CN104611259B - 土著乳酸菌及其与酿酒酵母混合发酵食药用菌的方法和产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土著乳酸菌和酿酒酵母混合发酵食药用菌方法及产品。本发明所述土著乳酸菌4J1，分类命名为假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10129。将所述土著乳酸菌和酿酒酵母的培养液按一定比例混合制备成混合菌液，接种食药用菌并进行混合发酵，酿酒酵母发酵产生的醇与土著乳酸菌发酵产生的乳酸起中和反应降低了产品中的酸味，增加了产品的香醇味，获得的产品口感更诱人，同时具备了食药用菌和益生菌的双重营养及功效。
Description
技术领域
本发明属于食药用菌的生物加工领域，具体涉及土著乳酸菌及其与酿酒酵母混合发酵食药用菌的方法和产品。
背景技术
食药用菌含有丰富的多糖、粗纤维、多种矿物质、蛋白质以及18 种游离氨基酸，其中人体必需的 8 种氨基酸占氨基酸总量的40% 以上，同时含有如真菌免疫调节蛋白等活性物质，经科学研究表明食药用菌具有抗肿瘤、抗炎等以及提高人体免疫调节功能的作用，是营养全面、配比合理的保健食品。
我国食药用菌的产业发展迅速，从1978年食用菌产量不足10万吨，到2007年统计全国食用菌产量已有1682万吨，到2011年全国食用菌总产量2571.7万吨，食药用菌的产业已经成为我国农业的支柱产业之一。
然而目前食药用菌产业面临的瓶颈难题是：（1）产品大多数以鲜售为主，附加值低。而且新鲜的食药用菌颜色易褐变，货架期短，容易腐败变质。（2）加工产品种类贫乏。目前食药用菌的加工方法以风热干制为主，然而金针菇、杏鲍菇、蟹味菇、猴头菇等大都数食药用菌不适合干制加工，其干制品品质低劣，口感极差。为了克服食药用菌的这些缺点，增加食药用菌产品的附加值，丰富食药用菌的产品种类，采用生物加工的方法对食药用菌进行发酵加工是本领域亟待解决的重要课题。
乳酸菌是利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的统称，是一类最重要的益生菌。具有抑制腐败菌的繁殖，维持人体肠道内的菌群平衡，抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压、抗肿瘤、预防癌症作用，以及增强人体免疫力和抵抗力等功效。土著乳酸菌是指来源于发酵对象本身的益生菌，该发酵乳酸菌即称为土著乳酸菌；酿酒酵母也是一种益生菌，传统上主要用于酿酒及制作面包、馒头等发面食品。
目前采用酿酒酵母和植物乳杆菌联合使用的相关技术主要见于乳制品制备或者发酵果汁的制备，其中在乳制品的制备技术领域应用较多，即便如此，在很多文献中都指出混合发酵过程中，酵母菌和植物乳杆菌之间既存在协同作用又存在拮抗作用。公开号为CN103637314A的中国发明专利申请公开了一种复合益生菌发酵果汁及其制备方法，其通过在多种混合果汁中添加酵母菌和植物乳杆菌恒温发酵制得。众所周知，很多种果汁中，往往自然含有水果上的酵母，其中也包括酿酒酵母，而且随着时间延长，酿酒酵母在果汁中还存在增殖的效果。再者，果汁中富含糖类物质，植物乳杆菌是利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌，其在果汁中与酿酒酵母的协同作用机理与在食药用菌发酵处理过程中与酿酒酵母的协同作用机理不具有可比拟性，所以该技术对食药用菌的发酵处理也不存在可参照性。
目前从食药用菌中分离土著乳酸酸用作食药用菌的发酵菌种未见报道，采用土著乳酸菌和酿酒酵母混合发酵食药用菌的相关技术也未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有食药用菌的发酵菌种技术不足，提供一种新的土著乳酸菌。
本发明要解决的另一技术问题是提供所述菌株的培养方法。
本发明要解决的另一技术问题是提供所述菌株与酿酒酵母在食药用菌混合发酵方面的应用。
本发明要解决的另一技术问题是提供所述混合发酵的方法及产品。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种土著乳酸菌4J1，分类命名为假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No. 10129。
本发明同时提供所述土著乳酸菌的培养方法，所述土著乳酸菌菌株分离自金针菇子实体，发酵方法是以1%～4%的接种量接种于发酵培养基1中于25℃～37℃恒温发酵培养16～24h，摇床转速50～200rpm，之后离心收集菌体，用0.8%～2%（g/mL）的NaCl溶液悬浮菌体，备用。
所述的发酵培养基1为马铃薯汁培养基（1L）：马铃薯150～300g，蛋白胨 5～15.0g、葡萄糖 10.0～30.0g、蒸馏水1L，pH 6.8，121℃，20min 灭菌。
本发明提供了所述菌株与酿酒酵母在食药用菌混合发酵方面的应用。在无菌条件下，将混合菌种的菌液加入食药用菌，拌匀后密封恒温静置混合发酵即得。本发明利用优选的土著乳酸菌作为益生菌之一，与酿酒酵母（益生菌之二）对食药用菌进行混合发酵，可有效延长食用菌的储存期，保证其营养价值和感官品质，达到保藏的作用，降低销售鲜品的压力，拓宽食用菌的加工领域，丰富产品的多样性，提高经济效益。
优选地，所述混合发酵是调整食药用菌的盐含量为0.5%～4.0%，氯化钙含量0.5～1%，在每50g～150g食药用菌中按照接种量为0.5%～3.0%接种混合菌液，在15℃～35℃的发酵温度下密封发酵4～10天。
优选地，所述混合菌种的菌液是将土著乳酸菌和酿酒酵母分别培养至指数增长期时后将土著乳酸菌和酿酒酵母的培养液采用1～5：5～1体积比例混合而成，优选的比例是1～3： 1，最优选的比例为2:1。
优选地，所述食药用菌包括金针菇、杏鲍菇、猴头菇、蟹味菇等。
本发明提供所述混合发酵所得产品。
进一步优选地，所述土著乳酸菌和酿酒酵母混合发酵食药用菌的方法，包括以下步骤：
S1.食药用菌的前处理：将新鲜无污染的食药用菌原料去杂、清洗、晾干、切块或切片，备用；
S2.按照50～150g食药用菌：100～300mL容器容积的比例将S1步骤前处理好的食药用菌装入容器，加入食盐和氯化钙，盖上容器盖；
S3.将S2步骤准备的装有食用食药用菌的容器进行灭菌处理后冷却；
S4.在无菌条件下，将混合菌种的菌液加入S3步骤准备的所述装有食用食药用菌的容器，拌匀后密封容器；所述混合菌种的菌液是将土著乳酸菌和酿酒酵母分别培养至指数增长期时后将二者的培养液采用前述体积比例混合而成。
S5.将密封容器恒温静置发酵即得成品；
其中，S4步骤所述发酵是在每50g～150g食药用菌中按照接种量为0.5%～3.0%接种混合菌种的菌液，调整所述食药用菌的盐含量为0.5%～4.0%，氯化钙含量0.5～1%，在15℃～35℃的发酵温度下密封发酵4～10天。
优选地，S2步骤所述灭菌是采用蒸汽灭菌，温度为80～121℃，灭菌时间为5～35min，此条件下可以更好地保证食药用菌菌块形状完整，并且具有较好的弹性。
所述酿酒酵母菌株的发酵方法是以1%～4%的接种量接种于培养基2中于25℃～37℃恒温发酵培养培养14～24h，再以接种于新的发酵培养基2于25℃～37℃静置培养14～18h，摇床转速50～200rpm，离心收集菌体，用0.8%～2%（g/mL）的NaCl溶液悬浮菌体，备用。
所述发酵培养基2为YPD培养基（1L）：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖 20.0g，蒸馏水1L，pH 6.5，121℃，20min 灭菌。
本发明同时提供一种土著乳酸菌和酿酒酵母混合发酵食药用菌产品，成品的土著乳酸菌的活菌数在107～109数量级，酿酒酵母活菌数在105～107数量级，pH范围为3.0～4.0。可直接采用发酵生产时采用的100～300mL的密封瓶包装。
所述密封瓶优选采用无毒玻璃瓶或塑料瓶。
与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的菌种，从金针菇的子实体上分离得到，该菌株具有高降解亚硝酸盐和胆固酸的特点。
本发明提供了一种改良的培养基成功优化培养所述菌株，根据土著菌的生长特点，设计不同配方的培养基配方优选得出，该土著乳酸菌的发酵培养基安全廉价，可降低企业成本。
基于所述菌株，本发明优化了食药用菌的生物加工方式，保证了食药用菌特有的风味和组织结构，并针对现有技术乳酸菌发酵过程中产生乳酸和乙酸等使得产品口感偏酸的技术缺陷，创造性地利用酿酒酵母发酵过程中产生的乙醇，利用乙醇的羟基和乳酸、乙酸中的羧基起酯化反应，形成具有特殊香味的物质。通过科学混合发酵工艺，有效延长食用菌的储存期，保证其营养价值和感官品质，达到合理保藏食药用菌的作用，延长食药用菌的货架期，提高食药用菌产品的附加值，达到生物保鲜的效果，降低销售鲜品的压力，拓宽食用菌的加工领域，丰富产品的多样性，提高经济效益。
进一步地，本发明在发酵品中添加了氯化钙，促进了混合发酵后酸和醇反应产生酯类物质增加了产品的风味物质，酸度降低口感更好，同时增加了发酵品的脆度。
进一步地，本发明经过对土著乳酸菌和酿酒酵母的菌种量配比、发酵温度、发酵时间等参数的优化获得了最佳发酵条件，发酵产品口感更好，更容易被消费者所接受。
本发明产品发酵基质为食药用菌，突破了现有技术仅能在乳制品、果汁等液态基质中添加多种益生菌混合发酵的技术局限，尤其是利用土著乳酸菌和酿酒酵母两种益生菌进行混合发酵。
本发明中的产品综合了益生菌的有益功效同时保留了食药用菌的有益功效，工艺简单，无需进行复杂的前处理，且加入酿酒酵母进行混合发酵，增加产品的口感。
本发明需要的投资小，易于操作，适宜于工厂化投入生产和扩大化的实施。
附图表说明
图1土著乳酸菌和酿酒酵母不同体积比的混合菌种发酵杏鲍菇pH值变化图。
图2土著乳酸菌和酿酒酵母混合发酵中土著乳酸菌菌株数量的变化情况。
图3土著乳酸菌和酿酒酵母混合发酵中酿酒酵母菌株数量的变化情况。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明采用的试剂、原料和设备为本技术领域常规使用的试剂、原料和设备。
实施例1 土著乳酸菌的培养及菌液制备
本申请人从金针菇子实体中分离筛选得到菌株，为土著乳酸菌4J1，分类命名为假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 10129。
表1 本发明土著乳酸菌降胆固醇结果
将所述菌株以1%～4%的接种量接种于发酵培养基1中，于25℃～37℃恒温培养16～24h，摇床转速50～200rpm，离心收集菌体，用0.8%～2%（g/mL）的NaCl悬浮菌体，得到土著乳酸菌菌液，备用。
所述的发酵培养基1为马铃薯汁培养基（1L）：马铃薯150～300g，蛋白胨 5～15.0g、葡萄糖 10.0～30.0g、蒸馏水1L，pH 6.8，121℃，20min 灭菌。所述发酵培养基2为YPD培养基（1L）：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖 20.0g，蒸馏水1L，pH 6.5，121℃，20min 灭菌。
实施例2 酿酒酵母菌液的制备
酿酒酵母的菌株（购自安琪酵母股份有限公司）在发酵培养基2中于25℃～37℃恒温培养14～24h，离心收集菌体，用0.8%～2%（g/mL）的NaCl溶液悬浮菌体，得到酿酒酵母菌液，备用。
发酵培养基2：
YPD培养基（1L）：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖 20.0g，蒸馏水1L，pH 6.5，121℃，20min 灭菌。
实施例3 混合发酵制备食药用菌产品
S1选用新鲜、没有受其他微生物感染的金针菇（包括废弃菇）为原料，去杂、晾干或烘干表面水分后备用。
S2按照50～150g金针菇：100～300mL容器容积的比例将S1步骤准备好的金针菇装入容器中，以金针菇质量的含盐量为2.0%加入食盐，同时加入0.5%的氯化钙，盖上盖子。
S3将装有金针菇的容器置于80～121℃蒸汽灭菌5～35min，冷却备用。这样可保证金针菇的形状完整，并且具有较好的弹性，冷却备用。
S4将实施例1所得土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按2:1的体积比例混合，得到混合菌液。
S5在无菌条件下，将S4步骤所得混合菌液接种进S3准备好的装有金针菇的容器中，接种量为2.0%，拌匀后再采用无菌的封口膜或旋紧盖子或用铝箔密封。
S6将S5步骤已密封的容器于20℃恒温静置发酵7d，即得成品。
实施例4
S1选用新鲜、没有受其他微生物感染的杏鲍菇（包括边角料、残缺等废弃菇）为原料，去杂、晾干或烘干表面水分后进行切块或切片（约1cm×1cm）。
S2按照50～150g杏鲍菇：100～300mL容器容积的比例将S1步骤准备好的杏鲍菇装入容器中，以杏鲍菇质量含盐量为2.0%加入食盐，同时加入1%的氯化钙，盖上盖子。
S3将装有杏鲍菇的容器瓶置于80～121℃蒸汽灭菌5～35min，这样可保证杏鲍菇块的形状完整，并且具有较好的弹性，冷却备用。
S4将实施例1所得土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按2:1的体积比例混合，得到混合菌液。
S5在无菌条件下，将S4步骤所得混合菌液接种进S3准备好的装有杏鲍菇的容器中，接种量为2.0%，拌匀后再采用无菌的封口膜或旋紧盖子或用铝箔密封。
S6将已密封的容器于30℃恒温静置发酵4～10d，即得成品。
本实施例混合发酵过程中土著乳酸菌和酿酒酵母不同体积比的混合菌种发酵杏鲍菇pH值变化图见图1所示。附图1中，土著乳酸菌和酿酒酵母添加比例为：组1=3:1，组2=2:1，组3=1:1，组4=1:2，组5=1:3。
实施例5
S1选用新鲜、没有受其他微生物感染的蟹味菇（包括废弃菇）为原料，去杂、晾干或烘干表面水分后备用。
S2按照50～150g蟹味菇：100～300mL容器容积的比例将S1步骤准备好的蟹味菇装入容器中，以蟹味菇质量含盐量为2.0%加入食盐，同时加入0.5%的氯化钙，盖上盖子。
S3将装有蟹味菇的容器瓶置于80～121℃蒸汽灭菌5～35min，这样可保证蟹味菇的形状完整，并且具有较好的弹性，冷却备用。
S4将实施例1所得土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按2:1的体积比例混合，得到混合菌液。
S5在无菌条件下，将已经制备好的混合菌种接种进蟹味菇中，接种量为2.0%，拌匀后再采用无菌的封口膜或旋紧盖子或用铝箔密封。
S6将已密封的容器于30℃恒温静置发酵4～10d，即得成品。
实施例6
S1选用新鲜、没有受其他微生物感染的猴头菇（包括废弃菇）为原料，去杂、晾干或烘干表面水分后进行切块（约1cm×1cm），备用。
S2按照50～150g猴头菇：100～300mL容器容积的比例将S1步骤准备好的猴头菇装入容器中，以猴头菇质量含盐量为2.0%加入食盐，同时加入1%的氯化钙，盖上盖子。
S3将装有猴头菇的容器瓶置于80～121℃蒸汽灭菌5～35min，这样可保证猴头菇的形状完整，并且具有较好的弹性，冷却备用。
S4将实施例1所得土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按2:1的体积比例混合，得到混合菌液。
S5在无菌条件下，将已经制备好的混合菌种接种进猴头菇中，接种量为2.0%，拌匀后再采用无菌的封口膜或旋紧盖子或用铝箔密封。
S6将已密封的容器于30℃恒温静置发酵4～10d，即得成品。
将实施例3至6所得产品进行感官评定实验。选10位感官评定人员组成评价小组，要求感官评定人员在评定前12h不喝酒，不吸烟，不吃辛辣等刺激性食物，评定前后2个样品要以清水漱口并间隔10min，采用目测、鼻嗅、口尝等方式逐个进行感官评定，填写感官评定表，收集感官评定表进行统计分析，感官评定标准及结果见下表2。
表2.混合发酵品感官评定指标标准和评定结果
经感官评定后，经本发明方法采用所述土著乳杆菌和酿酒酵母混合发酵而得的食药用菌发酵品，颜色为乳白色且比较均匀，有光泽，具有较适宜的酸爽味，具有较好的协调性，口感甘滑醇厚，其织构非常具有弹性，土著乳酸菌和酿酒酵母的配合，给杏鲍菇带来适宜的酸味和沁人的酒香味，两者相互作用还产生酯类等芳香物质，其组织比较脆嫩，消费者接受度非常高，是一种营养丰富，绿色健康的食用菌即食食品。
常温下本实施例产品的保质期为7～8天，比新鲜的杏鲍菇原料的保质期提高约 3倍。将本实施例产品置于4℃冰箱保存，可以保存2个星期，并可以有效保持较高的土著乳酸菌的活菌数以及口感。
实施例7
其他同实施例3，不同的是S4步骤所述食药用菌的盐含量为0.5%，氯化钙含量1%。
实施例8
其他同实施例3，不同的是S4步骤所述食药用菌的盐含量为4%，氯化钙含量0.6%
实施例9
其他同实施例3，不同的是S4步骤所述土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按3:1的体积比例混合，得到混合菌液。
实施例10
其他同实施例3，不同的是S4步骤所述土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按1:2的体积比例混合，得到混合菌液。
实施例11
其他同实施例3，不同的是S4步骤所述土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按5:1的体积比例混合，得到混合菌液。
实施例12
其他同实施例3，不同的是S4步骤所述土著乳酸菌菌液和酿酒酵母菌液按1:5的体积比例混合，得到混合菌液。
实施例13
其他同实施例3，不同的是S5步骤所述的接种量为0.5%。
实施例14
其他同实施例3，不同的是S5步骤所述的接种量为3%。
将实施例7至14所得产品进行感官评定实验。选10位感官评定人员组成评价小组，要求感官评定人员在评定前12h不喝酒，不吸烟，不吃辛辣等刺激性食物，评定前后2个样品要以清水漱口并间隔10min，采用目测、鼻嗅、口尝等方式逐个进行感官评定，填写感官评定表，收集感官评定表进行统计分析，感官评定标准及结果见下表3。感官评定指标和评分标准同表2所示。
表3.金针菇发酵品感官评定指标和评分标准
经感官评定后，经本发明方法混合发酵而得的金针菇发酵品，颜色均为乳白色，比较均匀，有光泽，具有金针菇的清香味和酒香味，同时具有较愉悦的酸味，具有较好的协调性，口感甘滑醇厚，其织构非常具有弹性，土著乳酸菌和酿酒酵母的配合，给金针菇带来适宜的酸味和沁人的酒香味，两者相互作用还产生酯类等芳香物质，其组织比较脆嫩，接受度非常高，是一种营养丰富，绿色健康的即食食品。
常温下本实施例产品的保质期为7～8d，比新鲜的金针菇原料的保质期提高约 2～3倍；将本实施例产品置于4℃冰箱保存，可以保存2个星期，并可以有效保持较高的植物乳杆菌的活菌数以及口感。
本发明混合发酵过程中，土著乳酸菌菌株数量的变化情况见附图2所示，酿酒酵母菌株数量的变化情况见附图3所示，附图2和附图3中，土著乳酸菌和酿酒酵母添加比例为：组1=3:1，组2=2:1，组3=1:1，组4=1:2，组5=1:3。
本发明所有实施例成品的土著乳酸菌的活菌数在107～109数量级，酿酒酵母活菌数在105～107数量级，pH范围为3.0～4.0。可直接采用发酵生产时采用的100～300mL的密封瓶包装。
Claims (9)
1.一种土著乳酸菌4J1，分类命名为假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)，于2014年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10129。
2.权利要求1所述土著乳酸菌4J1的培养方法，其特征在于，以1％～4％的接种量接种于发酵培养基1中，于25℃～37℃恒温发酵培养16～24h，离心收集菌体，用0.8％～2％的NaCl溶液悬浮菌体，即得；
所述的发酵培养基1为马铃薯汁培养基：马铃薯150～300g，蛋白胨5～15.0g、葡萄糖10.0～30.0g、蒸馏水1L，pH 6.8，121℃，20min灭菌即得。
3.权利要求1所述土著乳酸菌4J1的应用，其特征在于，是将所述菌株的培养菌液与酿酒酵母培养菌液制备得到混合菌液应用于食药用菌混合发酵方面；所述混合菌液是将所述土著乳酸菌和酿酒酵母分别培养至指数增长期时后将土著乳酸菌和酿酒酵母的培养液采用1～5：5～1体积比例混合而成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述混合菌液是将所述土著乳酸菌和酿酒酵母分别培养至指数增长期时后将土著乳酸菌和酿酒酵母的培养液采用2：1的体积比例混合而成。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食药用菌包括金针菇、杏鲍菇、猴头菇和蟹味菇。
6.根据权利要求3、4或5所述的应用，其特征在于，所述混合发酵是在发酵的食药用菌中添加0.5％～4.0％的盐、0.5～1％的氯化钙，在每50g～150g食药用菌中按照接种量为0.5％～3.0％接种混合菌液，在15℃～35℃的发酵温度下密封发酵4～10天。
7.一种食药用菌的混合发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.食药用菌的前处理：将新鲜无污染的食药用菌原料去杂、清洗、晾干、切块或切片，备用；
S2.按照50～150g食药用菌：100～300mL容器容积的比例将经S1步骤前处理好的食药用菌装入容器，加入食盐和氯化钙，盖上容器盖；
S3.将S2步骤准备的装有食药用菌的容器进行灭菌处理后冷却；
S4.在无菌条件下，将混合菌种的菌液加入S3步骤准备的装有食药用菌的容器，拌匀后密封容器；所述混合菌种的菌液是将权利要求1所述土著乳酸菌和酿酒酵母分别培养至指数增长期时后将二者的培养液混合而成，混合的体积比例为1～5：5～1；
S5.将密封容器恒温静置发酵即得成品；
S4步骤所述将混合菌种的菌液加入是在每50g～150g食药用菌中按照接种量为0.5％～3.0％接种混合菌种的菌液。
8.根据权利要求7所述食药用菌的混合发酵方法，其特征在于，S2步骤所述食盐和氯化钙的加入量分别按照在发酵的食药用菌中添加0.5％～4.0％的盐、0.5～1％的氯化钙确定。
9.根据权利要求7所述食药用菌的混合发酵方法，其特征在于，S5步骤所述将密封容器恒温静置发酵是在15℃～35℃的发酵温度下密封发酵4～10天。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |