：将测得的序列提交GenBank，采用BLAST的方式将测得的序列与GenBank中公布的细菌16S rDNA序列进行同源性比对分析。

2.7细菌系统进化分析：将测序结果和相关种属代表菌株的16S rDNA部分序列用DNAStar程序中的MegAlign软件包进行分析，通过Clustal V Method法构建系统进化树。参考菌株如表1所示。

表1 参考菌株

2.8致病力测定：将分离鉴定后得到的细菌分别接种于TSB培养基中，置37℃摇床培养24h，应用平板稀释计数法计数，按1:1比例(v/v)将两种菌混合后，浓缩成1.6×10¹⁰cfu/mL。攻毒试验共分为CK、1、2、3组，共4个组，每组各12只。1、2、3组攻毒剂量分别为125μL、250μL、500μL 3个浓度梯度的混合浓缩菌液，CK组为空白对照。攻毒后进行外观观察，记录鸡只发病情况；攻毒7天、14天后各剖杀一半鸡只，取气管、喉管、肺进行病理观察；取气管、喉管采用活菌计数法计数；取0.8-1.5cm长度的气管于福尔马林固定液中固定，1周后送于山东农业大学制作石蜡切片，观察气管显微结构。

3.结果与分析：

3.1细菌的分离培养

通过各种选择性培养基筛选，共分离得到疑似致病菌菌株17株。在EMB上形成黑色带金属闪光、表面光滑、边缘整齐的菌落，在MAC上形成红色菌落，初步判断为大肠杆菌。在血平皿上形成光滑、隆起、圆形菌落，明显β溶血，疑似为金黄色葡萄球菌。

3.2细菌的形态学检查

将从选择培养基筛选得到的17株菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下见到11株革兰氏阴性的杆状菌和6株革兰氏阳性的球形菌。血平皿分离出的为球菌，成对存在。EMB培养基上分离出的为短杆菌，两端钝圆。

3.3生化鉴定结果

分离11株杆菌生化鉴定有6株菌在葡萄糖、乳糖、甘露糖和木糖微量生化鉴定管中均产气，并且培养基变成黄色；色氨酸和赖氨酸为阳性反应；尿素酶为阴性反应；M-R试验液体呈红色，为阳性反应；V-P试验液体不变色，为阴性反应；吲哚试验，乙醚层内出现玫瑰红色，为阳性反应。结果说明，这6株菌疑似大肠杆菌。2株尿素酶为阳性反应；1株不发酵甘露糖，为阴性反应，2株赖氨酸反应呈黄色为阴性。

分离球菌在TSB中培养18h-24h，肉汤呈均匀混浊，管底有少量沉淀物，振荡时以辫发状生长并消失。经48h-72h后，液面出现白色或灰白色菌环，管底形成粘稠的沉淀物，轻微振摇不散。说明分离球菌可能为葡萄球菌。

3.4PCR反应结果

结合革兰氏染色结果及生化鉴定结果，对11株分离杆菌进一步进行分子生物学鉴定。以提取的总DNA产物作为模板，用PCR方法扩增，经1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察，发现被检菌株有约1500bp的特异性条带，其大小与预期的扩增片段大小相符，说明PCR反应成功扩增出了目的片段。

3.5同源性比对分析结果

对11株菌16S rDNA序列进行测序。将测序结果与GenBank中细菌16S rDNA序列进行BLAST比对，发现一株为鸡源大肠杆菌，该分离菌株与FJ463819.1、FJ405310.1、HM576813.1、EF560791.1和GU586136.1同源性高达99％，确定为大肠杆菌。一株为鸡源葡萄球菌，该分离菌株与GQ222398.1、JQ082131.1、JQ0660298.1、HM629374.1、JN644522.1、KC443110.1和JN082258.1同源性高达99％，确定为金黄色葡萄球菌。与生化试验鉴定结果一致。

3.6细菌系统进化分析结果

构建分子进化树如图1、图2所示。由图1可知，本试验分离菌株与E.coli strainBEE15属于同一分支，进一步确定该菌株为大肠杆菌。由图2可知，本试验分离菌株与Sepidermidis strain FUA属于同一分支，进一步确定该菌株为金黄色葡萄球菌。

3.7致病力测定结果

3.7.1攻毒后外观观察发病情况

攻毒后试验组鸡只精神萎靡，打喷嚏，流鼻涕，张嘴伸脖呼吸，啰音。攻毒试验3组有2只鸡死亡。

3.7.2攻毒后病理解剖观察

攻毒组喉管处有明显血斑，气管充血肿胀，布满血点。心脏、肝脏包裹黄色干酪样物质。气囊黄色不透明。见图3。

3.7.3喉管、气管计数结果见表2。

表2 喉管、气管计数结果(单位：cfu/mL)

由表2可以看出，攻毒7d后试验2、3组细菌总数、大肠杆菌数量、金黄色葡萄球菌数量急剧增加。CK组(空白对照组)和试验1组数量相近。与对照组相比，3个试验组气管中的细菌总数、大肠杆菌数量、金黄色葡萄球菌数量也增加一个数量级。攻毒14d后，试验1组和对照组细菌总数、大肠杆菌数量有所增加。可能与鸡只日龄数有关。试验2组、3组喉管细菌总数有所下降，但气管中细菌总数上升一个数量级。

3.7.4气管显微结构观察

对照组CK组假复层纤毛柱状上皮细胞结合紧密，错落有致，纤毛紧密完整，粘膜层厚度均一；试验1组假复层纤毛柱状上皮各种细胞结合疏松，纤毛少量片状缺失；试验2组气管粘膜炎性细胞增多，粘膜下层增厚，部分粘膜层脱落，薄厚不均一，上皮细胞破损严重，气管纤毛脱落严重；试验3组大部分上皮细胞脱落，气管纤毛脱落严重，有的部位仅剩固有层与下面的软骨组织相连。见图4。

4.结论

经过致病菌选择性培养基筛选分离、生化鉴定和分子生物学鉴定后，得到一株金黄色葡萄球菌和一株大肠杆菌。试验3组攻毒剂量可造成鸡只死亡，使喉管气管细菌总数、大肠杆菌数、葡萄球菌数剧增，破坏呼吸道菌群平衡，造成喉管出现血斑，气管充血肿胀，布满血点，心脏、肝脏包裹黄色干酪样物质，气囊黄色不透明等生理解剖症状。显微结构观察发现气管粘膜炎性细胞增多，粘膜下层增厚，部分粘膜层脱落，薄厚不均一，上皮细胞破损严重，气管纤毛脱落严重。说明分离致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合感染能对鸡只造成呼吸道损伤，引发呼吸道疾病。

实施例2：中药与益生菌药敏试验

1.试验材料

1.1单味中药：茯苓、半夏、知母、桔梗、防风、穿心莲、乌梅、连翘、石榴皮、楟枥子、黄芩、秦皮、大青叶、黄莲、厚朴、板蓝根、金银花、柴胡、甘草、鱼腥草、麻黄。上述中药均购自泰安泰山区万宁大药房。

1.2益生菌：

芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌JYM 841、枯草芽孢杆菌B7348。

乳酸菌：戊糖片球菌PP、粪肠球菌SRG、植物乳杆菌LP。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JYM841，已于2014年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2014012；枯草芽孢杆菌B7348(Bacillussubtilis B7348)，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010260；戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PP，已于2012年02月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012029；粪肠球菌SRG(Enterococcus faecalis)，已于2010年03月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010046；植物乳杆菌LP(Lactobacillus plantarum)，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。

1.3中药复方：

中药复方1(F1)：乌梅16份、秦皮12份、陈皮8份、桔梗8份、厚朴8份、大青叶4份、连翘4份、茯苓4份。

中药复方2(F2):乌梅16份、石榴皮12份、甘草8份、陈皮8份、厚朴8份、鱼腥草4份、连翘4份、茯苓4份。

1.4培养基：

乳酸菌液体培养基成分：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6.0-6.5，在115℃条件下灭菌20min。

芽孢杆菌液体培养基成分：葡萄糖2g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、酵母膏5g/L、pH 7.0-7.4，在115℃条件下灭菌20min。

2.试验方法：

2.1中药药液的制备

单味中药药液的制备方法：21种中药采用常规水煎煮法，分别制备成浓度为1g/mL浓缩液，即每1mL相当于生药1g，4℃冷藏备用。

中药复方药液的制备方法：按组分量称取各原料药，混合，向混合后的原料药中加8倍体积(g/mL)的水，浸泡2h后，先用武火加热，待沸腾后再用文火加热1h，纱布过滤得到初滤液；

药渣复煎2次：

第二遍：加5倍于第一遍药渣的体积水(g/mL)，煎煮50min，过滤，得二级滤液；

第三遍：加5倍于第二遍药渣的体积水(g/mL)，煎煮30min，过滤，得三级滤液；

合并二、三级滤液，先旋转蒸发低温浓缩后再与初滤液混合，最终浓缩为1g/mL中药浓缩液，即每1mL相当于生药1g，4℃冷藏备用。

2.2病原菌及益生菌菌株的培养复壮

将实施例1分离得到的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌接种TSB培养基中，恒温37℃培养24小时，应用平板稀释计数法计数，确定浓度后摇匀菌液待用。将本实施例1.2中的芽孢杆菌分别接种到本实施例1.4芽孢杆菌液体培养基中，恒温37℃震荡培养24小时，菌液待用。将本实施例1.2中的乳酸菌分别接种到本实施例1.4乳酸菌液体培养基中，恒温37℃，静置培养24小时，菌液待用。

2.3单味中药抑菌试验

将本实施例1.1中21种单味中药采用牛津杯法对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌测定抑菌效果。抑菌效果判定标准按《中药药理学》介绍标准即：抑菌圈直径≥20mm为极敏，15-19mm为高敏，10-14mm为中敏，10mm以下为低敏。

2.4中药复方及浓度试验

测定本实施例2.1中制备的两种中药复方F1、F2对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果。分别将F1、F2进行10倍与100倍体积倍数稀释，进行中药复方浓度抑菌试验。

2.5益生菌抑菌试验

方法同本实施例2.3，将中药换成2.2制备的益生菌菌悬液。

3.试验结果

3.1单味中药抑菌试验结果

分离菌株中药抑菌试验结果显示21种中药只有11种中药显示出抑菌效果，其中乌梅、黄连、大青叶、甘草、厚朴对金黄色葡萄球菌为极敏，石榴皮对金黄色葡萄为高敏；秦皮、连翘、麻黄、黄芩、防风对金黄色葡萄球菌为中敏；乌梅对大肠杆菌为极敏，石榴皮、秦皮、连翘对大肠杆菌为中敏，黄连、麻黄、大青叶对大肠杆菌为低敏，结果见表3。乌梅对两株菌都有较好的抑菌效果，可能与其含有较高含量的延胡索酸等有机酸有关。

表3 单味中药药敏试验结果(单位：mm)

注:1代表鸡源大肠杆菌；2代表鸡源金黄色葡萄球菌。“-”表示肉眼观察不到抑菌圈。

3.2中药复方及浓度抑菌试验结果见表4。

表4 中药复方及浓度抑菌试验结果(单位：mm)

注：“-”表示肉眼观察不到抑菌圈。

从表4可以看出两个中药复方浓度均为1g/mL时对所有菌株都有抑菌效果，且方剂不同，不同菌株的敏感性也不同。F1、F2对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相近。F2对大肠杆菌的抑菌效果最好。中药浓度影响抑菌圈的大小，高浓度抑菌效果较好，浓度过低没有抑菌效果。

3.3益生菌抑菌试验结果

益生菌抑菌试验结果显示，枯草芽孢杆菌B7348对金黄色葡萄球菌为低敏，对大肠杆菌无抑菌效果。乳酸菌中植物乳杆菌LP对两株菌都具有抑菌效果，植物乳杆菌LP对金黄色葡萄球菌为中敏(12mm)，对大肠杆菌为低敏。乳酸菌的抑菌原因一方面由于产酸，另一方面可能与乳酸菌促进上皮细胞分泌黏蛋白有关。

4.结论

单味中药乌梅、石榴皮、秦皮具有较好的抑菌效果；两个中药复方F1和F2浓度为1g/mL时对金黄色葡萄球菌抑菌效果相近，中药复方F2对大肠杆菌抑菌效果最好。中药浓度为0.1g/mL时，F2仍然具有抑菌效果。结果表明，中药复方F2效果优于F1。

实施例3：中药益生菌复合制剂的筛选

1.试验材料

1.1试验动物：1日龄健康肉鸡80只，购自泰安大宇种禽厂。

1.2试验日粮：购自泰安六合饲料厂，饲料型号为510、511。1-21日龄饲喂510，22-42日龄饲喂511。

1.3试验药物：

实施例2制备的中药复方F1、F2；

益生菌：植物乳杆菌LP菌粉、枯草芽孢杆菌B7348菌粉。菌粉均由山东宝来利来生物工程股份有限公司提供。

1.4试验试剂：

血清生化指标测定试剂：血清因子总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)试剂盒，购买于科华生物公司。

10％(v/v)中性福尔马林固定液：无水磷酸氢二钠6.5g/L、磷酸二氢钠6g/L、40％(v/v)甲醛10％(v/v)。

2.试验方法：

2.1中药益生菌复合制剂的制备

中药复方F1、F2提取液的制备同实施例2。将植物乳杆菌LP菌粉、枯草芽孢杆菌B7348菌粉同时加入中药复方F1提取液中，制备成含植物乳杆菌LP和枯草芽孢杆菌B7348的活菌数均为10⁷cfu/mL的中药益生菌复合制剂1，命名为F1p。将植物乳杆菌LP菌粉、枯草芽孢杆菌B7348菌粉同时加入中药复方F2提取液中，制备成含植物乳杆菌LP和枯草芽孢杆菌B7348的活菌数均为10⁷cfu/mL的中药益生菌复合制剂2，命名为F2p。

2.2试验设计及饲养管理

将体重均匀、健康状况基本相同的80只1日龄AA肉鸡随机分为对照组(CK组)、中药益生菌复合制剂1组(F1p组)、中药益生菌复合制剂2组(F2p组)、感染组(G组)，每组2个重复，每个重复10只，CK组为空白对照组不攻毒，饲喂基础饲粮，正常饮水；F1p组、F2p组攻毒前5天在饮水中分别添加20g/L F1p和F2p，攻毒后继续饮水给药5天。G组为感染组，攻毒前后均不给药。试验鸡各重复采用分笼饲养，自由采食和饮水。舍内光照、温度和湿度严格按照常规饲养管理要求进行控制，按常规免疫程序对肉鸡进行新城疫及法氏囊免疫。每日换食、换水前进行食槽和饮水器杀菌消毒。

2.3样品采集及检测指标

攻毒后进行外观观察，记录鸡只发病情况；攻毒7天后剖杀鸡只，取气管、喉管、肺进行病理观察；取气管、喉管采用活菌计数法计数；取0.8cm-1.5cm长度的气管于福尔马林固定液中固定，1周后送于山东农业大学制作石蜡切片；剖杀时采血，凝固后3000rpm离心10min收集血清，生化分析仪测定其总蛋白、尿素氮等指标。试剂盒测定血清IgG含量。

2.4数据处理

试验数据采用SPSS17.0进行统计，采用One-way ANOVA进行方差分析，LSD法进行组间多重比较，结果均以平均数±标准差表示。

3.试验结果

3.1外观观察鸡只发病情况与死亡情况结果见表5。

表5 鸡只精神状况及死亡率

由表5可知，攻毒后，感染组发病率较高，死亡率达到20％，精神状况不佳；对照组所有鸡只精神状况良好，说明攻毒试验成功。

F1p组、F2p组由于攻毒前提前三天饲喂中药益生菌复合制剂，发病情况有所减缓，F2p组精神状况良好，没有出现死亡情况。F1p组个别鸡只状况不佳。结果表明，F2p配方较好。

3.2剖检情况观察

解剖鸡只时，感染组G组大多气管红肿、喉管有血斑、部分鸡只气囊、肝脏包裹黄色干酪样物质。F1p组、F2p组个别鸡只气管红肿、喉管有血斑。对照组气管透明、没有病变发生。

3.3喉管、气管计数结果见表6。

表6 细菌总数计数结果

从表6可以看出：CK组、F1p组与F2p组喉管细菌总数比气管细菌总数高一个数量级，而感染组G组喉管、气管细菌总数在一个数量级，这说明攻毒打破了气管与喉管菌群数量的平衡，使气管中细菌数量大量增殖(增加两个数量级)。

攻毒大肠杆菌、金黄色葡萄球菌后使G组和F1p组气管细菌总数均增加一个数量级；F2p组能降低致病菌的增殖，使细菌总数与CK组相当；F2p组在降低致病菌数量方面优于F1p组。说明F2p组中各种中药成分配伍更合理，起到更好的杀菌作用。

3.4气管显微结构观察结果

CK组假复层纤毛柱状上皮细胞结合紧密，错落有致，纤毛紧密完整，粘膜层厚度均一，见附图5a；感染组G组大部分上皮细胞脱落，气管纤毛脱落严重，有的部位仅剩固有层与下面的软骨组织相连，见附图5b；F1p组气管部分区域上皮细胞脱落，气管纤毛脱落严重，有的部位仅剩固有层与下面的软骨组织相连，见附图5c；F2p组上皮细胞结合紧密，粘膜层增厚，纤毛完整，杯状细胞清晰可见，见附图5d。

此结果可能与F2p组中的甘草有关，甘草中甘草酸、甘草次酸及甘草的黄酮类化合物是甘草对呼吸系统药理作用的活性成分，能保护发炎的咽喉和气管粘膜，消除病原菌对呼吸道造成的损伤。另外，石榴皮中含有多种被称为糅质的多元酚类化合物，这种化合物能够沉淀创口表面的蛋白质，从而防止创口的感染与刺激，对于创面的愈合有很好的促进作用。

3.5血清生化指标检测结果见表7。

表7 血清生化指标检测结果

注：同一行不同组别上标相同表示差异不显著(P＞0.05)，上标不相同标示差异显著(P＜0.05)。

由表7可知，CK组血清中尿素氮含量与其他各组差异不显著(P＞0.05)，F2p组尿素氮含量低于CK组和F1p组，且显著低于G组(P＜0.05)。F2p组总蛋白含量最高，高于CK组，且显著高于F1p组与G组(P＜0.05)，其他各组间差异不显著(P＞0.05)。

血清蛋白质是血液的重要组成部分，它不仅反映机体的营养状况，还有维持体液的胶体渗透压，进行离子转运、免疫及修补组织等作用。血清总蛋白浓度高是蛋白质代谢旺盛的表现。血清尿素氮是反映机体的营养状况以及蛋白质代谢水平的指标。乌梅可以帮助清扫血液，当血液净化时，使血液流动量正常化，新陈代谢就增强，达到增加血液中总蛋白含量，降低血液中尿素氮含量的作用。

3.6血清中免疫球蛋白含量测定结果见表8。

表8 血清IgG含量测定结果

注：同一行不同组别上标相同表示差异不显著(P＞0.05)，上标不相同标示差异显著(P＜0.05)。

球蛋白IgG是生物体液内主要的一类抗体，占血液中免疫球蛋白总量的70％-75％。在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方面，具有重要作用，能有效地抗感染。由表8可知，F2p组IgG含量最高，显著高于其他各组(P＜0.05)。CK组、F1p组和G组差异不显著(P＞0.05)，并且G组IgG含量最低。说明F2p组中药成分能有效提高血清中IgG含量。

4.结论

F2p能降低喉管、气管中致病菌的数量，减少致病菌对呼吸道造成的损伤，使上皮细胞结合紧密，粘膜层增厚，纤毛完整；提高IgG、总蛋白含量，降低尿素氮含量，促进蛋白质代谢，增强免疫能力，从而使鸡只发病率降低20％。原因一方面由于将几种中药合理配伍达到对呼吸系统抗菌、消炎、保护、修复及提高免疫力的作用。另一方面由于添加益生菌，充分利用中药与益生菌的协同作用。在充分发挥中药药效的同时促进益生菌在呼吸道内的定植，维护呼吸道菌群平衡。

实施例4：中药益生菌复合制剂浓度的筛选

1.试验材料：

1.1试验动物：1日龄健康肉鸡80只，购自泰安大宇种禽厂。

1.2试验日粮：购自泰安六合饲料厂，饲料型号为510、511。1-21日龄饲喂510，22-42日龄饲喂511。

1.3试验药物：本发明实施例3制备的中药益生菌复合制剂F2p。

2.试验方法：

2.1试验设计及饲养管理

将体重均匀、健康状况基本相同的80只1日龄AA肉鸡随机分为CK组、F2p-2‰组、F2p-5‰组、F2p-2％组，共4个组，每组2个重复，每个重复10只，CK组为阴性对照组，攻毒不给药，饲喂基础饲粮，正常饮水；试验组F2p-2‰组、F2p-5‰组、F2p-2％组分别将F2p以2g/L、5g/L、20g/L三个浓度添加于饮水中，攻毒前5天饮水给药，攻毒后继续给药，共饮水给药10天。饲养管理同实施例3。

2.2样品采集及检测指标

同实施例3。

2.3数据处理

同实施例3。

3.试验结果

3.1外观观察鸡只发病情况与死亡情况结果见表9。

表9 死亡率

从表9可以看出，与对照组相比，高剂量组(F2p-2％)能降低死亡率16.3％。低剂量组F2p-5‰和F2p-2‰虽然死亡率与对照组相同，但是由于分组时，较健康鸡只为CK组，轻微发病为低剂量组、严重发病为高剂量组。因此，低剂量组也能缓解病情发展，有一定的预防作用。

3.2喉管、气管计数结果见表10。

表10 喉管气管计数结果(单位：10⁴cfu/mL)

由表10可以看出，CK组中细菌总数、大肠杆菌数量最多，乳酸菌数量最少。随着中药浓度的增加，各中药益生菌复合制剂组喉管、气管中细菌总数、大肠杆菌数量逐渐减少，乳酸菌数量逐渐上升。很好的说明了中药能有效抑制致病菌大肠杆菌增殖，同时促进益生菌乳酸菌繁殖。

3.3气管切片观察结果

阴性对照CK组气管假复层上皮细胞损伤严重，几乎无可见纤毛，粘膜层变薄，厚度不均一；F2p-2‰组和F2p-5‰组气管粘膜层增厚，不均一，纤毛大部分完整；F2p-2％组假复层纤毛柱状上皮细胞结合紧密，错落有致，纤毛紧密完整，粘膜层增厚且厚度均一。

3.4血清生化指标检测结果见表11。

表11 血清生化指标检测结果

由表11可知，血清尿素氮含量各组间差异不显著(P＞0.05)，F2-2‰组尿素氮含量最低，阴性对照组含量最高。总体来说，各组间总蛋白含量差异不显著(P＞0.05)，高剂量组F2p-2％总蛋白含量最高，两个低剂量组总蛋白含量相当，但也略高于阴性对照CK组。

3.5血清免疫球蛋白IgG含量测定结果见表12。

表12 血清IgG含量测定结果

注：同一行不同组别上标相同表示差异不显著(P＞0.05)，上标不相同标示差异显著(P＜0.05)。

由表12可知，阴性对照组IgG含量最低，并且显著低于其他三组给药组(P＜0.05)；各给药组间IgG含量差异不显著(P＞0.05)，且随中药益生菌复合制剂浓度的提高而提高，可有效说明中药益生菌复合制剂对提高机体免疫方面的作用。

4结论

各添加中药益生菌复合制剂组均能降低喉管、气管中致病菌的数量，增加乳酸菌数量，维护呼吸道天然屏障菌群平衡，减少致病菌对呼吸道造成的损伤，使气管上皮细胞结合紧密，粘膜层增厚，纤毛完整；各给药组显著提高IgG含量，提高总蛋白含量，降低尿素氮含量，促进蛋白质代谢，增强免疫能力。高剂量组F2p-2％组使鸡只发病率降低16.3％，低剂量组F2p-5‰和F2p-2‰对缓解病情发展有一定的预防作用。

实施例5：中药益生菌复合制剂防治肉鸡呼吸道疾病的效果验证试验

1.试验材料：

1.1试验动物：1日龄健康肉鸡80只，购自泰安大宇种禽厂。

1.2试验日粮：购自泰安六合饲料厂，饲料型号为510、511。1-21日龄饲喂510，22-42日龄饲喂511。

1.3试验药物：本发明实施例3制备的中药益生菌复合制剂F2p、纯中药制剂F2(组方与本发明的中药益生菌复合制剂F2p中的中药组分一致，但未添加益生菌)、市场中药产品呼必欣(福建省希望生物科技有限公司)。

2.试验方法：

2.1试验设计及饲养管理

将体重均匀、健康状况基本相同的80只1日龄AA肉鸡随机分为CK组、F2p组、F2组、市场中药产品组，共4个组，每组2个重复，每个重复10只，CK组为阴性对照组，攻毒不给药，饲喂基础饲粮，正常饮水；试验组F2p组为本发明制备的中药益生菌复合制剂组，攻毒前5天以2g/L饮水给药，攻毒后继续给药5天，共饮水给药10天；F2组为纯中药组，组方与本发明的中药益生菌复合制剂中的中药组分一致，但未添加益生菌，用法用量同F2p组；市场产品组为饲喂市场产品呼必欣组，攻毒前5天以1.25mL/Kg饮水给药，攻毒后继续给药5天，共饮水给药10天。饲养管理同实施例3。

2.2样品采集及检测指标

攻毒后开始观察记录鸡只发病情况，统计发病率、死亡率；攻毒5天后剖杀鸡只，取气管、喉管采用活菌计数法计数；剖杀时采血，凝固后3000rpm离心10min收集血清，生化分析仪测定其总蛋白、尿素氮等指标。试剂盒测定血清IgG含量。

2.3数据处理

同实施例3。

3.试验结果

3.1外观观察鸡只发病情况与死亡情况结果见表13。

表13 发病、死亡情况统计结果

由表13可知，阴性对照组CK组发病情况最为严重，在攻毒后第2天就出现鸡只精神萎靡，呼吸不顺畅情况，攻毒后第5天死亡7只，死亡率为35％，说明攻毒试验成功；F2p组试验效果最好，攻毒后第5天只有2只出现轻微发病症状，无鸡只死亡，说明本中药益生菌复合制剂产品能快速有效地起到防治呼吸道疾病发生的作用；纯中药F2组，也能防治呼吸道疾病发生，但其防治效果不如F2p组，死亡率为20％；市场产品组死亡率与F2组相当，但发病情况较早，在攻毒第2天就出现鸡只发病情况，没有起到及时有效地预防作用。通过本试验说明中药益生菌的协同作用，中药能够促进益生菌定植，益生菌能促进中药的吸收和利用，从而起到及时有效的防治作用。

3.2喉管、气管计数结果见表14。

表14 喉管气管计数结果(单位：10⁴cfu/mL)

由表14可以看出，阴性对照组CK组由于外界病原菌的入侵，导致喉管、气管细菌总数和大肠杆菌总数大量繁殖，特别是大肠杆菌数量与其它各组相比，急剧增加，乳酸菌数量最少；F2p组喉管、气管细菌总数最少，尤其是大肠杆菌数量较少，同时乳酸菌数量增多；纯中药组F2组优于市场产品组，说明本试验纯中药组方可以抑制有害菌繁殖，促进有益菌生长。市场产品组，虽然也可以降低喉管、气管中细菌总数、大肠杆菌数量，但到攻毒后第5天检测时，乳酸菌数量与阴性对照组相差不大。由此可说明，中药益生菌复合制剂能短时间内降低喉管、气管中细菌总数、大肠杆菌数量，增加乳酸菌数量，快速维持呼吸道菌群平衡，从而达到预防鸡只发病，降低死亡率的目的。

3.3血清生化指标检测结果见表15。

表15 血清生化指标检测结果

注：同一行不同组别上标相同表示差异不显著(P＞0.05)，上标不相同标示差异显著(P＜0.05)。

由表15可知，F2p组BUN含量显著低于其他各组(P＜0.05)，F2组和市场产品组BUN显著低于CK组(P＜0.05)。总蛋白含量F2p组显著高于其他各组(P＜0.05)，其他三组间总蛋白含量差异不显著(P＞0.05)。此结果说明，中药益生菌复合制剂组能快速提高总蛋白含量，降低BUN含量，促进新陈代谢，增加毒素的清除速度。

3.4血清免疫球蛋白IgG含量测定结果见表16。

表16 血清IgG含量测定结果

注：同一行不同组别上标相同表示差异不显著(P＞0.05)，上标不相同标示差异显著(P＜0.05)。

由表16可以看出，F2p组血清显著高于其他各组(P＜0.05)，F2组和市场产品组也显著高于对照组(P＜0.05)，F2组与市场产品组IgG含量差异不显著(P＞0.05)，但数值上也是高于市场产品组。结果说明F2p组能快速提高机体内抗体水平，提高机体免疫力，迅速达到预防鸡只发病的目的。

4结论

中药益生菌复合制剂组能降低喉管、气管中大肠杆菌等致病菌的数量，增加乳酸菌数量，维护呼吸道天然屏障菌群平衡，有效预防致病菌在呼吸道的滋生繁殖；中药益生菌复合制剂能在短时间内显著提高IgG含量、总蛋白含量，显著降低尿素氮含量，促进新陈代谢，增强免疫能力，起效快，从而达到降低发病率的目的。

Claims (6)

1.一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，其特征在于，由中药提取液和益生菌的菌粉复配而成；

所述中药提取液的质量浓度为0.1-1g/mL，是由以下重量份的原料药经水煎煮制成的：

乌梅14-18份、石榴皮10-14份、甘草6-10份、陈皮6-10份、厚朴6-10份、鱼腥草2-6份、连翘2-6份、茯苓2-6份；

所述益生菌为芽孢杆菌或乳酸菌的一种或两种，该中药益生菌复合制剂中每种益生菌的活菌数均为10⁵cfu/mL-10⁹cfu/mL；

所述益生菌为保藏编号为CCTCC M 2010260的枯草芽孢杆菌B7348和保藏编号为CCTCCM 2010150的植物乳杆菌LP。

2.如权利要求1所述的一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，其特征在于，所述中药提取液是由以下重量份的原料药经水煎煮制成的：

乌梅16份、石榴皮12份、甘草8份、陈皮8份、厚朴8份、鱼腥草4份、连翘4份、茯苓4份。

3.如权利要求1或2所述的一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，其特征在于，所述中药提取液的质量浓度为1g/mL。

4.如权利要求1所述的一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂，其特征在于，所述中药益生菌复合制剂中每种益生菌的活菌数均为10⁷cfu/mL。

5.一种防治肉鸡呼吸道疾病的中药益生菌复合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)中药提取液的制备：

称取乌梅14-18份、石榴皮10-14份、甘草6-10份、陈皮6-10份、厚朴6-10份、鱼腥草2-6份、连翘2-6份、茯苓2-6份，混合，向混合后的原料药中加8-10倍体积的水，浸泡1-2h后，煎煮1-2h，过滤，得初滤液；药渣中加入4-6倍体积的水进行复煎，煎煮30-60min，过滤，得二级滤液；药渣中再加入4-6倍体积的水进行第二次复煎，煎煮30-60min，过滤，得三级滤液，合并二、三级滤液，先低温浓缩后再与初滤液混合，最终浓缩为质量浓度为0.1-1g/mL的中药提取液；

(2)向步骤(1)制备的中药提取液加入益生菌的菌粉，混合，制备得到含每种益生菌的活菌数均为105cfu/mL-109cfu/mL的中药益生菌复合制剂；

步骤(2)中，加入的益生菌为保藏编号为CCTCC M 2010260的枯草芽孢杆菌B7348和保藏编号为CCTCC M 2010150的植物乳杆菌LP。

6.权利要求1至4任一项所述的中药益生菌复合制剂在制备预防和/或治疗肉鸡呼吸道疾病的产品中的应用。