CN104686370A - 一种玛咖多倍体植株的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玛咖多倍体植株的培育方法，所述方法包括将消毒后的玛咖种子接种于空白B5培养基中，种子萌发后取其下胚轴接种于含较高秋水仙素的愈伤组织诱导培养基上培养，将获得的愈伤组织转接于含较低秋水仙素的丛芽诱导及增殖培养基中培养，之后继代增殖3-4代，获得玛咖多倍体丛生芽；当多倍体丛生芽长至3-4cm时，将单芽切下转接至生根培养基中，培养25d后即可得到玛咖多倍体试管苗；多倍体试管苗按常规进行炼苗3d后，移栽至装有消毒腐殖质的漂浮盘中，培养60d得到玛咖多倍体种苗。本发明优点在于愈伤组织阶段即可进行筛选，方法简单、诱导率高，嵌合体少，死亡率低，获得的多倍体材料能通过分生增殖获得大量多倍体试管苗，极大地缩短了诱导时间，诱导的多倍体植株品质优良且抗逆性强。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种药食两用植物新品种的选育方法，具体涉及一种玛咖多倍体植株的培育方法。
背景技术
玛咖Lepidiummeyenii为十字花科（Brassicaceae）独行菜属（Lepidium）一年生草本植物，原产于秘鲁海拔 3500 m 以上的安第斯山区，可在无肥料、缺氧、昼夜温差大、长期冰封的独特环境下正常生长。玛咖在营养成分和增强精力、耐力的功效方面可以与人参媲美，因此又常被称为“Peruvian Ginseng（秘鲁人参）”。由于玛咖在生长中吸取了大量的土壤养分，原始耕作情况下，玛咖根采收后的土地需要休耕数年才能再次种植，因此玛咖一度曾濒临绝种，被国际上列为濒危植物。直到 1982 年，在联合国粮农组织（FAO）和国际植物遗传资源研究所（IPGRI）等国际组织的努力下，这种珍贵的植物才得以逐步推广，嘉惠世人。此后，FAO 等国际组织又先后多次向各国推荐种植和食用玛咖，并指出玛咖是一种营养丰富的安全食物，可以解决多种因营养不足引起的健康问题。玛咖自2002年引进中国以来，十分适宜在我国西部高寒地区生长，现已在云南会泽，新疆，西藏等地成功种植，并开始了产品加工，具有很好的市场前景，同时对改善西部生态环境、发展当地经济也将起到积极的推动作用。玛咖在中国的种植现主要集中在云南（占全国的98%），新疆（占全国的1%），西藏（占全国的0.5%），四川（占全国的0.5%），种植海拔在2500米以上。云南现有的种植规模已有10000亩左右，年产玛咖干果干片原料250吨，目前已基本满足初级市场的需求量。但随着市场的扩大，参照国外市场看，最终将会形成以玛咖食品、保健品、药品、食品添加剂、药品添加剂等形态的玛咖产业链，玛咖原料的需求量将会出现井喷现象。对此，云南省政府已经出台了“加快玛咖产业发展的若干意见”，将玛咖产业列为十二五重点发展的农业及生物产业对象，提出5年内建设5万亩的目标，至十二五结束达到15—20万亩的目标。
植物多倍体的典型遗传特征是营养器官的巨大性，特别是对地下变态营养器官如块根类植物具有特殊的增产效果，在以此类营养器官入食、入药的植物上具有重要的育种价值；同时植物多倍体提高了主要化学成分含量，可大幅度提高栽培植物的品质。这些对于以块根为入食、入药的玛咖来说，更是意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有玛咖品质及产量较低的问题，提供一种玛咖多倍体植株的培育方法，选育出一批多倍体玛咖新种质，为玛咖多倍体育种奠定技术基础，同时亦可提供基因型背景一致的多倍体种苗以满足人工种植的需求。
为了解决以上所述技术问题，本发明所述玛咖多倍体植株的培育方法包括以下步骤：
（1）以B5为基本培养基，附加蔗糖20000mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得培养基A；用细纱布将玛咖种子按100粒/包，包好放到流水下冲洗2 h后，置于超净工作台上，用体积比75％的酒精浸泡60 s，再用质量比0.1％HgCl2灭菌8 min，最后用无菌水冲洗10次，每次不低于2 min，之后放在无菌滤纸上，打开细纱布吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的种子，将所述消毒灭菌后的玛咖种子接种于所述基培养基A中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，进行种子萌发；
（2）以B5为基本培养基，附加萘乙酸NAA1.5-2.0 mg/L、玉米素ZT0.1-1.0 mg/L、秋水仙素0.5-2.0 mg/L、蔗糖20000mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得愈伤组织诱导培养基B；所述步骤（1）中种子培养5-7d，幼苗子叶完全展开，将下胚轴切为0.5-1.0 cm大小，转接至所述愈伤组织诱导培养基B中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养5d后有愈伤组织出现，20d后愈伤组织生长迅速，质地紧密，表被白色绒毛；
（3）以B5为基本培养基，附加6-苄胺基嘌呤6-BA1.0-2.0 mg/L、萘乙酸NAA1.5-2.0 mg/L、玉米素ZT0.1-1.0 mg/L、秋水仙素0.05-0.5 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得丛生芽诱导与增殖培养基中C；将所述步骤（2）中培养的愈伤组织切割为0.5-1.0 cm2大小，转接至所述丛生芽诱导与增殖培养基C中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养20d，待丛生芽生长旺盛时，将丛生芽切割为3-5芽一丛，转接至另一个新鲜的所述丛生芽诱导与增殖培养基C中，如此反复继代增殖3-4代，即获得玛咖多倍体芽；
（4）以1/2B5为基本培养基，附加萘乙酸NAA0.1-0.5 mg/L、吲哚丁酸IBA0.1-0.5 mg/L、活性炭AC0.5-1.5 mg/L、蔗糖10000 mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得生根培养基D；切取所述步骤（3）所得的多倍体芽中高3-4 cm、生长健壮的单芽接种于所述生根培养基D中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后获得玛咖多倍体试管生根苗；
（5）取所述步骤（4）所得的高6-8cm的生根苗置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从所述生根培养基D中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1-0.2%的多菌灵溶液中消毒2-3 min后，移栽至装有经消毒的腐殖质的漂浮盘中，保持18-25℃温度漂浮培养60 d后，即得玛咖多倍体移栽苗。
本发明的有益效果：由于使用了以上所述技术方案，本发明具有以下优点：
1、本发明所述玛咖多倍体植株的培育方法，与传统秋水仙素处理茎尖生长点不同。本发明以玛咖无菌种子萌发后的下胚轴为材料，直接在含较高浓度秋水仙素的培养基中诱导多倍性愈伤组织，可从不含秋水仙素培养基中的对照材料中直观地分辨出倍性发生变化的愈伤组织；继而在含较低浓度秋水仙素的继代增殖培养基中反复继代3-4次，获得性状明显的多倍体丛生芽；待多倍体试管苗移栽成活后，利用根尖检测其染色体数为2n = 16x = 128；筛选方法简单、诱导率高，嵌合体少，死亡率低，极大地缩短了诱导时间；
2、克服了传统化学诱变中常见的嵌合体现象、低成活率以及诱导率较低等难题；
3、克服了由于人工诱变产生的同源多倍体植株高度不育而导致多倍体种苗生产困难的难题，获得的多倍体材料能通过分生增殖获得大量多倍体试管苗，为规模化生产提供了技术基础；
4、实现了高效快繁的目的，20 d为一个培养周期，繁殖系数可达4.0以上；
5、用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统化学诱变茎尖生长点浸泡法无法周年进行生产的难点；
6、与现有玛咖育种技术相比，诱导的多倍体植株品质优良且抗逆性强。
附图说明
图1为倍性发生变化的愈伤组织；
图2为普通玛咖丛生芽；
图3为加倍后玛咖丛生芽；
图4为基部愈伤组织；
图5为多倍体生根试管苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明所述玛咖多倍体植株的培育方法包括以下步骤：
（1）以B5为基本培养基，附加蔗糖20000mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得培养基A；用细纱布将玛咖种子按100粒/包，包好放到流水下冲洗2 h后，置于超净工作台上，用体积比75％的酒精浸泡60 s，再用质量比0.1％HgCl2灭菌8 min，最后用无菌水冲洗10次，每次不低于2 min，之后放在无菌滤纸上，打开细纱布吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的种子，将所述消毒灭菌后的玛咖种子接种于所述基培养基A中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，进行种子萌发；
（2）以B5为基本培养基，附加萘乙酸NAA1.5-2.0 mg/L、玉米素ZT0.1-1.0 mg/L、秋水仙素0.5-2.0 mg/L、蔗糖20000mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得愈伤组织诱导培养基B；所述步骤（1）中种子培养5-7d，幼苗子叶完全展开，将下胚轴切为0.5-1.0 cm大小，转接至所述愈伤组织诱导培养基B中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养5d后有愈伤组织出现，20d后愈伤组织生长迅速，质地紧密，表被白色绒毛；
（3）以B5为基本培养基，附加6-苄胺基嘌呤6-BA1.0-2.0 mg/L、萘乙酸NAA1.5-2.0 mg/L、玉米素ZT0.1-1.0 mg/L、秋水仙素0.05-0.5 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得丛生芽诱导与增殖培养基中C；将所述步骤（2）中培养的愈伤组织切割为0.5-1.0 cm2大小，转接至所述丛生芽诱导与增殖培养基C中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养20d，待丛生芽生长旺盛时，将丛生芽切割为3-5芽一丛，转接至另一个新鲜的所述丛生芽诱导与增殖培养基C中，如此反复继代增殖3-4代，即获得玛咖多倍体芽；
（4）以1/2B5为基本培养基，附加萘乙酸NAA0.1-0.5 mg/L、吲哚丁酸IBA0.1-0.5 mg/L、活性炭AC0.5-1.5 mg/L、蔗糖10000 mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得生根培养基D；切取所述步骤（3）所得的多倍体芽中高3-4 cm、生长健壮的单芽接种于所述生根培养基D中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后获得玛咖多倍体试管生根苗；
（5）取所述步骤（4）所得的高6-8cm的生根苗置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从所述生根培养基D中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1-0.2%的多菌灵溶液中消毒2-3 min后，移栽至装有经消毒的腐殖质的漂浮盘中，保持18-25℃温度漂浮培养60 d后，即得玛咖多倍体移栽苗。
实施例一：
1、用细纱布将玛咖种子按100粒/包，放到流水下冲洗2 h后，置于超净工作台上用75％（体积比）酒精浸泡60 s，再用0.1％HgCl2（升汞）（质量比）灭菌8 min，最后用无菌水冲洗10次，每次不低于2 min，之后放在无菌滤纸上打开细纱布吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的种子；在整个消毒过程中充分摇动器皿；
2、愈伤组织诱导 将所述步骤1所得的消毒灭菌种子接入下列培养基A中：
B5基本培养液
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.6
在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，进行种子萌发培养；
3、所述步骤2培养基A中的种子培养5-7 d，幼苗子叶完全展开，将下胚轴切为0.5-1.0 cm大小，转接至以下愈伤组织诱导培养基B中：
B5基本培养液
萘乙酸NAA 1.5 mg/L
玉米素ZT 0.5 mg/L
秋水仙素 1.5 mg/L
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.6
在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养5 d后有愈伤组织出现，20 d后愈伤组织生长迅速，质地紧密，表被白色绒毛；
4、将所述步骤3愈伤组织诱导培养基B中培养的愈伤组织切割为0.5-1.0 cm2大小，转接至以下丛生芽诱导与增殖培养基C中：
B5基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 2.0 mg/L
萘乙酸NAA 1.5mg/L
玉米素ZT 0.5 mg/L
秋水仙素 0.1 mg/L
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.6
在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养20 d，待丛生芽生长旺盛，即丛生芽发生且具明显生长量时，将丛生芽切割为3-5芽一丛转接至相同的新鲜的丛生芽诱导与增殖培养基C中，如此反复继代增殖3-4代，即获得玛咖多倍体芽；
5、切取所述步骤4所得多倍体芽中高3-4 cm、生长健壮的单芽接种于下列生根培养基D中：
1/2B5基本培养液
萘乙酸NAA 0.2 mg/L
吲哚丁酸IBA 0.5 mg/L
活性炭AC 1.0 mg/L
蔗糖 10000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.6
在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后获得玛咖多倍体试管生根苗；
6、取所述步骤5约6-8cm高的生根植株置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1-0.2%的多菌灵溶液中消毒2-3 min后，移栽至装有消毒后的腐殖质的漂浮盘中，保持18-25℃温度漂浮培养60 d后，即得玛咖多倍体移栽苗，成活率可达100%。
实施例二：本实施例所述玛咖种子的选取、消毒等处理，接种、培养方法、步骤及培养条件均与实施例一相同，各培养基成分有所不同，具体如下：
（1）培养基A：
B5基本培养液
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.8
（2）愈伤组织诱导培养基B：
B5基本培养液
萘乙酸NAA 1.8mg/L
玉米素ZT 0.1 mg/L
秋水仙素 1.0 mg/L
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.8
（3）丛生芽诱导与增殖培养基C：
B5基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0 mg/L
萘乙酸NAA 2.0mg/L
玉米素ZT 0.3 mg/L
秋水仙素 0.2 mg/L
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.8
（4）生根培养基D：
1/2B5基本培养液
萘乙酸NAA 0.5 mg/L
吲哚丁酸IBA 0.2 mg/L
活性炭AC 0.6 mg/L
蔗糖 10000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.8
实施例三：本实施例所述玛咖种子的选取、消毒等处理，接种、培养方法、步骤及培养条件均与实施例一相同，各培养基成分有所不同，具体如下：
（1）培养基A：
B5基本培养液
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.4
（2）愈伤组织诱导培养基B：
B5基本培养液
萘乙酸NAA 2.0mg/L
玉米素ZT 1.0 mg/L
秋水仙素 2.0 mg/L
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.4
（3）丛生芽诱导与增殖培养基C：
B5基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 1.5 mg/L
萘乙酸NAA 1.8mg/L
玉米素ZT 1.0 mg/L
秋水仙素 0.5 mg/L
蔗糖 20000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.4
（4）生根培养基D：
1/2B5基本培养液
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
吲哚丁酸IBA 0.3 mg/L
活性炭AC 1.5 mg/L
蔗糖 10000 mg/L
琼脂粉 4800 mg/L
pH 5.4
本发明将化学诱变技术与组织培养技术结合进行玛咖无性多倍体诱变育种，具有独特的优势，一方面克服了传统化学诱变中常见的嵌合体现象、低成活率以及诱导率较低等难题；另一方克服了由于人工诱变产生的同源多倍体植株高度不育而导致多倍体种苗生产困难的难题。本发明所述方法，多倍性在愈伤组织阶段即可进行筛选，筛选方法简单、诱导率高，嵌合体少，死亡率低，极大地缩短了诱导时间；获得的多倍体材料能通过分生增殖获得大量多倍体试管苗，为规模化生产提供了技术基础。同时，与现有玛咖育种技术相比，诱导的多倍体植株品质优良且抗逆性强。
以上仅为本发明的部分实施方式，本领域技术人员看过以上所述说明书内容，可知本发明所述技术方案可有多种实施方式，只要使用了以上所述技术方案，均应落入本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种玛咖多倍体植株的培育方法，其特征在于，所述培育方法包括以下步骤：
（1）以B5为基本培养基，附加蔗糖20000mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得培养基A；用细纱布将玛咖种子按100粒/包，包好放到流水下冲洗2 h后，置于超净工作台上，用体积比75％的酒精浸泡60 s，再用质量比0.1％ HgCl2灭菌8 min，最后用无菌水冲洗10次，每次不低于2 min，之后放在无菌滤纸上，打开细纱布吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的种子，将所述消毒灭菌后的玛咖种子接种于所述基培养基A中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，进行种子萌发；
（2）以B5为基本培养基，附加萘乙酸NAA 1.5-2.0 mg/L、玉米素ZT 0.1-1.0 mg/L、秋水仙素0.5-2.0 mg/L、蔗糖20000mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得愈伤组织诱导培养基B；所述步骤（1），种子在所述培养基A中培养5-7d后，幼苗子叶完全展开，将下胚轴切为0.5-1.0 cm大小，转接至所述愈伤组织诱导培养基B中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养5d后有愈伤组织出现，20d后愈伤组织生长迅速，质地紧密，表被白色绒毛；
（3）以B5为基本培养基，附加6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0-2.0 mg/L、萘乙酸NAA 1.5-2.0 mg/L、玉米素ZT 0.1-1.0 mg/L、秋水仙素0.05-0.5 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得丛生芽诱导与增殖培养基中C；将所述步骤（2）中培养的愈伤组织切割为0.5-1.0 cm2大小，转接至所述丛生芽诱导与增殖培养基C中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养20d，待丛生芽生长旺盛时，将丛生芽切割为3-5芽一丛，转接至另一个新鲜的所述丛生芽诱导与增殖培养基C中，如此反复继代增殖3-4代，即获得玛咖多倍体芽；
（4）以1/2B5为基本培养基，附加萘乙酸NAA 0.1-0.5 mg/L、吲哚丁酸IBA 0.1-0.5 mg/L、活性炭AC 0.5-1.5 mg/L、蔗糖10000 mg/L和琼脂粉4800mg/L，调整pH值为5.4-5.8，制得生根培养基D；切取所述步骤（3）所得的多倍体芽中高3-4 cm、生长健壮的单芽接种于所述生根培养基D中，在光照度1500-2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后获得玛咖多倍体试管生根苗；
（5）取所述步骤（4）所得的高6-8cm的生根苗置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从所述生根培养基D中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1-0.2%的多菌灵溶液中消毒2-3 min后，移栽至装有经消毒的腐殖质的漂浮盘中，保持18-25℃温度漂浮培养60 d后，即得玛咖多倍体移栽苗。
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