CN104644727B - 加速肌肉类型转变的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种加速肌肉类型改变、增加肌肉量、强化肌肉、增强运动能力、减少脂肪、抑制脂肪堆积、降低血糖、控制体重或减少体重的组合物，该组合物包括作为活性成分的PPAR‑δ启动子、AMPK启动子和PGC1‑α启动子。

Description

加速肌肉类型转变的组合物
技术领域
本发明涉及一种加速肌肉转变的组合物
背景技术
有氧运动中产生的肌肉通过用身体的脂肪，而非碳水化合物作为能量源来消耗身体的脂肪。由于消耗较少的碳水化合物，血糖水平得以保持，且不需经历饥饿。此外，由于三磷酸腺苷(ATP)从脂肪，而非碳水化合物中产生，在ATP产生过程中产生较少的活性氧自由基，并可防止由该活性氧自由基产生的细胞损伤。然而，并非所有的运动都显示这种效果。只有例如跑步和骑车等有氧运动可以提供这种效果，因为它们能将快肌型改变成慢肌型。
人类肌肉包括接近对半分的快肌(II类)和慢肌(I类)。快肌由于缺乏肌红蛋白，并用碳水化合物作为主要能量源而看起来较白。这种类型的肌肉主要从例如举重的无氧运动中形成。这种类型的肌肉体积较大，并用于快速运动。相比之下，慢肌由于肌红蛋白，并用脂肪而非碳水化合物作为主要能量源，看起来较红。慢肌通常通过有氧运动形成，并具有较小的体积，且用于较慢较长的运动。慢肌可以持续长时间的运动，因为它们富含线粒体并有高的线粒体活动，因此可以改善抗疲劳。
一般情况下，快跑运动员具有的快肌和慢肌比例为约70:30，并具有发达的上身。相比之下，马拉松运动员一般具有的快肌和慢肌的比例为约30:70，并倾向具有苗条的身体。马拉松与相同体重的非运动员(快肌：慢肌＝约50:50)相比体型较小，因为肌肉的体积比相同体重的脂肪小5倍。要通过有氧运动得到马拉松运动员的身体，必须在6周以上的时间内进行基于最大心率的65-75％强度、每天多于40分钟的运动。
发明内容
技术问题
本发明在于提供一种加速肌肉类型转变的组合物，用于增加肌肉的量，强化肌肉，提高运动能力，减少脂肪，抑制脂肪的积累，降低血糖，控制体重或减少体重。
技术方案
一方面，本发明提供一种用于加速肌肉类型转变的组合物，用于增加肌肉量，强化肌肉，提高运动能力，减少脂肪，抑制脂肪的积累，降低血糖，控制体重或减少体重，该组合物包括过作为活性成分的过氧化物酶体增殖物激活受体-δ(PPAR-δ)激活物质、AMP激活蛋白激酶(AMPK)激活物质和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(PGC1-α)激活物质。
有益效果
根据本发明一方面的组合物，包括作为活性成分的氧化物酶体增生物激活受体-δ(PPAR-δ)激活物质、AMP激活蛋白激酶(AMPK)激活物质和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(PGC1-α)的激活物质，显示了增加肌肉类型改变、减少脂肪、抑制脂肪的堆积、降低血糖、控制体重或降低体重的功效。
附图说明
图1展示了作为结合至PPAR-δ的LBD的测量值的、22种天然产品提取物的荧光强度。
图2展示了当肌细胞用丹参、朝鲜当归、枇杷叶、绞股蓝叶、温州蜜柑或鱼腥草提取物处理24小时时，AMPK的磷酸化程度。
图3展示了经过包括黄芪提取物的几种天然产品提取物激活的PGC1-α激活物质的荧光素酶表达程度。
图4展示了用不同的物质，包括200μg/mL的魁蒿提取物，EPA，绞股蓝叶提取物，黄芪提取物或它们的混合物处理的肌细胞的结果，并将CPT1β,PDK4和PGC1-α基因的表达程度与负面控制组(GAA:绞股蓝叶提取物+魁蒿提取物+黄芪提取物，GEA:绞股蓝叶提取物+EPA+黄芪提取物，GEP:绞股蓝叶提取物+EPA+pinotin(松子提取物，即“pine nut extract”),CAA:温州蜜柑提取物+魁蒿提取物+黄芪提取物；CEA:温州蜜柑提取物+EPA+黄芪提取物，CEP:温州蜜柑提取物+EPA+pinotin(松子提取物)，GAP:绞股蓝叶提取物+魁蒿提取物+pinotin(松子提取物)；CAP:温州蜜柑提取物+魁蒿提取物+pinotin(松子提取物)；ChEP:壳寡糖+EPA+pinotin(松子提取物)；REP:白藜芦醇+EPA+pinotin(松子提取物)；ChAA:壳寡糖魁+蒿提取物+黄芪提取物；ChEA:壳寡糖+EPA+黄芪提取物)。
图5展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的锻炼持续时间。
图6展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的体重增长。
图7展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的附睾脂肪重量。
图8展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的跖肌重量。
图9展示了与阴性对照组相比，服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的脂联素和胰岛素的量。
图10展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的肌肉类型。
图11展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的肝脏的甘油三酯水平。
图12展示了服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组的褐色脂肪组织中脂滴的尺寸。
图13展示了与阴性对照组相比，服用了魁蒿提取物、EPA、绞股蓝叶提取物、黄芪提取物或它们的混合物的组中肌细胞的CPT1β、PDK4和PGC1-α基因的表达水平。
具体实施方式
在此，术语“提取物”指不管是什么提取方法或成分，从天然产品中提取的物质。该术语在广义上包括，例如，水溶性成分，或使用溶剂从天然物质中提取的有机溶剂，或天然物质的特定成分，例如，从天然物质中提取的油。
在此所用的“新陈代谢”指对生物组织所吸收的营养物，生命活动所需的物质或能量的产物的解体，以及将不必要的物质运出身体的过程。当新陈代谢主动地进行着时，身体的能量消耗增加。
在此，详细说明本发明。
过氧化物酶体增殖物激活受体-δ(PPAR-δ)是肌肉、褐色脂肪组织等表达的一个因子。有报道指出，老鼠能抑制肥胖，在老鼠中，由于在脂肪细胞中脂肪酸的加速氧化，这种转录因子为高效表达。同样，众所周知，PPAR-δ的激活剂可促进骨骼肌细胞的新陈代谢，提高对胰岛素的敏感性，减少脂肪细胞，并通过增加例如肉毒碱棕榈酰基转移酶Iβ(CPT1β)，丙酮酸脱氢酶激酶同工酶(PDK4)等蛋白质的表达来抑制炎症反应。
AMP-激活蛋白激酶(AMPK)是一种感应到细胞中的AMP存在时激活的蛋白。该蛋白通过抑制ATP-消耗信号转导和激活ATP-合成信号转导来保护细胞免受外来压力。这可以抑制脂肪合成并促进肌肉中的脂肪酸氧化，以通过抑制葡萄糖异生来压制肝脏中的糖产物。
然而，只提供激活PPAR-δ和AMPK的物质的话，将肌肉类型从快肌类型变成慢肌类型或增加慢肌类型肌肉的效果并不显著。这种功效尤其在肌肉已经形成的成人中十分微小。因此，只提供激活PPAR-δ和AMPK的物质的话，很难达到增加肌肉量、强化肌肉、减少身体脂肪、抑制脂肪堆积、降低血糖、控制体重或降低体重的有氧运动功效。
在有氧运动中，肌肉中增加了产生能量的线粒体的量。随着脂肪酸通过线粒体的氧化加速，线粒体氧化的脂肪酸和ATP产生。氧化脂肪酸的线粒体的数量和能力通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(PGC1-α)来调节。
一方面，本发明提供了一种用于加速肌肉类型转变的组合物，增加了肌肉的量，强化肌肉，增加运动能力，减少脂肪，抑制脂肪的堆积，降低血糖，控制体重或减少体重，这种组合物包括PPAR-δ激活物质，AMPK激活物质和PGC1-α激活物质作为活性成分。
PPAR-δ激活物质通过与促进了肌肉中脂肪和糖类代谢的酶的结合来增加了该细胞中促进脂肪和糖类代谢的酶的表达。该AMPK激活物质可以通过加速AMPK蛋白的磷酸化作用来调节能量代谢。该PGC1-α激活物可以通过作用PGC1-α启动子并促进PGC1-α基因的表达来增加线粒体的生物合成。
在本发明的一个实施例中，一种组合物包括：作为活性成分的、加速肌肉类型转变的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质。肌肉类型的改变包括从快肌类型到慢肌类型的转变，或慢肌类型的增加。如上所述，即使体重一样，具有大量的慢肌类型肌肉使人看起来更苗条，这是因为慢肌类型肌肉相比快肌具有更小的体积。此外，慢肌肌肉减少脂肪并抑制体内脂肪的堆积，因为慢肌利用脂肪而不是碳水化合物作为主要能量源。此外，由于相对于快肌肌肉，慢肌用于较慢、长期的运动，慢肌肌肉的增加会提高持久性。
本发明的一个示例型的实施例中，一种组合物包括：作为活性成分的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质，该组合物可以通过增加体内的肌肉量并强化肌肉来提高运动能力和新陈代谢。该组合物还提供了通过增加肌细胞内的与脂肪和糖类代谢有关的基因的表达来减少体内和血液内的脂肪，并降低血糖的功效，该基因例如为CPT1β、PDK4、PGC1α、GAPDH等。
因此，当组合物包括作为活性成分的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质时，该组合物用于动物或人类，提供类似于有氧运动的效果，并可控制和降低体重。
在本发明的一个实施例中，包含在组合物中的PPAR-δ激活物质包括一种或多种魁蒿提取物，十二碳五烯酸(EPA)，黑胡椒粉(黑胡椒)提取物，绿玛黛(巴拉圭茶)提取物和葛根(葛属植物的根)提取物。EPA是自然存在的PPAR-δ配体。
在本发明的实施例中，包括在组合物中的AMPK激活物质包括一种或多种绞股蓝叶提取物、温州柑橘提取物和鱼腥草提取物。
在本发明的实施例中，包括在组合物中的PGC1-α包括一种或多种的黄芪提取物、葛花(葛属植物的花)提取物和温州柑橘提取物。
在本发明的实施例中，提取物可以通过普通方法提取相应的自然产物来获得。在本发明的另一个实施例中，提取物可以通过在有机溶剂里加热和提取相应的自然产物来获得，该有机溶剂包括水或乙醇，随后在减压的环境下进行过滤和浓缩。在本发明的另一个实施例中，该有机溶剂可以为C1-C5的低醇，但并不仅限于此。例如，C1-C5的低醇可以为选自以下的一种或多种：甲醇，乙醇，异丙醇，正丙醇，正丁醇和异丁醇。
在本发明的一个实施例中，包含作为活性成分的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质的组合物可以包含占组合物总重量的1-80wt％的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质。在另一个实施例中，AMPK激活物质和PGC1-α激活物质可以占组合物总重量的5-60wt％。在本发明的另一个实施例中，PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质可以占组合物总重量的10-30wt％。当PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质占组合物总重量的1-80wt％时，可以在保证组合物稳定性和安全性、并满足成本效益的条件下获得本发明的理想效果。
在本发明的实施例中，在包含PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质作为有效成分的组合物中，PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质中的每一种可以占组合物总重量的1-30wt％。在本发明的另一个实施例中，PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质中的每一种可以占组合物总重量的5-20wt％。在本发明的另一个实施例中，PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质中的每一种可以占组合物总重量的5-10wt％。当PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质中的每一种激活物质占组合物总重量的1-30wt％时，本发明的理想效果可在保证组合物的稳定性和安全性、以及满足成本效益的条件下获得。
在本发明的实施例中，在包括作为活性成分的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质的组合物中，该PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质可以按1-10:1-10:1-10的比例混合。在本发明的另一个实施例中，该PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质可以按1-5:1-5:1-5的比例混合。在本发明的另一个实施例中，该PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质可以按1-2:1-2:1-2的比例混合。当所述PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质按以上比例混合时，本发明的理想效果可以在保证组合物的稳定性和安全性、以及满足成本效益的条件下获得。
本发明的组合物不只可用于动物，也能用于人。
在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质。
所述药物组合物还可以包括药用佐剂，例如抗菌剂、稳定剂、保湿剂、乳化加速剂、盐和/或用于控制渗透压的缓冲剂等，或其它的治疗性有用物质，并可以制成各种用于口服或肠胃外给药的制剂。
口服制剂可以包括，例如：药片，药丸，硬/或软胶囊，液体，悬浮液，乳状液，糖浆，粉末，粉尘，颗粒，药球等类似物。这些制剂可以包括，除活性成分外的表面活性剂，稀释液(例如，乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露醇，纤维素或甘氨酸)或润滑剂(例如，二氧化硅，云母，硬脂酸和它们的镁盐或钙盐，或聚乙二醇)。所述药片可以包含粘合剂，例如:硅酸镁铝，淀粉糊，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮，并可能偶尔包括制药添加物，例如：分解质，如：淀粉，琼脂，藻酸或它们的钠盐，吸收剂，着色剂，香料，甜味剂等类似物。该药片可以根据普通的混合，造粒或涂层等方法来制备。
肠胃外给药的制剂可以包括，例如：注射剂，滴剂，药膏，乳液，凝胶，乳脂，喷雾，悬浮液，乳状液，栓剂，贴剂等，但并非限于此。
在本发明的一个实施例中，该药物组合物可以口服或肠胃外给药，例如，直肠给药，局部给药，经皮给药，静脉注射，肌肉注射，腹腔注射，皮下注射等。
活性成分的药学上可接受的量，即：给药剂量，根据治疗个体的年龄、性别和体重、特定的疾病或病例状态、疾病严重性或病例状态、给药途径和开处方者的判断而变化，考虑到这些因素的给药剂量的确定属于本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量为0.01-2000mg/kg/d，特别为1-100mg/kg/d。然而，所述给药剂量不会以任何方式限制本发明的范围。
另一个方面，本发明提供了一种食品组合物，该食品组合物包括作为活性成分的PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质。该食品组合物可以为健康食品组合物。
食品或健康食品组合物的制剂并没有受到特别限制。例如，可以制成药片，颗粒，饮料，奶糖，食物条，茶包等。每种食品组合物的制剂可以包括，除了活性成分之外的本领域所用的其它成分。该其它成分可以考虑使用的特定制剂或目的，通过本领域的技术人员来选择。
活性成分的剂量的确定在本领域技术人员的水平范围内。每日的剂量可以根据包括年龄，身体状况，并发症等个体的不同因素而确定。
另一方面，本发明提供了一种美容护理组合物，该美容护理组合物包含PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质。
例如，美容护理组合物可以为化妆品组合物。该化妆品组合物可以包含美容或皮肤学容许的隔离霜或底霜。该化妆品组合物可制成任何局部使用的形式，包括，例如，溶液，凝胶，固体，无水浆体，水包油乳液，油包水乳液，多重乳液，悬浮液，微乳液，微胶囊，微粒剂，离子(脂质体)或非离子泡状分散液，泡沫，或气胶组合物，包括加压推进物。这种组合物可以通过本领域一般使用的方法制得。
该美容组合物还包括脂肪物质，有机溶剂，增溶剂，增稠剂，胶凝剂，软化剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，起泡剂，芳香剂，表面活性剂，水，例子或非离子乳化剂，填充物，隐蔽剂，螯合剂，防腐剂，维生素，封阻剂，保湿剂，香精油，染料，颜料，亲水或亲脂的活性剂，脂囊泡或其它在化妆或皮肤学中一般使用的佐剂。该佐剂的加入量为化妆或皮肤学中通常使用的剂量。
该美容护理组合物的制剂并非限于以上所述制剂，可根据用途来确定。例如，该美容护理组合物可以选自以下一种或多种制剂：化妆水，乳液，精华素，乳霜，软膏，凝胶，化妆包，贴剂，喷雾，粉底霜，乳液粉底，遮瑕棒，手或脚部护肤液，手或脚部乳霜，手或脚部油，手或脚部精华素，手或脚部清洁乳，肥皂，洗面奶，清洁液，清洁泡沫和清洁水，但并非受此限制。
本发明的特点和效果将通过制备实施例和实施例和测试实施例来说明。然而，以下的制备实施例，实施例和测试实施例仅用于说明，并非限制本发明的范围。
制备实施例1：魁蒿提取物的制备
购买在韩国忠清北道堤川市清川洞栽种的魁蒿。往魁蒿(300g)中加入70％的乙醇(3L)后，将混合物在70-80℃下搅拌3小时。重复该过程两遍后，通过滤纸过滤的滤液在使用旋转真空蒸发器的减压条件下浓缩，经过冷冻干燥来获得干的粉末(29g)。
制备实施例2：绞股蓝叶提取物的制备
将绞股蓝叶(1kg)压碎，加入约10倍体积的水或乙醇后，在90-100℃温度下、12-24小时内，重复提取2-3次，过滤，滤液在减压条件下浓缩以获得绞股蓝叶提取物。
制备实施例3：黄芪提取物的制备
在韩国的当地超市购买黄芪。将黄芪和经过三次蒸馏的蒸馏水以1:10的比例混合，并用提取器进行3小时的提取。重复该过程2次后，用旋转真空蒸发器在减压条件下浓缩用过滤纸过滤得到的滤液，该滤液通过冷冻干燥得到黄芪提取物的干粉。
实施例
上述制备的魁蒿提取物、绞股蓝叶提取物和黄芪提取物以1:1:1的比例(实施例1)混合。同样，EPA、绞股蓝叶提取物和黄芪提取物以1:1:1的比例混合(实施例2)。
测试实施例1：PPAR-δ激活物质的筛选
当配体与蛋白质的配体结合域(LBD)结合时，过氧化物酶体增殖物激活受体-δ(PPAR-δ)被激活并调节其它基因的表达。因此，物质可以轻易地与LBD结合，以激活转录因子。基于此，约90的食用天然产品可用PPAR-δ筛选。
将天然产品溶于二甲亚砜(DMSO)至200、100或50μg/mL，与PPAR-δ的LBD结合的程度通过LanthaScreen TR-FRET过氧化物酶体增殖物受体δ辅激活因子分析套件、用荧光强度进行定量，用DMSO作为阴性对照组。图1展示了与PPAR-δ的LBD有良好结合的22种类天然产物。
从图1中可以看出，魁蒿，黑胡椒粉，绿黛，葛根展示了优越的活性。特别地，对于9μg/mL PPAR-δ配体的LBD，魁蒿具有EC50的值。
测试实施例2：AMPK激活物质的筛选
约90的可食用天然产品如下进行AMP-活化蛋白激酶(AMPK)的激活效果
从美国组织细胞收藏中心(ATCC；USA)处购买不成熟的C2C12细胞。该细胞在5％CO2的培养器中的包含10％牛胎儿血清(FBS)的细胞培养基(DMEM；Gibco 1210-0038)中培养，每隔一天更换培养基，直到达到70％的饱和度。该细胞在包含2％马血清(HS)的培养基中诱导分化成肌细胞。在包含2％马血清(HS)的培养基中培养4天后，用溶解到DMSO(200μg/mL)的天然产物处理24小时。
作为阳性组，使用1mL的AICAR(Cell Signaling Technology,Inc.,UK)，该AICAR为熟悉的AMPK激活物。24小时之后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)来清洗细胞，用200μL的蛋白提取缓冲液处理来处理，该蛋白提取缓冲液包含8M尿素，2％的3-[(3-胆胺丙基)-二甲基胺基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)，50mM的二硫苏糖醇(DTT)，2M的硫脲，2mM的苯甲基磺酰(PMSF)和100μg/μL的亮抑酶肽，并在室温下保存10分钟。随后，在4℃、离心力强度为15,000g条件下，离心分离10分钟，收集上层清液，用Bio-Rad Protein Dye ReagentTM对蛋白进行定量。100g的蛋白质用8％的SDS-PAGE基于尺寸来分离，并在50V电压下，进行12小时的印迹至PDF膜(Bio-Rad)上。所获得的印迹用5％的脱脂乳封阻1小时，并与作为主要抗体的抗-AMPK-α(细胞信号传导)，抗-磷酸-AMPK-α(细胞信号传导)以及抗-β-肌动蛋白反应，并和与辣根过氧化物酶结合的次要抗体反应(Amersham Biosciences)，并用增强化学发光(ECL)套件检测。反应的印迹暴露于富士x射线胶片，并经过冲洗来确认蛋白质表达的程度。胶片上的条纹用PowerLook 2100XL(UMAX)扫描，并用ImageMaster 2D Elite程序(Amersham Bioscience)分析。
表2显示了在检测的天然产品中，这6种植物展示出优越的AMPK激活效果。从图2可以看到，用绞股蓝叶提取物，温州柑橘和鱼腥草处理的细胞展示出优越的增加的AMPK磷酸化。
测试实施例3：PGC1-α激活物质的筛选
使用APRDC PGC1-α启动子细胞来检测90种天然产品的PGC1-α启动子激活效果。该APRDC PGC1-α启动子细胞是人类肝细胞(KCTC 11218BP)，其中，PGC1-α启动子的载体和荧光素酶基因融合基因具有稳定的表达。
首先，APRDC PGC1-α启动子细胞用90种溶于DMSO(200μg/mL)的天然产品处理24小时。随后，用PBS清洗2次，萤火素酶报告基因的活性通过Glo荧光素酶检测套件(Promega,Cat No.E2520)测量。萤光素酶活性通过样品转移至96-孔板，并用光度计检测荧光来测定。DMSO用作阴性对照。
图3展示了几种天然产物，这几种天然产物在测试的天然产品中展示出优越的APRDC PGC1-α启动子激活效应。如图3所示，与阴性对照组DMSO或其它物质相比，经过黄芪，葛根花或温州柑橘处理的导致了更强的荧光。这意味着黄芪，葛根花和温州柑橘具有优越的PGC1-α启动子激活效果。
测试实施例4：肌细胞中的基因表达评价(细胞水平)
在此研究了用1:1:1比例混合的魁蒿提取物，生绞股蓝叶提取物和黄芪提取物对脂肪和血糖代谢有关的基因表达的处理效果，该混合物经确认可激活PPAR-δ、AMPK和PGC1-α。
从美国组织细胞收藏中心(ATCC；USA)处购买不成熟的C2C12细胞。该细胞在5％CO2的培养器中的包含10％牛胎儿血清(FBS)的细胞培养基(DMEM；Gibco 1210-0038)中培养，每隔一天更换培养基，直到达到70％的饱和度。该细胞在包含2％马血清(HS)的培养基中诱导分化成肌细胞。在包含2％马血清(HS)的培养基中培养4天后，用魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物，黄芪提取物，或它们的混合物(200μg/mL)处理。使用相对于培养基1/1000体积的DMSO作为阴性对照组。用每个样品处理过的细胞在37℃下培养24小时后，用凉的生理盐水清洗2次，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取RNA。cDNA用提取和测定数量的RNA(1μg/μL)在反转录试剂盒(Promega)中合成。
CPT1β,PDK4,PGC1α和GAPDH基因的表达模式用合成cDNA和引物和探针(AppliedBiosystems；CPT1β,Mm00487200_m1；PDK4,Mm00447181_m1；PGC1-αMm00447181_m1；GAPDH,Mm99999915_q1)来测定。使用Rotor-Gene 3000系统(Corbett Research,Sydney,Australia)来进行PCR和分析。结果展示在图4中。
从图4可以看出，与使用阴性对照物质或单独使用物质的相比，经过这三种物质的混合物的处理，增加了2倍或更多的CPT1β,PDK4和PGC1-α的表达。因此，服用了分别活化PPAR-δ,AMPK和PGC1-α的混合物物质可以促进肌肉的脂肪和糖类代谢。
测试实施例5：运动持续时间评价
(1)实验鼠的准备
5岁的雄性C57BL/6鼠分成正常饮食组，高脂肪饮食组和有氧运动组，每组10只鼠。在8周内，正常饮食组喂D12450B(10％脂肪,Research Diets,Inc.,NJ,USA)，高脂肪饮食组喂D12492(60％脂肪)。有氧运动组喂养高脂肪饮食，并进行每周5次，以15m/mim的速度在跑步机上跑步40分钟。测试组喂养高脂肪饮食，并每天口服绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物，EPA，以及魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物。每周测量一次体重和采食量。
(2)运动持续时间的测量
服用测试物质后的8周，实验鼠被迫在跑步机上以15m/min的速度跑步，并测量运动持续时间。结果展示在图5中。如图5所示，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物的混合物的组，相比于没有经过处理或只服用测试物质的组，展示了提高约70％的运动时间。
因此，可见服用分别激活PPAR-δ、AMPK和PGC1-α混合物的物质可以在较长时间内进行运动。
测试实施例6：体重和组织重量的测量
将5岁的雄性C57BL/6老鼠与10个老鼠组成一组。实验鼠在8周内，每天一次口服作为测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物。实验鼠在解剖前禁食12小时。
图6展示了8周体重的变化。图6中，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物的混合物的组和服用绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组，相比于未经过处理或只服用测试物质的组，分别展示了下降26％和28％的体重。
图7展示了附睾的脂肪重量，在图7中，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物的混合物的组和服用了绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组，相比于未经过处理的阴性控制组或只服用测试物质的组，分别展示了34％和36％的体重下降值。
图8展示了鼠拓肌的分离和重量结果。在图8中，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物的混合物的组，和服用了绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组，相比于没有经过处理的阴性对照组或只服用测试物质的组，鼠拓肌增加了约55％。
因此，可以看到服用分别激活PPAR-δ,AMPK和PGC1-α的混合物质在减少体重和附睾脂肪重量的同时增加了肌肉量。
测试实施例7：血液分析
将5岁的雄性C57BL/6老鼠与10个老鼠组成一组。实验鼠在8周内，每天一次口服作为测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物。因此，进行血液分析来评定血糖水平，血清甘油三酯和胆固醇水平。
用accu-check活性试剂盒(Roche Diagnostics,Seoul,Korea)检测血糖。
血液样品在3000rpm速度下离心分离10分钟来分离血清。用Vitalab Selectra E分析仪(Vital Scientific,Dieren,The Netherlands)分析分离的血清中的甘油三酯和胆固醇的水平。结果展示在表1中。
表1
如表1所示，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物的混合物，或绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组相比于没有经过处理的阴性对照组或单独服用测试物质的组来说，展示了显著的较低血糖和甘油三酯水平。
因此，可以看到服用分别激活PPAR-δ、AMPK和PGC1-α的混合物质提供了降低血糖和甘油三酯水平的效果。
测试实施例8：脂联素和胰岛素水平的分析
将5岁的雄性C57BL/6鼠与10只老鼠组成一组。实验鼠在8周内，每天口服当作测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物。随后检测实验鼠的脂联素和胰岛素水平。
在抗凝管中取出血液，并在3000rpm的速度下离心分离3000rpm来分离血清。血清被稀释20,000倍，并用小鼠脂联素Quantikine套件(R&Quantikine kit D Systems)来检测表达的脂联素的数量。在稀释血浆20,000倍后，用小鼠胰岛素Quantikine kit(R&DSystems)检测胰岛素水平。结果展示在图9中。
服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物的混合物或绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组相比于没有经过处理的阴性对照组或没有单独服用测试物质的组来说，提高了约50％的脂联素水平。同样，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物的混合物的组合服用了绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组相比于没有经过处理的阴性对照组，或单独服用测试物质的组分别展示了60％和55％胰岛素下降水平。
因此，可以看到服用分别激活PPAR-δ,AMPK和PGC1-α的混合物质可以增加蛋白质脂联素水平，该蛋白质脂联素水平与血糖和脂肪酸代谢的调节有关，并降低胰岛素水平。降低的胰岛素水平意味着保持较低的血糖。
测试实施例9：肌肉类型改变的分析
将5岁的雄性C57BL/6鼠与10只老鼠组成一组来评定服用测试物质后的肌肉类型的改变。实验鼠在8周内，每天口服当作测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物。实验鼠在解剖前禁食12小时。
从每组测试组中取出拓肌，并在液氮中冷冻。该冷冻的组织用超薄切片机切成10-μm厚度，并置于丙酮中10分钟，再用PBS洗3次。用包含10％FBS的PBS封阻2小时候，该组织部分用作为主要抗体的抗慢肌肌球蛋白抗体(Abcam,Cambridge,UK)处理，并用异硫氰酸荧光素(FITC)结合抗小鼠IgG抗体(分子探针)作为次要抗体。在用抗荧光衰减封片剂处理后，用共聚焦显微镜检测这部分。
分析结果展示在图10和表2中。
表2
服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物的混合物或绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物的组相比于没有经过处理的阴性对照组或没有单独服用测试物质的组来说，在肌肉组织中增加了2倍的慢肌肌球蛋白。这意味着服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物的混合物或绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物的混合物可以将鼠的肌肉类型转变成慢肌肌肉。同样，这意味着服用了分别激活PPAR-δ,AMPK和PGC1-α物质的混合物在肌肉类型的改变方面，可以提供与有氧运动类似的功效。
测试实施例10：肝组织中甘油三酯的分析
将5岁的雄性C57BL/6鼠与10只老鼠组成一组。实验鼠在8周内，每天口服当作测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物，随后评定肝组织的甘油三酯水平。实验鼠在解剖前禁食12小时。
从实验鼠中取出肝组织，并在液氮中冷冻。该冷冻的组织用超薄切片机切成10-μm厚，并与丙二醇(031301,Samchun pure chemical Co.Ltd.,Korea)中的0.5％油红O(O-0625,Sigma-Aldrich,USA)在60℃下反应8分钟，随后与85％的丙二醇反应2分钟。随后，该组织部分用流水清洗1分钟，与Mayer’s苏木精(10029273,DAKO,USA)复染，并在光学显微镜下观察。结果展示在图11中。
如图11所示，服用绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物混合物或绞股蓝叶提取物，EPA和黄芪提取物混合物的组相比于没有经过处理的阴性对照组，或只服用了测试物质的组，看起来比较亮，意味着甘油三酯在肝组织中显著地降低了。
因此，可以看出，上述分别激活PPAR-δ、AMPK和PGC1-α的物质的混合物的给药可以减少肝组织中甘油三酯。
测试实施例11：棕色脂肪组织脂滴的分析
将5岁的雄性C57BL/6鼠与10只老鼠组成一组。实验鼠在8周内，每天口服当作测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物，随后检测棕色脂肪组织的脂滴。实验鼠在解剖前禁食12小时。
从每组测试组中取出棕色脂肪组织，并置于10％的中性甲醛中。接着石蜡包埋，该石蜡包埋组织用超薄切片机切成3-μm厚，染上苏木精(10029273,DAKO,USA)和曙红(075K4346,Sigma-Aldrich,USA)(H&M)，并在光学显微镜下观察。结果展示在图12中。
如图12所示，服用了绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或绞股蓝叶提取物的混合物，EPA和黄芪提取物混合物的组相比于没有处理的阴性对照组，或只服用测试物质组来说，展示了褐色脂肪组织中显著的脂滴减小尺寸。
因此，可以看到服用了分别激活PPAR-δ,AMPK和PGC1-α的混合物质可以减小褐色脂肪组织中的脂滴尺寸。
测试实施例12：肌细胞中基因表达的评价(个体水平)
将5岁的雄性C57BL/6鼠与10只老鼠组成一组。实验鼠在8周内，每天口服当作测试物质的绞股蓝叶提取物，魁蒿提取物，黄芪提取物或单独的EPA，魁蒿提取物，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物的混合物，或EPA，绞股蓝叶提取物和黄芪提取物(200mg/kg)的混合物，并随后评价肌细胞中基因表达的水平。实验鼠在解剖前禁食12小时。
解剖从每组实验组而来的肌肉，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取RNA。用提取并定量的RNA(1μg/μL)和反转录体系(Promega)合成cDNA。CPT1β、PDK4、PGC1α和GAPDH基因的表达模式通过使用合成的cDNA和设计用于基因的引物和探针(Applied Biosystems；CPT1β,Mm00487200_m1；PDK4,Mm00447181_m1；PGC1-αMm00447181_m1；GAPDH,Mm99999915_q1)来检测。用Rotor-Gene 3000system(Corbett Research,Sydney,Australia)进行PCR和分析。结果展示在图13中。
如图13所示，服用了绞股蓝提取物，魁蒿提取物和黄芪提取物混合物或绞股蓝提取物，EPA和黄芪提取物混合物的组相对于没有处理的阴性对照组，或单独服用测试物质的组来说，基因表达增加了2倍。因此，可见服用了分别激活PPAR-δ,AMPK and PGC1-α的混合物质可以提高肌肉的脂肪和糖类代谢。
根据本发明的药物组合物，食品组合物和美容护理组合物的制备实施例在此公开，这些组合物中包含PPAR-δ激活物质，AMPK激活物质和PGC1-α激活物质。然而，本发明的范围并非收到以下实施例的限制。
制备实施例1：药片的制备
上述成分可通过普通方法混合并制成药片。
制备实施例2：胶囊的制备
上述成分可根据普通方法混合并填入胶囊内。
制备实施例3：液体的制备
根据普通的方法，将上述成分溶于加入的纯净水。加入足够量的柠檬香料后，混合该成分，并加入纯净水至100mL。将混合物装入棕色瓶子中，并消毒以制备液体。
制备实施例4：健康食品的制备
维生素和矿物质混合物作为适合健康食品的实施例。然而，该组合物可以进行不同变化。根据普通的方法，可将上述成分混合，制成颗粒，随后用于制备健康食品组合物。
制备实施例5：饮料的制备
根据普通的方法，将上述成分混合，并边搅拌边在85℃下加热1小时。过滤所得的溶液，收集至消毒的2-L容器中，密封，随后在冰箱储存，用于饮料组合物的制备。
制备实施例6：乳脂的制备
根据普通的方法，用表3中的成分制备乳脂。
表3
成分 wt％
实施例 2.0
聚山梨醇酯60 1.5
倍半油酸山梨坦 0.5
PEG60氢化蓖麻油 2.0
液状石蜡 10
角鲨烷 5.0
辛酸/癸酸三甘油酯 5.0
甘油 5.0
丁二醇 3.0
丙二醇 3.0
三乙醇胺 0.2
防腐剂 适量
颜料 适量
香料 适量
纯净水 至100

Claims (5)

1.PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质在制备用于加速肌肉类型转变的组合物中的用途，
其中，所述PPAR-δ激活物质为十二碳五烯酸；
所述AMPK激活物质为绞股蓝叶的水提取物或乙醇提取物；
所述PGC1-α激活物质为黄芪的水提取物；并且
其中PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质以1-2：1-2：1-2的比例混合。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肌肉类型转变包括从快肌型到慢肌型的转变，或慢肌型的增加。
3.PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质在制备用于增加肌肉量、强化肌肉或增加运动能力的组合物中的用途，
其中，所述PPAR-δ激活物质为十二碳五烯酸；
所述AMPK激活物质为绞股蓝叶的水提取物或乙醇提取物；
所述PGC1-α激活物质为黄芪的水提取物；并且
其中PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质以1-2：1-2：1-2的比例混合。
4.PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质在制备用于减少脂肪、抑制脂肪堆积或降低血糖的组合物中的用途，
其中，所述PPAR-δ激活物质为十二碳五烯酸；
所述AMPK激活物质为绞股蓝叶的水提取物或乙醇提取物；
所述PGC1-α激活物质为黄芪的水提取物；并且
其中PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质按1-2：1-2：1-2的比例混合。
5.PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质在制备用于控制体重或减少体重的组合物中的用途，
其中，所述PPAR-δ激活物质为十二碳五烯酸；
所述AMPK激活物质为绞股蓝叶的水提取物或乙醇提取物；
所述PGC1-α激活物质为黄芪的水提取物；并且
其中PPAR-δ激活物质、AMPK激活物质和PGC1-α激活物质以1-2：1-2：1-2的比例混合。
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