CN104630344B - 羊驼毛成分的实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于羽绒制品中动物源性成分的定性检测技术，具体地说是检测纤维制品中羊驼成分的引物/探针组。本发明选取羊驼毛的线粒COXⅠ基因序列，设计一组特异性引物和探针。使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可快速、灵敏、特异地检测纤维制品中的羊驼成分。该引物和探针也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。

Description

羊驼毛成分的实时荧光PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体讲是涉及一种羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针。
背景技术
羊驼的英文名是Alpaca，是骆驼科动物的一种，其祖先是驮马。羊驼浑身是宝，其产生的羊驼毛纤维是世界上著名的高级动物纤维之一，以其奢华的手感和光泽著称。由于羊驼毛纤维含有髓腔，其保温性优于其他纤维，具有抗皱性、耐磨性、保湿性等优良特性。用它制成的时装轻柔暖和，穿着舒适，悬垂性好，色彩鲜艳，阳光照射下还发出五彩光，颇受消费者的喜爱，成为继羊绒之后又一种高档特种动物纤维产品。鉴别羊驼毛一般采用显微镜法，微观结构法和扫描电镜法等。但这些方法都存在一定的不足，甚至某些情况下无法准确鉴别。自1975年Bradfied等成功地从头发中提取DNA以来，发毛已成为法医学、遗传学常用的检测材料之一。近年来，DNA法鉴别动物纤维的报道常见于各类报纸杂志，该方法的关键是DNA的提取，提取成功与否决定了能否鉴别纤维。有关毛干DNA提取及检测的报道已屡见不鲜，但关于羊驼毛DNA提取及检测方面的报道较少。
发明内容
本发明的目的是针对羊驼毛线粒体COX I基因序列，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种快速检测羊驼毛DNA方法，以克服传统的显微镜法难以准确判定的局限性，为羊驼毛成分检测提供有效工具，以期与传统鉴别方法相结合，提高羊驼毛鉴别的客观性和准确度。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针：
上游引物：5’-GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3’
下游引物：5’-ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3’
探针：5’-CAACATTAAATGATCCCCCG-3’。
所述探针为TaqMan探针，其5’端标记有报告荧光集团，3’端有淬灭荧光集团。
所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针＝1：1：1；其检测过程如下：
(1)待检样品DNA的提取
采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒提取羊驼毛的DNA。
(2)羊驼毛成分的实时荧光PCR扩增
A.在反应管中加入Premix Ex Taq(2×)12.5μL，Primer F(10μM)
1μL，Primer R(10μM)1μL，Probe(5μM)1μL，DNA*2μL，dH2O7.5μL，Total 25μL。
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃30sec，1个循环，95℃5sec，60℃30sec，40个循环，PCR扩增。Negativecontrol反应时，加入RNase free dH2O；Positive反应时，做2个平行样。
(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果
反应结束后，设置无效基线范围；基线范围选择在3～15个循环，如果有强阳性样本，根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准，设置阈值后，分析样品的检测结果。
待测样品羊驼毛成分检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出羊驼毛成分。
待测样品羊驼成毛分检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出羊驼毛成分。
待测样品羊驼毛成分检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出羊驼毛成分；再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出羊驼毛成分。
本发明采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的纤维制品中羊驼毛成分的检测。
附图说明
图1PCR特异性检测结果；
图2羊驼毛DNA荧光PCR结果；
图3荧光PCR灵敏度检测结果；
图4重复性PCR结果；
图5重复性荧光PCR结果；
图6重复性荧光PCR结果；
图7重复性荧光PCR结果。
具体实施方式
具体结合实施例对本发明做进一步说明。
羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针：
上游引物：5’-GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3’
下游引物：5’-ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3’
探针：5’-(FAM)CAACATTAAATGATCCCCCG(Eclipse)-3’。
所述探针为TaqMan探针，其5’端标记有报告荧光集团，3’端有淬灭荧光集团。
所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针＝1：1：1。
实施例1
1、从纤维制品的不用部位取样，共取约1g试样；用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再用剪刀尽量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨机混匀；
2、从混匀的样品中称取约5mg试样，放入2mL离心管中，每个试样平行提取2管，加入180μL的缓冲液GL(Buffer GL)、20μL的蛋白酶K(Proteinase K)和10μL的核糖核酸酶A(RNase A，10mg/mL)，于56℃水浴温浴至组织完全裂解3小时；如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先12,000rpm离心2分钟，去除杂质之后再进行后续操作。向裂解液中加入200μL缓冲液GB(Buffer GB)和200μL 100％乙醇，充分吸打混匀。温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。将离心管(Spin Column)安置于收集管(Collection Tube)上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。将500μL的缓冲液WA(BufferWA)加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。将700μL的缓冲液WB(Buffer WB)加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。沿Spin Column管壁四周加入Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。然后重复上述加缓冲液WB操作步骤一次。将Spin Column安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50μL的灭菌水或洗脱液(Elution Buffer)，室温静置5分钟。将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到Spin Column膜的中央或再加入50μL的灭菌水或Elution Buffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。以上操作中的Buffer GL、Buffer WA、Buffer WB以及Spin column、Collection Tube均来自宝生物工程(大连)有限公司TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒。
3、PCR反应体系
在优化好的PCR反应条件和反应体系下，以鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、山羊绒、毛牛绒、羊驼毛的DNA为特异性试验对照进行PCR检测。电泳结果显示，仅有羊驼牦被扩增出条带扩增片段大小约是140bp，大小符合所设计的引物片段大小150bp，且阴性对照和其他非羊驼毛模板对照均未出现特异性条带，具体结果见图1，图中，M：100bp DNA Laddar Marker；1：鸭绒PCR产物；2：鹅绒PCR产物；3：绵羊毛PCR产物；4：兔毛PCR产物；5：山羊绒PCR产物；6：牦牛绒PCR产物；7：羊驼毛PCR产物；8：狐狸PCR产物；9：阴性对照(Negative Control)。
在优化好的荧光PCR反应条件和反应体系下，选择鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、山羊绒、毛牛绒、羊驼毛的DNA为特异性试验的对照来进行荧光PCR检测。检测结果显示，仅羊驼毛有扩增曲线，而其它对照以及空白对照均没有扩增曲线，表明本实验设计的特异性引物和探针与鹅基因具有较高同源性，而与其它常见动物物种的基因并没有同源性，该检测方法具较强的特异性。具体结果见图2。
提取的羊驼毛DNA，按10倍进行梯度稀释，取2μL作为模板进行灵敏度检测，检测结果表明扩增曲线良好，见图3。
对性能检验合格的引物，进行引物重复性能检测，每一对引物做3次重复，三次重复实验结果表明，均能扩增出目的条带，电泳结果清晰单一，阴性对照是空白，结果见图4，图中：M：100bp marker；1-2：鹅绒模板PCR产物；3-4：空白对照。
对性能检验合格的引物，进行引物重复性能检测，每一对引物做3次重复，三次重复实验结果显示均能扩增出目的条带且Ct值比较一致，阴性对照是空白，结果见图5、图6、图7。

Claims (1)

1.羊驼毛成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：
上游引物：5’- GCTTATTTTACATCCGCCACAA -3’
下游引物：5’- ACCTCCTACGGTGAACAGGAA -3’
探针：5’- CAACATTAAATGATCCCCCG -3’；
所述探针为TaqMan探针，其5’端标记有报告荧光基团，3’端有淬灭荧光基团；
所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针=1：1：1；其检测过程如下：
（1）待检样品DNA的提取
采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒提取羊驼毛的DNA；
（2）羊驼毛成分的实时荧光PCR扩增
A．在反应管中加入Premix Ex Taq 2× 12.5μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，5μM探针1μL，DNA 2μL，dH2O 7.5μL，总体25μL；
B．将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃ 30sec，1个循环，95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环，PCR扩增；阴性对照反应时，加入RNase free dH2O替代DNA模板；阳性反应时，做2个平行样；
（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果
反应结束后，设置无效基线范围；基线范围选择在3～15个循环，阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40为准，设置阈值后，分析样品的检测结果；
待测样品羊驼毛成分检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出羊驼毛成分；
待测样品羊驼成毛分检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出羊驼毛成分。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106967817B (zh) * 2017-05-02 2020-05-15 嘉兴学院 一种毛绒制品的快速分子鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101696910A (zh) * 2009-11-05 2010-04-21 东南大学 基于空间坐标监测的识别松弛的支承索的递进式方法
CN101698842A (zh) * 2009-10-22 2010-04-28 厦门大学 石斑鱼亚科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及其设计方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3566570B2 (ja) * 1999-01-25 2004-09-15 財団法人日本化学繊維検査協会 Ｄｎａによる獣毛繊維の同定方法
JP2000325098A (ja) * 1999-05-17 2000-11-28 Japan Synthetic Textile Inspection Inst Foundation Ｄｎａによる獣毛種の同定方法
CN102304579B (zh) * 2011-08-31 2012-12-26 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 山羊绒和绵羊毛的实时荧光pcr鉴别方法
CN102634583B (zh) * 2012-04-18 2014-03-12 上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心 藏羚羊绒及其制品的荧光定量pcr定性检测方法
CN103820537B (zh) * 2012-04-18 2016-01-20 上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心 狐源性纤维成分荧光定量pcr定性检测方法
CN102899397B (zh) * 2012-08-01 2014-05-14 上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心 基于dna分析的羊毛羊绒定量检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101698842A (zh) * 2009-10-22 2010-04-28 厦门大学 石斑鱼亚科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及其设计方法
CN101696910A (zh) * 2009-11-05 2010-04-21 东南大学 基于空间坐标监测的识别松弛的支承索的递进式方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lama pacos complete mitochondrial genome;NCBI;《Genbank》;20061114;第5335-6879注释 *

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