CN104602672B - 用于治疗细菌感染的定制脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染的用途和定义脂质组成的其他脂质双层或单层用于治疗和预防细菌感染的用途。已经发现,此类脂质体,特别是包含胆固醇和鞘磷脂的脂质体、由鞘磷脂组成的脂质体、包含鞘磷脂和磷脂酰胆碱的脂质体和包含胆固醇和磷脂酰胆碱的脂质体的二和四组分混合物有效隔绝由细菌分泌的各种毒素,从而防止细菌毒素结合至靶细胞和靶细胞的毒素诱导的裂解。经静脉内注射,脂质体混合物防止了用致死剂量的金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌感染的实验室小鼠的死亡。
Description
发明领域
本发明涉及空脂质体或脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途和定义脂质组成的其他脂质双层或单层用于治疗和预防细菌感染的用途。同样,本发明涉及此类细菌感染的治疗方法,其包括单独或组合标准抗生素治疗施用空脂质体或脂质体混合物。此外,本发明同样涉及新脂质体混合物。
发明背景
细菌感染仍然是人生命的主要威胁之一。由于对甚至最有效的抗生素的细菌耐药性增加,所以也必须努力鉴定新型抗菌策略。在其他致病因素中,许多致病细菌分泌毒素,所述毒素通过干扰真核细胞的质膜杀死真核细胞。细菌成孔毒素在细胞表面上是有活性的,引起孔形成和质膜破坏,随后宿主靶细胞的裂解或凋亡,然而细菌磷脂酶通过质膜磷脂的酶促降解而诱导宿主细胞死亡。
细菌膜去稳定毒素,诸如胆固醇依赖的溶细胞素(CDCs:肺炎球菌溶血素O、链球菌溶血素O、破伤风菌溶血素),α溶血素或细菌磷脂酶(磷脂酶C、鞘磷脂酶)在感染性疾病的确立和发展中发挥关键作用。此类疾病是肺炎,所有年龄组中死亡的主要原因和低收入国家中儿童死亡的主要原因;菌血症,感染或外科手术的严重并发症,其特征在于由于脓毒症和脓毒性休克导致的高死亡率;和脑膜炎,危及生命的疾病,其也导致了严重的长期后果,诸如耳聋、癫痫、脑积水和认知缺陷。
为了靶向宿主细胞,细菌膜去稳定毒素或结合至单个膜脂质(脂质头部基团)或利用真核细胞的质膜的脂质双层的不均匀性质,与某些脂质种类中富集的微结构域相互作用(Gonzales M.R.等人, Cell. Mol. Life Sci. 2008, 65:493-507)。体内条件不利于双层内脂质的非均匀分布,因为跨膜蛋白和众多具有可变长度的单个脂质种类的存在以及它们的酰基链的饱和状况反对脂质去混合,和从而稳定的脂质微结构域的形成(Simons K.和Gerl M.J., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11:688-99)。然而,在从有限数量的仔细选择的脂质种类制备的人工无蛋白脂质体(其中可以生成延长的稳定的脂质微结构域)中可以尽其极采用脂质去混合(Klose C.等人, J. Biol. Chem. 2010, 285:30224-32)。此外,人工脂质体允许比体内以往可能存在的脂质高得多的相对浓度的特定脂质。因此,可以产生展示定义生物化学特性的稳定脂质微结构域且具有高相对浓度的特定脂质的脂质体。脂质体目前在化妆品和制药工业中用作用于局部和全身药物递送的载体,且被认为是无毒的。
发明概述
本发明涉及定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染,特别是皮肤病变、菌血症、脑膜炎、呼吸道感染诸如肺炎和腹腔感染诸如腹膜炎的用途。
本发明还涉及覆盖非脂质表面的定义脂质组成的脂质双层或脂质单层,其用于治疗和预防细菌感染。
同样,本发明涉及此类细菌感染的治疗方法,其包括向有需要的患者施用治疗有效量的定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物,和预防有风险的受试者中的此类细菌感染的方法。此外,本发明涉及细菌感染的治疗方法,其包括在细菌感染的标准抗生素治疗之前、之后、一起或平行地向有需要的患者施用治疗有效量的定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物。
此外,本发明涉及定义脂质组成的空脂质体的新混合物。
附图简述
图1.由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护单核细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素、
α溶血素和磷脂酶C的影响。
A-D) 含有胆固醇组合PC (3)、Sm (4)或PS (5),但不组合PE (6)的脂质体(1:1w/w混合物)保护THP-1细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素:肺炎球菌溶血素O (A)、链球菌溶血素O (B)、破伤风菌溶血素(C)以及磷脂酶C(D)的影响。
E) 含有胆固醇组合Sm (4),但不组合PC (3)、PS (5)或PE (6)的脂质体(1:1 w/w)保护THP-1细胞免受α溶血素的影响。
F) 无胆固醇的脂质体(7-9)是无效的。
c (r.u.) = 相对于在毒素(2)不存在的情况下维持的细胞数的在毒素(1, 3-9)存在的情况下维持的细胞数以相对单位(r.u.)给出。PLY=肺炎球菌溶血素O;SLO=链球菌溶血素O;TL= 破伤风菌溶血素; PLC=磷脂酶C; HML=α溶血素。1=对照(无脂质体);2 =对照(无毒素),3= Ch:PC (1:1 w/w)脂质体;4= Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体;5= Ch:PS (1:1 w/w)脂质体;6= Ch:PE (1:1 w/w)脂质体;7= PC:Sm (1:1 w/w)脂质体;8= Sm脂质体;9= PC脂质体。Ch =胆固醇;PC=磷脂酰胆碱;PS=磷脂酰丝氨酸;Sm =鞘磷脂;PE=磷脂酰乙醇胺。
图2.由胆固醇和鞘磷脂(1:1 w/w)构成的脂质体在微克量保护单核细胞免受胆固
醇依赖的溶细胞素的影响,而对于针对金黄色葡萄球菌α溶血素和产气荚膜梭状芽孢杆菌
磷脂酶C的保护则需要25-100微克的脂质体。
A) 针对0.2微克PLY的保护。B) 针对0.4微克SLO的保护。C) 针对0.2微克TL的保护。D) 针对1.2微克HML的保护。E) 针对4.5微克PLC的保护。
c (r.u.) =相对于在毒素不存在的情况下维持的细胞数的在毒素存在的情况下维持的细胞数,以相对单位给出。X轴:LP (mkg) =脂质体的量(微克)。PLY=肺炎球菌溶血素O;SLO=链球菌溶血素O;TL= 破伤风菌溶血素;HML=α溶血素;PLC=磷脂酶C。
图3.对于由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体需要高于30% (w/w)的浓度的胆固醇来
保护单核细胞免受肺炎球菌溶血素、破伤风菌溶血素或α溶血素的影响。
A) 针对0.2微克PLY的保护。B) 针对0.2微克TL的保护。C) 针对1.2微克HML的保护。c (r.u.) = 相对于在毒素不存在的情况下维持的细胞数的在毒素存在的情况下维持的细胞数,以相对单位给出。Ch (%) = 由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体中胆固醇的百分比(w/w)。PLY=肺炎球菌溶血素;TL= 破伤风菌溶血素;HML=α溶血素。
图4. 由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护单核细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素
和金黄色葡萄球菌α溶血素的组合的影响。
A) Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体(6)针对α溶血素(HML; 1.2微克)、链球菌溶血素O(SLO; 0.4微克)和破伤风菌溶血素(TL; 0.2微克)的联合作用发挥完全保护作用,而Ch:PC(1:1 w/w)脂质体是无效的(7)。c (r.u.) = 相对于在毒素(1)不存在的情况下维持的对照细胞数的在毒素(2-7)存在的情况下维持的细胞数,以相对单位计。1 =对照(无毒素);2 =SLO,无脂质体;3 = TL,无脂质体;4 = HML,无脂质体;5 = SLO+TL+HML,无脂质体;6 = SLO+TL+HML,Ch:Sm脂质体;7 = SLO+TL+HML,Ch:PC脂质体。Ch =胆固醇;PC =磷脂酰胆碱;Sm =鞘磷脂。
B) 在25微克由Ch:Sm (1:1 w/w)构成的脂质体观察到针对HML (1.2微克)、SLO(0.4微克)和TL (0.2微克)的联合作用的完全保护作用。LP (mkg) =脂质体的量(微克)。
C) 离心实验证实,所有三种毒素直接结合Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体。将毒素与(6)或不与(2-5) Ch:Sm脂质体预孵育。离心后,将上清液添加至细胞。1 =对照(无毒素);2 =SLO,无脂质体;3 = TL,无脂质体;4 = HML,无脂质体;5 = SLO+TL+HML,无脂质体;6 = SLO+TL+HML,Ch:Sm脂质体。
图5. 由胆固醇和鞘磷脂(1:1 w/w)构成的脂质体保护单核细胞免受化脓性链球
菌毒素的影响。
A,B) THP-1细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖(正方形;(A)中虚线)。5种化脓性链球菌菌株(GAS 1-5 =临床分离株;所有都生长在BHI液体培养基中)的培养上清液有效地杀死THP-1细胞(三角形),然而,由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护细胞免受链球菌毒素的影响(圆形)。105c =细胞数x 105。t (d) =治疗后时间(天)。
C) 由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体保护单核细胞免受微克量的化脓性链球菌的培养上清液的影响。c(%) =相对于在细菌上清液不存在的情况下维持的细胞数(100%)的在细菌上清液存在的情况下维持的细胞数的百分比。LP (mkg) =脂质体的量(微克)。
图6. 由胆固醇和鞘磷脂(1:1 w/w)构成的脂质体组合仅鞘磷脂的脂质体完全保
护单核细胞免受肺炎链球菌毒素的影响。
A,B) THP-1细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖(正方形)。2种肺炎链球菌菌株(肺炎链球菌1 =临床分离株且肺炎链球菌2 = D39菌株;两者都生长在BHI液体培养基中)的培养上清液有效地杀死THP-1细胞(三角形),然而,由胆固醇和鞘磷脂(1:1 w/w)构成的脂质体部分保护细胞免受肺炎链球菌毒素的影响(圆形)。105c =细胞数x 105。t (d) =治疗后时间(天)。
C) 含有胆固醇的脂质体和不含胆固醇、仅鞘磷脂的脂质体的混合物针对肺炎链球菌毒素是完全保护的。该图显示由恒定(400 μg)量的胆固醇: 鞘磷脂(1:1 w/w)脂质体和不同量(0 - 400 µg)的仅鞘磷脂的脂质体构成的脂质体混合物的保护作用。
c (r.u.) = 相对于在上清液不存在的情况下维持的细胞数的在细菌上清液存在的情况下维持的细胞数以相对单位(r.u.)给出。Sm LP (mkg) =仅鞘磷脂的脂质体的量(微克)。
图7.胆固醇:磷脂酰胆碱脂质体(1:1 w/w)和胆固醇:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)和鞘
磷脂脂质体的混合物保护单核细胞免受金黄色葡萄球菌菌株MRSA 2040分泌的毒素的影
响。
THP-1细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖(正方形)。金黄色葡萄球菌(在BHI液体培养基中生长)的培养上清液在脂质体不存在的情况下有效杀灭THP-1细胞(三角形)。(A) 900微克(菱形)胆固醇:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)脂质体提供针对细菌毒素的显著保护,而在600微克仅观察到有限的保护(圆形)。(B) 对于600微克胆固醇:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)脂质体与75微克Sm脂质体的混合物观察到完全保护(菱形)。单独使用的900微克Sm脂质体是无效的(圆形)。105c =细胞数x 105。t (d) =治疗后时间(天)。
图8.无胆固醇、含有鞘磷脂的脂质体和胆固醇:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)和仅鞘磷脂
的脂质体的混合物保护单核细胞免受金黄色葡萄球菌Doppelhof菌株分泌的毒素的影响。
A,B) THP-1细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖(正方形)。金黄色葡萄球菌(在BHI液体培养基中生长)的培养上清液在脂质体不存在的情况下有效杀灭THP-1细胞(三角形)。(A) 1200微克(菱形)鞘磷脂脂质体提供针对细菌毒素的显著保护。(B) 当在600微克使用时,对于鞘磷脂和鞘磷脂:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)的混合物观察到最有效的保护(菱形),而单独的鞘磷脂脂质体(圆形)和单独的鞘磷脂:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)脂质体(星号)不那么有效。C) 含有胆固醇的脂质体和无胆固醇、仅鞘磷脂的脂质体的混合物针对金黄色葡萄球菌Doppelhof菌株分泌的毒素是完全保护的。该图显示由恒定(400 μg)量的胆固醇:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)脂质体和不同量(0 - 1200 µg)的仅鞘磷脂的脂质体构成的脂质体混合物的保护作用。
105c =细胞数x 105。t (d) =治疗后时间(天)。c (r.u.) =相对于在上清液不存在的情况下维持的细胞数的在细菌上清液存在的情况下维持的细胞数以相对单位(r.u.)给出。Sm LP (mkg) =仅鞘磷脂的脂质体的量(微克)。
图9.胆固醇:鞘磷脂(1:1 w/w)、仅鞘磷脂、鞘磷脂:磷脂酰胆碱(1:1 w/w)和胆固
醇:磷脂酰胆碱(1:1 wt/wt)脂质体的4组分混合物保护单核细胞免受金黄色葡萄球菌的
Doppelhof和MRSA 2040菌株两者分泌的毒素的影响。
THP-1细胞在BHI液体培养基存在的情况下增殖(正方形)。MRSA 2040(A)或Doppelhof (B)金黄色葡萄球菌菌株(在BHI液体培养基中生长)的培养上清液在脂质体不存在的情况下有效杀灭THP-1细胞(三角形),然而1200微克4组分脂质体混合物(1:1:1:1)完全保护细胞免受MRSA 2040(A)或Doppelhof (B)毒素的影响。
105c =细胞数x 105。t (d) =治疗后时间(天)。
图10. 脂质体保护小鼠免于金黄色葡萄球菌菌血症,免于肺炎链球菌肺炎和免于
肺炎链球菌菌血症。
A) 实验室小鼠用致死剂量的Doppelhof金黄色葡萄球菌菌株静脉内注射。在注射细菌后1、5和24小时,小鼠用25-50微升生理盐水(菱形)、或25微升(1 mg) 胆固醇: 鞘磷脂(1:1 w/w)脂质体(正方形)或50微升(2 mg)胆固醇: 鞘磷脂(1:1 w/w)脂质体+仅鞘磷脂的脂质体+鞘磷脂:磷脂酰胆碱 (3:1 w/w)脂质体的1:2:2混合物(三角形)注射。
B) 小鼠用肺炎链球菌菌株D39鼻内感染。在注射细菌后30分钟,小鼠接受50微升生理盐水的一次注射(菱形)或50微升(2 mg) 胆固醇: 鞘磷脂(1:1 w/w) + 胆固醇:磷脂酰胆碱(1:1 w/w) +仅鞘磷脂+鞘磷脂:磷脂酰胆碱(3:1 w/w)脂质体的1:1:1:1混合物的单一鼻内注射(三角形)。
C) 小鼠用致死剂量的肺炎链球菌菌株D39静脉内注射。在注射细菌后8和12小时,小鼠静脉内接受75微升/注射(3 mg)的以下脂质体: 1) 胆固醇: 鞘磷脂(1:1 w/w) +仅鞘磷脂的脂质体的1:1混合物(三角形);2) 胆固醇: 鞘磷脂(1:1 w/w)脂质体(正方形);3)仅鞘磷脂的脂质体(圆形)或4) 生理盐水(菱形)。
S (%) =存活小鼠百分比。t (d) =感染后时间(天)。
发明详述
经工程改造以具有对于膜靶向毒素更高的体内亲和力,吸入或静脉内注射或输注的空脂质体和脂质体混合物充当居于受感染患者的血液或呼吸道的细菌毒素的陷阱,这为新型抗细菌毒素隔绝(sequestrating)治疗铺平了道路。
本发明涉及定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染,特别是菌血症、脑膜炎、细菌性皮肤感染、呼吸道感染诸如肺炎和腹腔感染诸如腹膜炎的用途。
本发明的脂质体是空脂质体,即没有封装任何抗生素或其他药物的脂质体。如果需要,它们可以与携带药物的已知或新型脂质体组合使用。
本研究显示,精确定义脂质组成的人工脂质体或精确定义脂质组成的脂质体的混合物有效隔绝纯化的成孔毒素和磷脂酶C,从而防止它们结合至靶细胞。因此,脂质体或它们的混合物的应用防止由应用肺炎链球菌、化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌的纯化毒素或培养上清液诱导的培养上皮细胞和单核细胞的裂解,并且保护实验小鼠免于由于实验诱导的菌血症或肺炎导致的死亡。
本发明涉及定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。
本发明还涉及覆盖非脂质表面的定义脂质组成的脂质双层或脂质单层,其用于治疗和预防细菌感染。考虑的非脂质表面是,例如,医疗用品、可生物降解的珠粒和纳米颗粒。
考虑的脂质体是20 nm至10 µm、优选20至500 nm的人工脂质体,其包含脂质或磷脂,所述脂质或磷脂选自甾醇类、鞘脂类和甘油脂类,特别选自胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二酰基甘油、和含有一个(溶磷脂酸(lyso-))或两个(二酰基-)长于4个碳原子且最多达28个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酸。
考虑的脂质双层或单层脂质的组成与所示用于脂质体的相同。
包含4至28个碳原子的脂肪酸为,例如,饱和的直链链烷羧酸,优选具有偶数个碳原子,诸如12至26个碳原子,例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸或山萮酸,或不饱和的直链链烯羧酸,优选具有12至26的偶数个碳原子,和一个、两个或更多个,优选多达六个反式或优选顺式构型的双键,例如油酸、亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸或芥酸。
空脂质体意指本发明中考虑的脂质体不并入抗生素或其他药物。如本文所使用的“并入”意指封装入脂质体的腔中,脂质体的可能双层内,或者作为脂质体的薄膜层的部分。如本文所使用的脂质体还排除用结合剂修饰的脂质,所述结合剂诸如抗体和单糖或寡糖,例如如糖脂中。然而,用聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体被认为是本发明的部分。已知PEG改变脂质体的循环时间。
具体而言,本发明涉及包含胆固醇和鞘磷脂的空脂质体,和包含胆固醇和鞘磷脂或磷脂酰胆碱和鞘磷脂的空脂质体与其他定义脂质组成的空脂质体、诸如包含脂质或磷脂的脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染的用途,所述脂质或磷脂选自甾醇类、鞘脂类和甘油脂类,特别选自胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二酰基甘油、和含有一个或两个长于4个碳原子且最多达28个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酸。
在一个实施方案中,本发明涉及包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多胆固醇的空脂质体,和包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多胆固醇的空脂质体与如本文定义的其他空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。具体而言,本发明涉及由鞘磷脂和30% (w/w)或更多胆固醇组成的空脂质体,和由鞘磷脂和30% (w/w)或更多胆固醇组成的空脂质体与如本文定义的其他空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。更具体地,本发明涉及由鞘磷脂和35%至65% (w/w)胆固醇、优选40%至55% (w/w)胆固醇、特别是45%至55% (w/w)胆固醇、诸如约50% (w/w)胆固醇组成的空脂质体,和由鞘磷脂和35%至65%、或40%至55%、或45%至55%、例如约50% (w/w)胆固醇组成的空脂质体与如本文定义的其他空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。
在一个具体实施方案中,本发明涉及包含胆固醇和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体的脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与如本文定义的其他空脂质体的脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。具体而言,本发明涉及包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体的脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。
在一个具体实施方案中,本发明涉及包含胆固醇和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体与由鞘磷脂组成的空脂质体的三组分脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。
在又一个具体实施方案中,本发明涉及包含胆固醇和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体与由鞘磷脂组成的空脂质体与包含胆固醇和磷脂酰胆碱或由其组成的空脂质体的四组分脂质体混合物用于治疗和预防细菌感染的用途。
考虑的脂质双层或单层脂质的具体组成与所示用于脂质体的相同,优选包含胆固醇和鞘磷脂,和任选地磷脂酰胆碱。
理解的是,如上述定义的空脂质体,如上述定义的空脂质体的混合物和脂质双层或脂质单层可以与其他化合物一起使用。例如,可以添加组分以制备标准药物组合物。还考虑添加药物或药物样化合物,或者添加在脂质体内部并入药物或药物样化合物的其他脂质体。
考虑的药物特别是抗生素。此类抗生素是例如,碳青霉烯类,诸如亚胺培南/西司他丁,美罗培南,厄他培南和多尼培南;第一代头孢菌素类,诸如头孢羟氨苄和头孢氨苄;第二代头孢菌素类,诸如头孢呋辛,头孢克洛和头孢丙烯;第3代头孢菌素类,诸如头孢他啶,头孢曲松,头孢克肟,头孢地尼,头孢妥仑,头孢噻肟,头孢泊肟和头孢布烯,第四代头孢菌素类,诸如头孢吡肟;第5代头孢菌素类,诸如头孢洛林(ceftaroline fosamil)和头孢吡普;糖肽类,诸如万古霉素,替考拉宁和特拉万星;大环内酯类,诸如克拉霉素,阿奇霉素,地红霉素,红霉素,罗红霉素,醋竹桃霉素,泰利霉素,壮观霉素和螺旋霉素;青霉素类,诸如阿莫西林,氟氯西林,苯唑西林(oxacillin),羧苄青霉素(carbenicllin)和哌拉西林;青霉素组合,诸如阿莫西林/克拉维酸,哌拉西林/三唑巴坦,氨苄青霉素/舒巴坦和替卡西林/克拉维酸;喹诺酮类,诸如环丙沙星(例如Aradigm的脂质体环丙沙星)和莫西沙星;针对分枝杆菌的药物,诸如利福平(美国的利福平),氯法齐明,氨苯砜,卷曲霉素,环丝氨酸,乙胺丁醇,乙硫异烟胺,异烟肼,吡嗪酰胺,利福布汀,利福喷丁和链霉素;其他抗生素,诸如甲硝唑,胂凡纳明,氯霉素,磷霉素,夫西地酸,利奈唑胺,莫匹罗星,平板霉素,奎奴普丁/达福普汀,利福昔明,甲砜霉素,替加环素,和替硝唑;氨基糖甙类,诸如阿米卡星,庆大霉素,卡那霉素,新霉素,奈替米星,妥布霉素(例如Axentis的fluidosomesTM妥布霉素)和巴龙霉素;磺胺类,诸如磺胺米隆,磺胺柯衣定(sulfonamidochrysoidine),磺胺醋酰,磺胺嘧啶,磺胺嘧啶银,磺胺甲二唑(sulfamethizole),磺胺甲噁唑,对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide),柳氮磺胺吡啶,磺胺异噁唑,甲氧苄氨嘧啶和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明,TMP-SMX);四环素类,诸如地美环素,强力霉素,米诺环素,土霉素和四环素;林可酰胺类,诸如克林霉素和林可霉素;和脂肽类,诸如达托霉素。
考虑的其他药物是抗癌剂,例如硫酸长春新碱、长春新碱、阿糖胞苷、道诺霉素和阿霉素。
仍然考虑的其他药物是抗炎药,例如皮质类固醇类(糖皮质激素类),诸如氢化可的松(皮质醇),可的松,泼尼松,泼尼松龙,甲泼尼龙,地塞米松,倍他米松,曲安西龙,倍氯米松,醋酸氟氢可的松,醋酸去氧皮质酮(DOCA),醛固酮,布地奈德,地奈德和醋酸氟轻松;非类固醇抗炎药,例如水杨酸类,诸如阿司匹林(乙酰水杨酸),二氟尼柳和双水杨酯; 丙酸衍生物,诸如布洛芬,右旋布洛芬,萘普生,非诺洛芬,酮洛芬,右酮洛芬,氟比洛芬,奥沙普秦和洛索洛芬;乙酸衍生物,诸如吲哚美辛,托美丁,舒林酸,依托度酸,酮咯酸,双氯芬酸和萘丁美酮;烯醇酸(昔康)衍生物,诸如吡罗昔康,美洛昔康,替诺昔康,屈昔康,氯诺昔康和伊索昔康;芬那酸衍生物(芬那酸类),诸如甲芬那酸,甲氯芬那酸,氟芬那酸和托芬那酸;选择性COX-2抑制剂(昔布类),诸如塞来昔布;和其他,诸如利克飞龙(licofelone)。
考虑的其他药物是血管加压剂和血管收缩剂,例如血管加压素,羟甲唑啉,苯肾上腺素,丙己君(propylhexedrine),伪麻黄碱,肾上腺素,去甲肾上腺素,多巴胺和抗组胺药。
还考虑的是其他类型的药物,例如对乙酰氨基酚(止痛药),两性霉素B(针对真菌感染),布比卡因(手术后疼痛控制),针对甲型肝炎、流感、破伤风、逃避性MRSA、百日咳、白喉、脑膜炎球菌、霍乱、伤寒、炭疽、肺炎球菌(例如Prevnar 13®)的疫苗,和其他抗细菌疫苗,吗啡(止痛药),维替泊芬(眼科疾病),雌二醇(更年期失调),aganocide®化合物,例如auriclosene (NVC-422, N,N-二氯-2,2-二甲基牛磺酸(抗细菌剂),M Bio Technology的包含特异性脂质细菌抗原的脂质体颗粒,例如,作为疫苗的细菌模拟颗粒(支原体感染,包括肺炎)和噬菌体。
考虑的其他药物是抗毒素,例如破伤风抗毒素,诸如破伤风免疫球蛋白,纳米海绵,聚合纳米颗粒,宿主细胞膜(诸如红血细胞膜)包围的仿生聚合纳米颗粒核心,毒素靶向性单克隆抗体和抗体片段,抑制特定毒素产生的天然化合物,细菌毒素分泌系统的抑制剂,诸如T3SS抑制剂,毒素结合粘蛋白型融合蛋白,充当中和毒素的诱饵的可溶性T细胞受体,和抑制毒素处理的肽。
此外,本发明涉及定义脂质组成的空脂质体的新混合物。具体而言,本发明涉及包含胆固醇和鞘磷脂或磷脂酰胆碱和鞘磷脂的空脂质体,与其他定义脂质组成的空脂质体诸如包含脂质或磷脂的脂质体的混合物,其用于治疗和预防细菌感染,所述脂质或磷脂选自甾醇类、鞘脂类和甘油脂类,特别选自胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二酰基甘油、和含有一个或两个长于4个碳原子且最多达28个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酸。
考虑的具体混合物是包含鞘磷脂和胆固醇或由其组成的空脂质体与如本文所定义的其他空脂质体的混合物,诸如包含胆固醇和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体的混合物。
考虑的其他具体混合物是包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与如本文所定义的其他空脂质体的混合物,诸如包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体的混合物。
考虑的其他具体混合物是包含胆固醇和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体与由鞘磷脂组成的空脂质体的三组分脂质体混合物。
考虑的其他具体混合物是包含胆固醇和鞘磷脂或由其组成的空脂质体与包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的其他空脂质体与由鞘磷脂组成的空脂质体与包含胆固醇和磷脂酰胆碱或由其组成的空脂质体的四组分脂质体混合物。
脂质体内,根据形成脂质体的趋势、不同组成的脂质体的稳定性和预期用途,所述组分可以不同的量存在。实例为由约1:1、2:1、3:1、4:1或5:1(重量/重量)组成的两种组分组成的脂质体。其他组分可以约10、20或25%(w/w)量进行混合。
在本发明的优选脂质体中,胆固醇以30-70%,优选40-60%,例如45-55%,特别是约50% (w/w)的量存在,磷脂酰胆碱以10-60%,优选20-60%,优选40-60%,例如45-55%,更优选约50% (w/w)的量存在;且鞘磷脂以10-100%,优选20-60%或100%,优选40-60%,例如45-55%,更优选约50% (w/w)或100%的量存在,胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,优选2:1至1:2,特别是约1:1 (w/w),且胆固醇:磷脂酰胆碱或磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,优选2:1至1:2,特别是约1:1 (w/w)。
在脂质体混合物中,具有不同组成的单个脂质体组分以治疗需要定义的比例进行混合。实例为,对于2组分混合物,约1:1、2:1或3:1 (w/w);对于3组分混合物,约1:1:1、2:1:1或2:2:1 (w/w);且对于4组分混合物,约1:1:1:1、2:1:1:1、2:2:1:1或2:2:2:1 (w/w)。
考虑的脂质体由一种或多种磷脂双层组成。优选的是大单层囊泡(LUV)和多层囊泡(MLV)。最优选的是小单层囊泡(SUV)。
根据本领域中已知的挤压或超声处理或微流化(例如,高压均化)方法制备脂质体。例如,所述脂质在有机溶剂诸如氯仿中混合。将氯仿蒸发,且将干燥脂质膜水化在水溶液诸如生理盐水(0.9% NaCl)、Krebs溶液或台氏溶液中,且进一步超声处理,以产生脂质体。如果必要,脂质体的大小可以通过将它们挤压通过固定孔直径的膜过滤器来控制。临应用前,将不同脂质组成的单独产生的脂质体以所需比例混合。
上皮细胞构成了对病原体的物理屏障。人工脂质体能够保护人胚胎肾(HEK293)上皮细胞免于链球菌溶血素O(SLO)诱导的裂解。质膜内形成的SLO孔足够大,足以引起具有高达100 kDa的Mr的细胞质蛋白的流出。SLO与含有胆固醇的脂质体的直接结合通过脂质体与毒素预孵育、随后离心来证实。离心后,将回收在沉淀中的脂质体弃去且将无脂质体的上清液添加至细胞。上清液没有引起暴露细胞的任何损害,表明毒素由于其与脂质体的结合被有效地从溶液中去除。
针对多种成孔毒素(PFTs),脂质体不仅保护上皮细胞,而且保护先天免疫系统的细胞。在各种脂质组成的脂质体的存在或不存在的情况下评价PFTs对THP-1人单核细胞系的增殖的影响。在200 ng肺炎球菌溶血素(PLY)、400 ng链球菌溶血素O (SLO)、200 ng破伤风菌溶血素(TL)、1.2 μg金黄色葡萄球菌α溶血素(HML)或4.5 μg产气荚膜梭状芽孢杆菌磷脂酶C存在的情况下,THP-1细胞的增殖得到完全抑制。如图1 A-D中所示,含有胆固醇组合(1:1 w/w)磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(Sm)或磷脂酰丝氨酸(PS),但不组合磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体保护THP-1细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素(PLY、SLO、TL)或磷脂酶C(PLC)的影响,而不含胆固醇的脂质体是无效的(图1F)。
相反,Ch:PC脂质体(1:1 w/w)和Ch:PS脂质体(1:1 w/w)显示对金黄色葡萄球菌α溶血素(这属于小孔形成毒素组)没有保护作用(图1 E)。不含胆固醇的脂质体也是无效的(图1 F)。然而,含有Ch:Sm (1:1 w/w)的脂质体能够针对α溶血素发挥完全保护作用(图1E)。因此,只有由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体能够保护THP-1细胞免受任何测试毒素的影响。
图2显示,在3 μg观察到Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体针对200 ng PLY的完全保护作用;在1.5 μg观察到其针对400 ng SLO的完全保护作用;在3 μg观察到其针对200 ng TL的完全保护作用;在25-50 μg观察到其针对1.2 μg HML的完全保护作用;且在100 μg观察到其针对4.5 μg PLC的完全保护作用。
图3表明对于Ch:Sm脂质体需要等于或高于30% (w/w)的浓度的胆固醇来保护单核细胞免受PLY、TL或HML的影响。在50% (w/w)胆固醇(其对应于66 mol%胆固醇)观察到最大保护。
由于由胆固醇和鞘磷脂构成的脂质体能够保护细胞免受胆固醇依赖的溶细胞素或α溶血素的影响,所以研究这些脂质体针对两种毒素类型的组合是否有效。事实上,25 μgCh:Sm (1:1 w/w)脂质体针对α溶血素(1.2 μg)、SLO (400 ng)和TL (200 ng)的组合作用发挥完全保护作用,而由Ch:PC (1:1 w/w)构成的脂质体不具有任何作用(图4 A,B)。离心实验证实,所有三种毒素直接结合Ch:Sm脂质体(图4C)。
Ch:Sm脂质体能够保护培养细胞免受由细菌病原体的临床相关菌株分泌的毒素的整个组(palette)的影响。在裂解浓度的细菌培养上清液存在和脂质体存在或不存在的情况下,评价THP-1细胞的增殖。
如图5 A、B中所示,Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体保护细胞免受由化脓性链球菌分泌的毒素的影响。在微克量的脂质体时观察到针对化脓性链球菌毒素的完全保护作用(图5C)。这些量与中和裂解浓度的纯化胆固醇依赖的溶细胞素所需的量类似,但比中和纯化的α溶血素或纯化的磷脂酶C所需的量低得多(图2),表明胆固醇依赖的溶细胞素仅负责化脓性链球菌的细胞裂解作用。
Ch:Sm脂质体还保护细胞免受由肺炎链球菌分泌的毒素的影响(图6 A-C)。尽管用含有胆固醇(1:1 w/w)的脂质体仅实现有限的保护(图6 A-C),但含有胆固醇的脂质体(400μg)和不含胆固醇、仅Sm的脂质体(400 µg)的混合物针对这种病原体是完全保护的(图6C)。
金黄色葡萄球菌由于其针对最强效抗生素的抗性而臭名昭著。脂质体毒素隔绝提供了甚至针对这种病原体的保护。Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体显示仅针对由金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株(MRSA 2040)分泌的毒素的有限保护。对于Ch:PC (1:1 w/w)脂质体获得了类似结果:对于实现显著保护需要高达900 μg Ch:PC脂质体,而600 μg这些脂质体仅显示轻微影响(图7)。然而,不同脂质体混合物的详细分析表明,将少至75 μg仅鞘磷脂的脂质体添加至600 μg Ch:PC (1:1 w/w)脂质体实现了针对这种病原体的完全保护(图7 B)。单独的Sm脂质体或单独的PC脂质体在高达900 μg的量没有任何保护作用(图7 B)。
脂质体处理针对从败血症患者分离的金黄色葡萄球菌的临床相关的“Doppelhof”菌株也是有效的。当在针对MRSA 2040菌株保护的浓度使用时,Ch:Sm (1:1 w/w)或Ch:PC(1:1 w/w)脂质体或它们与仅Sm的脂质体的组合都不是有效的。然而,各种脂质体组合物和它们的组合的保护作用的详细分析表明,与MRSA 2040菌株相反,Doppelhof菌株分泌的细胞裂解毒素被仅Sm的脂质体有效地隔绝(图8A)。尽管单独的1200 μg Sm脂质体显示针对Doppelhof菌株的显著保护,但在较低浓度,含有Sm脂质体和Sm:PC脂质体的混合物比相同量的Sm脂质体或Sm:PC脂质体更有效(图8 B)。含有胆固醇的脂质体(1:1 w/w; 600 μg)和不含胆固醇、仅鞘磷脂的脂质体(1'200 μg)的混合物针对由金黄色葡萄球菌Doppelhof菌株分泌的毒素是完全保护的(图8C)。
因此,不仅金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌分泌多种细胞裂解毒素,而且相对量的分泌毒素在不同菌株之间显著不同,因此对于它们的完全中和需要使用复杂的脂质体混合物来实现高亲和力毒素结合。然而,由于毒素-脂质体相互作用的非理想选择性,已经用单一脂质体实现了显著的部分保护,条件是它们的浓度足够高,足以促进其低亲和力毒素结合。
不同脂质体混合物的详细分析表明,对于针对金黄色葡萄球菌的MRSA 2040和Doppelhof菌株两者的保护,需要1'200 μg (总脂质)Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体 + Ch:PC(1:1 w/w)脂质体 + 仅Sm + Sm:PC (1:1 w/w)脂质体的1:1:1:1混合物(图9)。重要的是,由于含有胆固醇的脂质体的存在,4组分混合物也保护免受链球菌毒素的影响(参见图1-5)。因此,四组分脂质体混合物(1200 μg总脂质)能够保护培养细胞免受链球菌和葡萄球菌毒素的联合作用。由含有胆固醇(50% w/w胆固醇)和仅鞘磷脂的脂质体组成的双组分混合物针对所有测试的细菌上清液也都是保护的(图6-8),然而,对于针对金黄色葡萄球菌Doppelhof菌株分泌的毒素的完全保护需要略高量(1'800 μg总脂质)的这种混合物(图8C)。
已知测试的细菌种(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌)诱导或促进威胁生命的病况诸如菌血症的发展。优选的脂质体的三或四组分混合物能够保护实验室小鼠免于实验诱导的菌血症或肺炎。
小鼠用致死剂量的金黄色葡萄球菌Doppelhof菌株(来自败血症患者的临床分离株)静脉内注射。在注射细菌后1、5和24小时,小鼠用生理盐水(对照)、用1mg/注射的Ch:Sm(1:1 w/w)脂质体,或用2mg/注射的Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体;仅Sm和Sm:PC (1:1 w/w)脂质体的1:2:2混合物静脉内注射。没有对照小鼠存活超过第7天,其中90%的死亡在36小时内发生(图10 A)。用胆固醇-鞘磷脂脂质体处理的小鼠的存活比对照小鼠长2-3天,但在菌血症后没有恢复。然而,用3组分脂质体混合物处理导致6/8只小鼠完全恢复。
在肺炎球菌肺炎模型中,小鼠用肺炎链球菌菌株D39鼻内感染。注射细菌后30分钟,小鼠接受2 mg Ch:Sm (1:1 w/w) 脂质体 + Ch:PC (1:1w/w) 脂质体 + 仅Sm脂质体 +Sm:PC (3:1 w/w)脂质体的1:1:1:1混合物的单次鼻内注射。图10 B显示了脂质体混合物提供了针对肺炎的保护。
在肺炎球菌菌血症模型中,小鼠用致死剂量的肺炎链球菌菌株D39静脉内注射。在注射细菌后8和12小时,小鼠静脉内接受3 mg/注射的以下脂质体: 1) Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体 + 仅Sm脂质体的1:1混合物; 2) Ch:Sm (1:1 w/w)脂质体;3) 仅Sm脂质体或4)生理盐水。图10 C显示,没有对照或仅Sm小鼠存活超过32小时。但是,6/8只接受Ch:Sm + 仅Sm脂质体混合物的小鼠和3/8只接受Ch:Sm脂质体的小鼠在菌血症56小时后仍然存活。
当在大鼠中用作抗生素的静脉内递送的载体时,已知对于保护小鼠免于葡萄球菌菌血症所需剂量的脂质体(50-150 mg/kg)是无毒的(400 mg/kg; Bakker-WoudenbergI.A.J.M. 等人, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, 45:1487-1492)。此外,脂质乳剂(例如,“Intralipid”, “Lipovenös”)的推荐剂量,其在患有脂肪酸代谢功能障碍的患者中静脉内输注,除了2.7 g/kg脂肪酸以外,还含有约300 mg/kg鸡蛋磷脂;即用于本发明的脂质体制剂的磷脂。因此,施用脂质体用于在人患者中治疗细菌感染是安全的,并且脂质体不会引起不良事件。
可以进一步改进脂质体毒素隔绝的效率。由于在该研究中使用的脂质体大部分是多层脂质体且因此至少一半的其脂质含量对于毒素结合不可用,所以预期单层脂质体的毒素隔绝能力为至少两倍高。与从天然脂质制造的脂质体(其用于本研究中)相比,由选择合成脂质(含有统一酰基链)和额外脂质种类(例如,神经酰胺)(已知急剧增强双层脂质去混合)构成的脂质体为细菌毒素提供了更好的目标。使用磷脂酰乙醇胺的PEG衍生物,可以同样显著增加脂质体的循环时间和因此它们的功效。
脂质体的脂质表面(双层)在基于水的溶剂中自发形成,且因此将水和其他水溶性无机和有机分子(这可能在脂质体生产过程中存在)捕获在脂质体内部。本研究中使用的空脂质体是在含有水和简单的有机或无机分子(例如NaCl、KCl、MgCl2、葡萄糖、HEPES和/或CaCl2)的缓冲液中产生的脂质体。然而,在脂质体生产过程中同样可以包含复杂的有机分子(抗生素、维生素、佐剂和其他)(负载脂质体)。预期这些复杂的有机分子不会干扰脂质体的毒素隔绝特性;然而,它们将提供额外的治疗效果。
本发明进一步涉及细菌感染的治疗方法,其包括向有需要的患者施用治疗有效量的如前文所述的定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物。
同样地,本发明涉及细菌感染的预防方法,其包括向暴露于感染风险的受试者施用预防量对于预防有效的定义脂质组成的空脂质体或定义脂质组成的空脂质体的混合物。
考虑的细菌感染是呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道、心血管道或皮肤的感染,以及由产生成孔毒素和磷脂酶的细菌引起的全身性感染,例如由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、化脓性隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogene)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurgiensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、败毒梭状芽孢杆菌(Clostridium septicum)、索氏梭状芽孢杆菌(Clostridium sordellii)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、肺炎链球菌、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes) (也称为A群链球菌(GAS))、似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、猪链球菌(Streptococcus suis)、中间型链球菌(Streptococcus intermedius)或霍乱弧菌(Vibrio cholera)引起的全身性感染。
考虑的其他细菌感染为鼻咽系统、CNS系统、脑膜、阴道、骨骼(例如骨髓炎)和关节、肾脏、骨骼肌、外耳(例如外耳炎)和眼睛的感染,例如感染性结膜炎、细菌性角膜炎和内眼感染。
考虑作为用如上所述的脂质体治疗的目标的具体细菌感染是菌血症,细菌感染的皮肤病变,脑膜炎,呼吸道感染,例如肺炎,和腹腔感染,诸如腹膜炎。
考虑用于治疗或预防感染的剂量是1 mg至300 g脂质体(总脂质)/吸入/注射/输注,一次或几次/天,优选100 mg至10 g,一次至三次/天。在人中,HED(人当量剂量)是100至1000 mg/m2,优选约300 mg/m2,或约8 mg/kg。
脂质体可以作为气溶胶施用用于治疗呼吸道感染。从脂质体诸如本发明的空脂质体制备气溶胶是本领域已知的。例如,脂质体的液体悬浮液可以使用计量吸入器(MDI),即,将特定量的药物递送至呼吸道或肺的装置,以患者吸入的气溶胶化药物的短喷发的形式,进行递送。
对于皮肤的细菌感染的治疗,考虑以局部药物组合物诸如液体悬浮液等的形式应用本发明的脂质体。从脂质体诸如本发明的空脂质体制备悬浮液是本领域已知的。例如,可以将生理盐水或任何其他水溶液中制备的脂质体悬浮液直接应用至皮肤。
对于全身细菌感染的治疗,以静脉内、肌内或皮下注射的形式应用本发明的空脂质体。注射溶液通过本领域中已知的标准方法制备,例如,作为无菌生理盐水中脂质体的悬浮液。可以直接注射此类悬浮液。还考虑在可用于舌下或颊应用的制剂中应用本发明的脂质体。对于腹膜炎的治疗,考虑腹膜内应用。滴眼剂可以用于眼睛的细菌感染。
本发明的空脂质体将隔绝细菌毒素,从而防止细菌穿透宿主的上皮细胞或它们的全身性传播。因此可以避免或减缓全身性疾病的发展;且病原体可以由宿主的先天免疫系统的细胞有效清除,这同样由脂质体保护免受毒素的影响。
脂质体本身不是细胞毒性的,它们也不是杀细菌的。因此,以下是不可能的:它们将发挥选择性抗细菌压力,这将进一步导致耐药性细菌的出现。本发明的空脂质体模拟宿主细胞中已经存在的结构,以便引诱细菌毒素。因此,不可想象细菌将适应脂质体攻击:每次通过降低它们的毒素与脂质体的亲和力而逃避诱饵的尝试必然导致针对宿主细胞同样无效的毒素的出现。
基于脂质体的化疗对于抗生素治疗和用毒素隔绝抗体的治疗两者是有吸引力的替代方案。
本发明还涉及细菌感染的治疗方法,其包括在细菌感染的标准抗生素治疗之前、之后、一起或平行地向有需要的患者施用治疗有效量的空脂质体。与抗生素治疗组合,除了在感染活跃期过程中活跃分泌的细菌毒素的中和以外,脂质体治疗将通过隔绝抗生素治疗过程中由裂解细菌释放,已知有害的的病况中,例如,脑膜炎过程中,肺炎链球菌感染(急性肺炎球菌溶血素释放)和化脓性链球菌感染(链球菌溶血素O的急性释放)过程中,释放的毒素而为患者提供额外益处。
在这种组合治疗中,可以考虑空脂质体和脂质体混合物作为佐剂和相应的治疗方法作为辅助治疗。
脂质体治疗的限制是其在免疫力低下个体中的限制效率,因为细菌的清除不在于用化疗剂,而在于用宿主的自身免疫系统。然而,甚至在免疫缺陷患者中,脂质体治疗组合杀细菌化疗将是有益的:减慢全身性疾病的发展,并因此将提供为生物体提供许多所需时间,以允许抗生素展开它们的充分杀细菌潜力。
与使用根据本发明的空脂质体的治疗一起考虑的抗生素治疗是,例如,用如上列出的头孢菌素类和其他β内酰胺类抗生素、糖肽类、林可酰胺类、脂肽类、大环内酯类、青霉素类和青霉素组合、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素和氯霉素类似物、四环素类、克林霉素和叶酸抑制剂治疗。治疗中与本发明的空脂质体一起考虑的具体抗生素是碳青霉烯类,诸如亚胺培南、cilastin和美罗培南,第二代头孢菌素类诸如头孢呋辛,第三代头孢菌素类诸如头孢他啶和头孢曲松,第四代头孢菌素类诸如头孢吡肟,糖肽类诸如万古霉素,大环内酯类诸如克拉霉素,青霉素类诸如阿莫西林和flucloxacyllin,青霉素组合诸如阿莫西林/克拉维酸和哌拉西林/他唑巴坦组合,喹诺酮类诸如环丙沙星和莫西沙星,和氟喹诺酮类诸如左氧氟沙星和吉米沙星。
本发明的空脂质体的所有组分是天然存在于人的物质。因此,这些脂质体是良好耐受的,且经由生理途径从体内清除。脂质体气溶胶应当用于在季节性流感流行过程中预防一般群体的肺炎和其他呼吸道疾病。最重要地,基于脂质体气溶胶或其他脂质体应用的预防性措施将有助于医院内、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌感染和其他有利于感染性疾病传播的环境下预防MRSA肺炎或菌血症。
实施例
毒素
来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的链球菌溶血素O (SLO)、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的α溶血素、来自破伤风梭状芽孢杆菌的破伤风菌溶血素(TL)和来自产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的磷脂酶C购自Sigma。肺炎球菌溶血素获得自Kadioglu教授(Cruse G.等人, J. Immunol. 2012; 184:7108-7115)。其他毒素包括来自金黄色葡萄球菌的Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)、来自单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶血素O (LLO)、来自产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的产气荚膜溶血素(perfringolysin)O (PFO)、来自猪链球菌的猪溶血素(SLY)、来自中间型链球菌的中间型溶血素(intermedilysin)(lLY)、来自蜡状芽孢杆菌的蜡状溶血素(cereolysin)O (CLO)、来自苏云金芽孢杆菌的苏云金溶血素(thuringiolysin)O (TLO)、来自肉毒梭状芽孢杆菌的肉毒溶血素(botulinolysin)(BLY)、来自索氏梭状芽孢杆菌的索氏溶血素(sordellilysin)(SDL)、来自化脓性隐秘杆菌的化脓性溶血素(pyolysin)(PLO)。来自肺炎链球菌、化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌的培养上清液获得自K. Mühlemann教授 (Bern)和E. Gulbins教授 (Essen)。
细胞培养
如Monastyrskaya K等人, Cell Calcium.2007, 41:207-219所述维持人胚胎肾细胞系(HEK 293)。将人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)维持在含有10% FBS,2 mM L-谷氨酰胺和100U/ ml青霉素,100 μg/ ml链霉素的RPMI 1640培养基中。
转染
将CFP(青色荧光蛋白)在HEK 293细胞中瞬时表达(Monastyrskaya等人,在上述引文中)。转染后2天,表达CFP的HEK 293细胞用于激光扫描模块(LSM)成像实验。
脂质体
胆固醇(Ch) (C-8667)、来自鸡蛋黄的鞘磷脂(Sm) (S0756)、来自大豆的磷脂酰胆碱(PC) (P7443)、来自牛脑的磷脂酰乙醇胺(PE) (P9137)和来自牛脑的磷脂酰丝氨酸(PS)钠盐 (P5660)购自Sigma。将脂质以1 mg/ml浓度单独溶解在氯仿中并储存在-20℃。为了制备脂质体,将单个脂质的氯仿溶液以文本中给出的组成和比例混合,以产生常规50-500 μl最终溶液。在60℃完全蒸发氯仿20-50 min。将50 μl或100 μl含有2.5 mM CaCl2的台氏缓冲液(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM葡萄糖, 10 mM HEPES; pH=7.4)添加至含有干燥脂质的薄膜的管中,并剧烈涡旋。将脂质悬浮液在剧烈摇动的情况下在Eppendorf恒温混合器中在45℃孵育20-30 min。为了产生脂质体,将最终脂质悬浮液在Bandelin Sonopuls超声仪中以70%功率在6℃超声处理3x5秒。将脂质体制剂在6℃放置至少1小时,然后将它们用于实验中。脂质体中单个脂质的浓度总是作为重量/重量(w/w)比率给出。在含有胆固醇和鞘磷脂的脂质体中,1:1 (w/w)比率对应于50% (w/w)或66 mol%胆固醇。脂质体的量作为用于制备它们的总脂质的量给出。
在替代方法中,约25 ml各制剂通过乙醇水化和挤压法制备。将最终制剂无菌过滤,且填充在高压灭菌血清玻璃小瓶中(终浓度:40 mg/ml)。脂质体颗粒大小在80-150 nm范围内,且具有良好的PDI(多分散性指数)。还包括重量摩尔渗透压浓度测量的结果。它们都在约400 mmol/kg的范围内,这非常接近期望的生理水平。
表 1: 技术参数
毒素诱导的细胞裂解和脂质体的保护作用
在人胚肾上皮细胞(HEK 293)中,监测毒素诱导的裂解作为由于细胞内CFP的孔诱导的流出导致的细胞质荧光的下降。将接种在15 mm玻璃盖玻片上的汇合的HEK 293细胞(2.5 x 105个细胞/盖玻片)在灌注室中在25℃在含有2.5 mM CaCl2的台氏缓冲液中封固(mount),且在具有激光扫描模块LSM 510 META (Zeiss, Germany)的Axiovert 200 M显微镜中使用×63油浸镜头记录它们的荧光(Monastyrskaya等人,在上述引文中)。在时间点=0,将缓冲液换为100 μl或200 μl额外含有细胞裂解量的给定毒素(例如,120 ng来自化脓性链球菌的SLO)和20 mM/L二硫苏糖醇(DTT)的相同缓冲液。为了研究脂质体对毒素诱导的细胞裂解的保护作用,在时间点= 0,用100μl含有毒素/ DTT和各种浓度和各种脂质组成的脂质体的混合物常规攻击细胞。临添加至细胞之前制备毒素-脂质体混合物(处理延迟20至30秒)。在一些情况下,将100μl含有单独的脂质体的溶液首先添加至细胞,随后(处理延迟20至30秒)添加100 μl含有毒素的溶液。脂质体的保护作用在任一实验条件下类似。使用“生理学评价(Physiology evaluation)”软件包(Zeiss, Germany)分析图像。
在各种脂质组成的脂质体的存在或不存在的情况下评价纯化的PFTs或细菌培养上清液对人单核细胞系(THP-1)的增殖的影响。常规地,将100-600 μl含毒素溶液(Ca2+-台式缓冲液或BHI液体培养基)添加至100 μl (5 x 104个细胞)维持在培养基中的细胞,且与50-150 μl 各种脂质组成的脂质体预混合。孵育3小时后,将1-2 ml新鲜培养基添加至管中。将细胞每天或每隔一天计数,持续8-12天。实验的整个持续时间都存在毒素和脂质体。图中呈现的数据对应于第5天或第6天,此时细胞生长仍处于线性相。
“空”和“填充”脂质体的比较
将“空” Ch:Sm + 仅Sm脂质体的混合物针对金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌的培养上清液的保护作用与填充荧光染料(诸如荧光素、俄勒冈绿488、若丹明或德克萨斯红)的Ch:Sm + 仅Sm脂质体的混合物的保护作用进行比较。
将“空”Ch:PC脂质体的混合物针对金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌的培养上清液的保护作用与填充荧光染料(诸如荧光素、俄勒冈绿488、若丹明或德克萨斯红)的Ch:PC脂质体的混合物的保护作用进行比较。
脂质包被的表面的保护
测试胆固醇和鞘磷脂包被的珠粒针对金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌的培养上清液的毒素隔绝(sequestrating)活性。
对金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌诱导的菌血症的体内作用与抗生素治疗的组合。
在青霉素敏感菌株肺炎链球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSSA)诱导的菌血症的小鼠模型中测试Ch:Sm和仅Sm脂质体的2组分混合物;Ch:Sm;仅Sm和Sm:PC (1:2:2)脂质体的3组分混合物和Ch:Sm、仅Sm、Sm:PC和Ch:PC (1:1:1:1)的4组分混合物。考虑两种类型的MSSA菌株,其特征在于它们是否分泌毒素Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的能力。此外,还测试Ch:Sm和仅Sm聚乙二醇化脂质体(2% PEG或5% PEG)的2组分混合物。
实验小鼠通过腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)或鼻内(i.n.)注射约107或108 cfu/ml的细菌进行接种。
对于每种细菌菌株、每种感染途径且对于每种脂质体混合物(LP混合物),两种不同剂量(2 mg/kg或6 mg/kg)的LP混合物的静脉内注射在细菌攻击后六小时(t =6)、十二小时(t=12)、十八小时(t=18)或二十四小时(t=24)开始(在每种情况下,注射LP混合物随后或者在初始注射后12小时一次额外注射,或者在注射后4小时和12小时两次额外注射),其中有或没有青霉素治疗(30 mg/kg)。在脂质体治疗的同时开始抗生素治疗。进行两种类型的对照:未经治疗的感染和经单独的抗生素治疗(在t=6、t=12、t=18或t=24)的感染。
对于每种细菌菌株和对于每种脂质体混合物,以及对于每个剂量的脂质体和每种感染途径,存在10组动物。
组 | |
1 | 未处理(对照) |
2 | 单独的青霉素 |
3 | 在t=6的LP混合物 |
4 | 在t=6的LP混合物+青霉素 |
5 | 在t=12的LP混合物 |
6 | 在t=12的LP混合物+青霉素 |
7 | 在t=18的LP混合物 |
8 | 在t=18的LP混合物+青霉素 |
9 | 在t=24的LP混合物 |
10 | 在t=24的LP混合物+青霉素 |
在第1组中,随访该组的50%的存活率至少8天,该组的25%在细菌攻击后一小时进行安乐死,且剩余的25%在细菌攻击后6小时进行安乐死。
在血液和几种器官诸如肺、脾和肾中测定细菌计数。
读出: 存活、感染体征、代谢(体重减轻和恢复的连续测量,通过间接量热法测量的 O2消耗和CO2产生速率,用修改的Weir公式计算的静息能量消耗(REE));炎症细胞因子概况(对于血液进行针对肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2和IL-1b的ELISA)。
最小杀菌浓度(MBC)
鞘磷脂/胆固醇脂质体针对通常菌株无活性:
菌株 | MBC (mg/mL) |
ATCC 27853铜绿假单胞菌 | > 16 |
金黄色葡萄球菌 | > 16 |
762 | > 16 |
遵循临床和实验室标准研究所(CLSI)建议的准则实施最小杀菌浓度(MBC)的测试。
对于液体培养基微升稀释测试,补充50 μl 0.5-16 mg/mL脂质体的96-孔板用50µL含有1-5 x 105菌落形成单位(CFU)/mL的金黄色葡萄球菌的细菌细胞悬浮液的MuellerHinton液体培养基接种。将板在36℃孵育24小时。通过将10 µL来自孔液体培养基微量滴定稀释板的等分试样转移至Columbia血液琼脂(Oxoid, Wesel, Germany)上而测定MBC。将接种的板在36℃进一步孵育24小时,然后计数菌落。
Claims (16)
1.包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2;
或者
以下的混合物
(i) 空脂质体,其包含
(a) 鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或
(b) 磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,与
(ii) 定义脂质组成的其他空脂质体;
其中所述定义脂质组成的其他空脂质体包含脂质或磷脂,所述脂质或磷脂选自胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰胆碱;
所述空脂质体或者所述空脂质体的混合物用于治疗和预防细菌感染。
2.根据权利要求1使用的空脂质体的混合物,其中所述空脂质体的混合物包含(i)(a)含有鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分或由其组成的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,并且(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体包含鞘磷脂或由其组成。
3.根据权利要求1使用的空脂质体的混合物,其中所述空脂质体的混合物包含(i)(b)含有磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分或由其组成的空脂质体,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,并且(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体包含鞘磷脂或由其组成。
4.根据权利要求1使用的空脂质体的混合物,其中所述空脂质体的混合物包含(i)(a)含有鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分或由其组成的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,并且(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体包含:含有磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的空脂质体,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,和定义脂质组成的空脂质体,其中所述定义脂质组成由鞘磷脂组成。
5.根据权利要求1使用的空脂质体的混合物,其中所述空脂质体的混合物包含(i)(a)含有鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分或由其组成的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,并且其中(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体包含:含有磷脂酰胆碱和鞘磷脂或由其组成的空脂质体,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,定义脂质组成的空脂质体,其中所述定义脂质组成由鞘磷脂组成,和含有胆固醇和磷脂酰胆碱或由其组成的空脂质体,其中胆固醇:磷脂酰胆碱比率为5:1至1:5。
6.根据权利要求1使用的空脂质体或空脂质体的混合物,其中一些或所有脂质体用聚乙二醇修饰。
7.根据权利要求1使用的空脂质体或空脂质体的混合物,其中所述细菌感染选自菌血症,细菌感染的皮肤病变,脑膜炎和呼吸道感染。
8.包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇和任选的磷脂酰胆碱且覆盖非脂质表面的脂质双层或脂质单层,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,其用于治疗和预防细菌感染。
9.以下的混合物
(i) 空脂质体,其包含
(a) 鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或
(b) 磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,与
(ii) 定义脂质组成的其他空脂质体;
其中所述定义脂质组成的其他空脂质体包含脂质或磷脂,所述脂质或磷脂选自胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰胆碱。
10.根据权利要求9的空脂质体的混合物,其中(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体为这样的空脂质体,其中所述定义脂质组成由鞘磷脂组成。
11.根据权利要求9或10的空脂质体的混合物,其中所述空脂质体的混合物包含(i)(a)含有鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,并且(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体为包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,和定义脂质组成的空脂质体,其中所述定义脂质组成由鞘磷脂组成。
12.根据权利要求9的空脂质体的混合物,其中所述空脂质体的混合物包含(i)(a)含有鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,并且其中(ii)所述定义脂质组成的其他空脂质体为包含磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5、定义脂质组成的空脂质体,其中所述定义脂质组成由鞘磷脂组成、和包含胆固醇和磷脂酰胆碱作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:磷脂酰胆碱比率为5:1至1:5。
13.根据权利要求9的空脂质体的混合物,其中一些或所有脂质体用聚乙二醇修饰。
14.治疗有效量的包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或这样的混合物在制备用于治疗细菌感染的方法的药物中的用途,其中所述方法包括向有需要的患者施用所述治疗有效量,
所述混合物为以下的混合物
(i) 空脂质体,其包含
(a) 鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或
(b) 磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,与
(ii) 定义脂质组成的其他空脂质体;
其中所述定义脂质组成的其他空脂质体包含脂质或磷脂,所述脂质或磷脂选自胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰胆碱。
15.预防量的包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或这样的混合物在制备用于预防细菌感染的方法的药物中的用途,其中所述方法包括向暴露于感染风险的受试者施用所述预防量,
所述混合物为以下的混合物
(i) 空脂质体,其包含
(a) 鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或
(b) 磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,与
(ii) 定义脂质组成的其他空脂质体;
其中所述定义脂质组成的其他空脂质体包含脂质或磷脂,所述脂质或磷脂选自胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰胆碱。
16.治疗有效量的包含鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分的空脂质体,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或这样的混合物在制备用于治疗细菌感染的方法的药物中的用途,其中所述方法包括在针对细菌感染的标准抗生素治疗之前、之后、一起或平行地向有需要的患者施用所述治疗有效量,
所述混合物为以下的混合物
(i) 空脂质体,其包含
(a) 鞘磷脂和30% (w/w)或更多的胆固醇作为仅有的脂质成分,其中胆固醇:鞘磷脂比率为5:1至1:2,或
(b) 磷脂酰胆碱和鞘磷脂作为仅有的脂质成分,其中磷脂酰胆碱以20-60% (w/w)的量存在且磷脂酰胆碱:鞘磷脂比率为5:1至1:5,与
(ii) 定义脂质组成的其他空脂质体;
其中所述定义脂质组成的其他空脂质体包含脂质或磷脂,所述脂质或磷脂选自胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰胆碱。
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