CN104650244A - 一种具有降血糖兼调脂作用的新型表位组合肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有调脂作用且能降低STZ诱导的1型糖尿病血糖值的新型双表位肽。运用B细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具对糖尿病并发症相关蛋白HMG-COA还原酶的B细胞抗原表位进行分析，获得的B表位肽HGRWIADPSPQNSTT与P277肽C端抗1型糖尿病T表位肽相连，得到28肽H278P，其序列为：HGRWIADPSPQNSTTIPALDSLTPANED，通过背部皮下免疫途径能调脂且降低STZ诱导的C57BL/6J小鼠的1型糖尿病血糖值，同时本发明提供的新型表位组合肽也可以用于重组微生物和转基因动物或植物，使它们作为生产工厂，能够生产该新型肽或制作口服疫苗，能够用来降血糖并调节血脂，并且可用于糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病的预防或治疗。

Description

一种具有降血糖兼调脂作用的新型表位组合肽及其用途

技术领域

本发明涉及一种新型肽及其用途，尤其是具有降血糖兼调脂作用的新型双表位肽及其用途，以及含有该新型肽及其主要组成片段的衍生物和类似物的药物制剂与药物组合物，本发明涉及药学及医学相关领域。

背景技术

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，胰岛素绝对缺乏为1型糖尿病，胰岛素相对缺乏为2型糖尿病。1型糖尿病又名胰岛素依赖型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM)是由遗传和环境因素相互作用而引起的一种自身免疫性疾病。由于机体自身反应性免疫应答攻击胰岛β细胞，使其遭破坏、功能缺失，从而导致胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病。由于β细胞具有产生胰岛素和调节血糖的功能，β细胞群的毁坏最终导致了血糖的失调和高糖血症的发生。T1DM是由T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，自身免疫性疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态。通过一定的免疫途径来诱导机体对致自身免疫性疾病自身抗原的耐受能有效预防自身免疫性疾病的发生。糖尿病带来的危害，几乎都来自它的并发症。

动脉粥样硬化是糖尿病的主要并发症，是糖尿病患者死亡和致残的重要原因，临床观察表明，无论1型或2型糖尿病，常伴有动脉粥样硬化性心脑血管疾病。糖尿病人因心肌梗死而死亡者，可占糖尿病死亡人数的75％-80％。同样，在冠心病人群中，高血糖人群占总人群的2/3，动脉粥样硬化常常伴随着血脂尤其是胆固醇的升高，高血脂是冠心病、心肌梗死、等心血管疾病的危险因素。实验研究表明，多次小剂量注射STZ不仅可以诱导T1DM模型，且该模型小鼠血清总胆固醇与甘油三酯会显著升高。正常情况下胆固醇对于维持细胞膜的完整性和体内生命活动具有重要的意义，但体内过多的胆固醇会引起动脉粥样硬化等心脑血管疾病。HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，EC：1.1.1.34)是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶，抑制HMG-CoA还原酶能阻碍内源性胆固醇合成。因此抑制HMG-CoA还原酶活性来阻碍胆固醇的合成，可降低血胆固醇水平从而预防动脉粥样硬化，同时降低临床心脑血管事件的发生概率。研究表明，在血脂降低程度相似的条件下，糖尿病和非糖尿病患者的相对危险分别降低了21％与23％。

P277肽是HSP60的437～460位的一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在T1DM中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前已进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行给药，能引起血管内皮细胞损伤，并诱发肌体产生抗体从而诱发严重的动脉粥样硬化；将P277分成P1肽段(437～450)和P2肽段(448～460)两部分，发现P1多肽为诱发机体产生抗体的B表位肽段，具有促动脉粥样硬化作用，而P2为主要的抗糖尿病T表位肽段，没有诱发动脉粥样硬化。

B细胞是主要的抗原提呈细胞，而B细胞表位可以通过刺激B细胞反应以及与Th2型T淋巴细胞的相互作用来增强抗炎免疫功能。尽管T表位是主要的效应表位而B细胞表位仅是辅助性表位，B细胞表位仍然在抗T1DM中扮演着重要角色。我们运用B细胞表位预测软件以及在线预测工具，对糖尿病并发症动脉粥样硬化相关蛋白HMG-CoA还原酶B细胞抗原表位分析，选择一个线形B表位插入P2肽段的N端，形成新型双表位肽H278P，该双表位肽可能具有降血糖，调节血脂以及预防或治疗糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病的作用。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是提供一种具有显著降糖与调脂效果的新型双表位肽H278P。

技术方案：

一种新型双表位肽H278P，由28个氨基酸组成，其特征是一个双表位组合物，由HMG-CoA还原酶的线性B表位HGRWIADPSPQNSTT与P277肽C端抗糖尿病的T表位IPALDSLTPANED组合而成，其氨基酸序列为：HGRWIADPSPQNSTTIPALDSLTPANED。

所述的新型双表位肽疫苗以及含有该序列的多肽在制备降血糖与调脂产品中的应用，所述新型双表位肽在预防或治疗糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病中的应用。

所述的新型肽通过氨基酸修饰、置换得到的氨基酸序列在制备降血糖与调脂产品以及在预防或治疗糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病中的应用。

所述含新型肽的药物组合物，其特征在于新型肽和一种或多种药学上可接受的辅料、药物活性物质或药学可接受的载体。

所述以新型双表位肽H278P为有效成分的制剂为含有H278P的注射剂、缓释剂、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或者口服液。

所述的辅料为填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水等。

所述的药物活性物质为胰岛素及其类似物、GLP-1及其类似物、Exendin-4及其类似物、双胍类、磺脲类；其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍；磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平；降低胆固醇的他汀类药物；抗血小板聚集药物；噻唑烷二酮类药物。他汀类药物包括洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀；抗血小板凝集药物包括阿司匹林、双嘧达莫、前列环素、噻氯匹啶；噻唑烷二酮类药物包括吡格列酮、罗格列酮；所述的药物载体为热休克蛋白HSP60/65、门冬酰胺酶、门冬酰胺酶-TTP、门冬酰胺酶-TTP-CETPC。

所述的组合物在制备降血糖与调脂产品以及在预防或治疗糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病中的应用。

一种新型肽疫苗的制备方法，其特征在于其氨基酸序列的确定按照如下步骤实现：

运用B细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具筛选出糖尿病并发症相关蛋白B细胞抗原表位HGRWIADPSPQNSTT，插入P2肽段IPALDSLTPANED的N端，形成新型双表位肽H278P，由28个氨基酸组成。

有益效果：

P277肽437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460是HSP60一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在T1DM中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前已进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行给药，能引起血管内皮细胞损伤，并诱发肌体产生抗体从而诱发严重的动脉粥样硬化，并将P277分成P1肽段(437～450)和P2肽段(448～460)两部分，发现P1多肽为诱发机体产生抗体的B表位肽段，具有促动脉粥样硬化作用，而P2为抗糖尿病T表位肽段，没有诱发动脉粥样硬化。

本发明的优点在于用HMG-CoA还原酶(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，EC：1.1.1.34)线性B细胞抗原表位替换了P277中有促动脉粥样硬化作用的P1肽段(437～450)，插入到P2肽段的上游N端，获得一种能够有效降糖与调脂的新型双表位肽H278P。

附图说明

图1ESI-MS测定本发明新型肽H278P的分子量。

图2新型双表位肽对STZ造模后的糖尿病小鼠治疗实验中的血糖值的影响。

图3新型双表位肽对STZ造模后的糖尿病小鼠治疗实验中血脂的影响(A：成模后第7周与第13周胆固醇水平；B：成模后第7周与第13周甘油三酯水平；C：成模后第7周与第13周高密度脂蛋白胆固醇水平)。

具体实施方式

实施例1：新型多肽H278P的制备过程

合成一种新型双表位肽其氨基酸序列为：HGRWIADPSPQNSTTIPALDSLTPANED(命名为H278P，见SEQ ID NO.1)，P277(VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED，见SEQ ID NO.2)上述肽类均由吉尔生化上海有限公司采用FMOC固相合成法合成，HPLC检测纯度＞90％。

H278P具体合成过程如下：

1.选择树脂

多肽合成按照序列反向合成，多肽是从C端向N端开始连接，首先Fmoc-Asp(Otbu)-OH Wang Resin；

2.去除Fmoc

将去保护液(20％六氢吡啶和80％DMF)加入反应器，用氮气吹30min左右，然后抽掉，用DMF清洗5-6遍，然后检测树脂颜色(一般呈蓝色或棕色)。在接下一个氨基酸前要去掉上一个氨基酸氨基上的保护基团。

3.氨基酸的缩合

去保护后把准备好的原料和固体缩合剂(tbtu、hobt)加入反应器，然后加入DMF并通入氮气。在氨基酸和缩合剂完全溶解后加入相应的液体激活剂(DIEA)进行反应。原料与固体激活剂投料量一般都是三倍。反应一定的时间后，取少量树脂检测，当树脂呈无色透明时，表明反应完全。

4.切割

将合成好的多肽加入到切割液中，搅拌器搅拌2-3h之后滤出切割液，在其中加入乙醚，多肽即能析出。滤纸过滤得到多肽，然后用乙醚洗4-5遍得到粗品肽。

5.多肽纯化

将粗品肽抽干后纯化，得到HPLC纯度＞90％的纯品。

ESI-MS检测合成肽分子量，结果见图1.新型肽H278P分子量为3016.3。

实施例2：H278P的药效学评价

1.糖尿病模型鼠的建立

采用小剂量连续多次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠1型糖尿病模型。4周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自扬州大学比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004。)用0.1MpH4.4柠檬酸盐缓冲液配置STZ，按40mg/kg剂量腹腔注射，每日1次，连续注射5次。

2.动物免疫治疗实验

于造模后连续两周测定血糖高于11.1mmol/1为高血糖模型，30只糖尿病模型小鼠分成3组，每组10只，使每组血糖趋于一致，分别为：溶剂对照组(阴性对照组)、P277组(阳性对照组)、H278P组。给药组药物浓度均为1mg/ml，皮下注射给药量为100μg/只/次，即100μl药液；阴性对照组：100μl油剂/只/次。药物配置方法按1mg+40mg甘露醇溶于1ml20％Lipofundin的比例配置油剂，于成膜后第2天免疫，连续5周每周免疫1次，之后隔周免疫4次，采用背部皮下免疫的方式，并定期测定血糖值。

测定血糖的同时，采用毛细管经小鼠眼内眦球后静脉丛取血；离心2次分离血清，得到的血清于-20℃冻存一天后，转到-70℃冰箱保存，用于检测血脂各项指标。

数据以平均值±SD值表示，用SPSS 17.0软件进行统计学处理，各组间差异性比较采用独立样本t检验。与溶剂组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与P277组相比，#P＜0.05。

3.对糖尿病小鼠血糖趋势的影响

于成膜后第2天免疫，连续5周每周免疫1次，之后隔周免疫4次，测定血糖时将糖尿病小鼠断尾取血，并用血糖监测仪检测小鼠血糖水平。结果如图2所示，糖尿病小鼠在给予H278P治疗后，血糖水平从第7周开始低于溶剂对照组(Placebo)与P277组，第7周与P277组有显著差异(P＜0.05)，第9周与溶剂组有显著差异(P＜0.05)，第8周与第12周与溶剂组相比有极显著差异(P＜0.01)。

4.对糖尿病小鼠血脂的影响

用北京北化康泰临床试剂有限公司血脂试剂盒检测成模后溶剂组、P277组、H278P组第7周、第13周小鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量，结果如图3所示，成模后第7周，H278P组血清总胆固醇显著低于溶剂对照组，相比有显著差异(P＜0.05)(图3A)，成模后第7周，甘油三酯显著低于P277组，相比有显著差异(P＜0.05)(图3B)，成模后第13周甘油三酯显著低于溶剂对照组与P277组，与溶剂组相比差异极显著(P＜0.01)(图3B)，与P277组相比差异显著(P＜0.05)(图3B)，成模后第13周，高密度脂蛋白胆固醇高于溶剂组，与溶剂组相比差异显著(P＜0.05)(图3C)。

结论：本发明提供的双表位抗原肽可以显著降低STZ诱导的C57BL/6J小鼠1型糖尿病血糖值，显著降低血清中总胆固醇水平，显著降低血清中甘油三酯水平，并且在后期可以显著升高高密度脂蛋白胆固醇水平。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的某些实例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应该理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种双表位肽，由28个氨基酸组成，如序列见SEQ ID NO：1。其特征在于由HMG-CoA还原酶的B表位与P277肽C端抗糖尿病T表位组合而成。

2.根据权利要求1所述的肽以及含有上述氨基酸的序列或通过氨基酸修饰、置换得到的氨基酸序列在制备降血糖与调脂产品中的应用。

3.根据权利要求1所述的肽以及含有上述氨基酸的序列或通过氨基酸修饰、置换得到的氨基酸序列在预防或治疗糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病中的应用。

4.根据权利要求1所述的新型双表位肽的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1中所述的新型双表位肽和一种或多种药学上可接受的辅料、药物活性物质或药学可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述以新型双表位肽H278P为有效成分的制剂为含有H278P的注射剂、缓释剂、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或者口服液。

6.根据权利要求4所述的辅料为填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水等。

7.根据权利要求4所述，所述的药物活性物质为胰岛素及其类似物、GLP-1及其类似物、Exendin-4及其类似物、双胍类、磺脲类；其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍；磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平；降低胆固醇的他汀类药物；抗血小板聚集药物；噻唑烷二酮类药物。他汀类药物包括洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀；抗血小板凝集药物包括阿司匹林、双嘧达莫、前列环素、噻氯匹啶；噻唑烷二酮类药物包括吡格列酮、罗格列酮。

8.根据权利要求4所述，所述的药物载体为热休克蛋白HSP60/65、门冬酰胺酶、门冬酰胺酶-TTP、门冬酰胺酶-TTP-CETPC。

9.根据权利要求4所述的组合物在制备降血糖与调脂产品中的应用。

10.根据权利要求4所述的组合物在预防或治疗糖尿病、高血脂、动脉粥样硬化、心脑血管疾病中的应用。