BR112014031278B1 - uso de lipossomos vazios, mistura de lipossomos vazios, bicamadas lipídicas ou monocamadas lipídicas, bem como mistura de lipossomos vazios - Google Patents

Abstract

LIPOSSOMOS ADAPTADOS PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES BACTERIANAS. A invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios de composição lipídica definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida, e à utilização de outras bicamadas ou monocamadas de lipídios de composição lipídica definida para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas. Verificou-se que tais lipossomos, em particular, uma mistura de lipossomos de dois, e quatro componentes compreendendo colesterol e esfingomielina, lipossomos consistindo em esfingomielina, lipossomos compreendendo esfingomielina e fosfatidilcolina, e lipossomos compreendendo colesterol e fosfatidilcolina eficientemente sequestram uma variedade de toxinas secretadas por bactérias, desse modo, impedindo ligação de toxinas bacterianas com células-alvo e lise induzida por toxina das células-alvo. Misturas lipossomais injetadas intravenosamente impedem morte de camundongos de laboratório infectados com doses letais de Staphylococcus aureus ou Streptococcus pneumoniae.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios ou misturas de lipossomos, e ao uso de outras bicamadas ou monocamadas lipídicas de composição lipídica definida para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas. Da mesma forma, a invenção refere-se a um tratamento de tais infecções bacterianas, o qual compreende a administração de lipossomos vazios ou misturas de lipossomos, isolados ou em combinação com tratamento-padrão antibiótico. Além disso, a invenção refere-se a novas misturas de lipossomos como tais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Infecções bacterianas permanecem uma das principais ameaças para vidas humanas. Como resistência bacteriana até mesmo aos antibióticos mais potentes aumenta, assim também deve os esforços de identificar novas estratégias antibacterianas. Entre outros fatores de virulência, muitas bactérias patogênicas secretam toxinas que matam células eucarióticas rompendo sua membrana plasmática. Toxinas bacterianas formadoras de poros são ativas na superfície da célula, causando formação de poros e disrupção da membrana plasmática, seguido por qualquer lise ou apoptose de células-alvo hospedeiras, visto que fosfolipases bacterianas induzem a morte de células hospedeiras por degradação enzimática de fosfolipídios plasmalemáticos.

[0003] Toxinas de desestabilização de membrana bacteriana, tais como, citolisinas dependentes de colesterol, (CDCs: pneumolisina O, estreptolisina O, tetanolisina), a-hemolisina ou fosfolipases bacterianas (fosfolipase C, esfingomielinase) desempenham um papel crítico no estabelecimento e progressão de doenças infecciosas. Tais doenças são pneumonia, uma das principais causas de morte entre todos os grupos de faixas etárias e a principal causa de morte em crianças nos países de baixa renda; bacteriemia, uma grave complicação de infecções ou cirurgia, que é caracterizada pela alta mortalidade por sepse e choque séptico; e meningite, uma doença com risco de vida, ou seja, que leva a graves consequências a longo prazo, tais como, surdez, epilepsia, hidrocefalia e déficitscognitivos.

[0004] Para direcionar toxinas desestabilizantes de membrana bacteriana de células hospedeiras cada um, liga-se a lipídeos individuais de membrana (grupos-cabeça lipídicos) ou exploram a natureza não homogênea da bicamada lipídica de membrana plasmática das células eucarióticas, interagindo com microdomínios enriquecidos em certas espécies de lipídios (Gonzales MR e outros Cel.l Mol. Life Sci. 2008 65: 493-507). A distribuição não homogênea de lipídios no interior da bicamada não é favorecida por condições in vivo, uma vez que proteínas de transmembrana e a presença de um grande número de espécies de lipídios individuais com comprimentos variáveis e status de saturação de sua cadeia acila opõe separação do lipídio de mistura e desse modo, a formação de microdomínios lipídicos estáveis (Simons K. e Gerl M.J., Nat. Ver. Mol. Cell. Biol. 2010 11: 688-99). Contudo, a separação de lipídio da mistura pode ser levada a, seus extremos em lipossomos livres de proteínas artificiais, fabricados a partir de um número limitado de espécies de lipídios cuidadosamente selecionados, onde, microdomínios de lípidos estáveis prolongados podem ser criados (Klose C. e outros; J. Biol. Chem. 2010, 285:30224-32). Além disso, lipossomos artificiais permitem concentrações relativas muito maiores de um lipídio particular do que aqueles que nunca provavelmente ocorrem in vivo. Portanto, lipossomos exibindo micro-domínios lipídicos estáveis de propriedades bioquímicas definidas e possuindo altas concentrações relativas de lipídios particulares podem ser produzidos. Os lipossomos são atualmente utilizados nas indústrias cosméticas e farmacêuticas como veículos para entrega de medicação tópica e sistêmica e são considerados não tóxicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios de composição líquida definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas, em particular, lesões da pele, bacteriemia, meningite, infecções do trato respiratório, tais como pneumonia, e infecções abdominais, tal como peritonite.

[0006] A invenção, além disso, refere-se a, bicamadas lipídicas ou monocamadas lipídicas de composição lipídica definida que cobrem superfícies não lipídicas, para utilização no tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[0007] Da mesma maneira, a invenção refere-se a um tratamento de tais infecções bacterianas compreendendo administrar a um paciente com necessidade do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de lipossomos vazios de composição lipídica ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida, e a um método de prevenção de tais infecções bacterianas em um indivíduo sob risco. Além disso, a invenção refere-se a um tratamento de infecções bacterianas compreendendo administrar a um paciente com necessidade do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de lipossomos vazios de composição lipídica definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida, antes, após, juntamente ou em paralelo com um tratamento padrão de antibiótico da infecção bacteriana. Além disso, a invenção refere-se a novas misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0008] Figura 1 Lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina protegem monócitos de citolisinas dependentes de colesterol, a-hemolisina e fosfolipase C. A-D) Lipossomos (misturas p/p 1:1) contendo colesterol em combinação com PC (3), Sm (4) ou PS (5), mas não com PE (6) protegem células THP de citolisinas dependentes de colesterol: pneumolisina O (A), estreptolisina O (B), tetanolisina (C), bem como, de fosfolipase C (D). E) Lipossomos (p/p 1:1) contendo colesterol em combinação com Sm (4) mas não com PC (3), PS (5) ou PE (6) protegem células THP-1 de a-hemolisina. F) lipossomos sem colesterol (7-9) foram ineficazes. c (u.r.) = número de células, mantidas na presença de uma toxina (1, 3-9) relacionada com o número de células mantidas na ausência de uma toxina (2) é dado em unidades relativas (u. r.). PLY = pneumolisina O; SLO = estreptolisina O; TL = tetanolisina; PLC = fosfolipase C; HML = a-hemolisina. 1 = Controle (sem lipossomos); 2 = Controle (sem toxina), 3 = lipossomos Ch:PC (p/p 1:1); 4 = lipossomos Ch:Sm (p/p 1:1); 5 = lipossomos Ch:PS (p/p 1:1); 6 = lipossomos Ch:PE (p/p 1:1); 7 = PC:Sm (p/p 1:1); 8 = lipossomos Sm; 9 = lipossomos PC. Ch = colesterol; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; Sm = esfingomielina; PE = fosfatidiletanolamina.

[0009] Figura 2. Lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina (p/p 1:1) protegem monócitos de citolisinas dependentes de colesterol em quantidades de microgramas, visto que 25-100 microgramas dos lipossomos são necessárias para proteção contra a-hemolisina de Staphylococcus aureus e fosfolipase C de Clostridium perfringens. A) Proteção contra 0,2 micrograma de PLY. B) Proteção contra 0,4 micrograma de SLO. C) Proteção contra 0,2 micrograma de TL. D) Proteção contra 1,2 micrograma de HML. E) Proteção contra 4,5 microgramas de PLC.

[00010] c (u.r.) = número de células, mantido na presença de uma toxina relacionada com o número de células mantido na ausência de uma toxina, dado em unidades relativas. Eixo X: LP (mkg) = quantidade de lipossomos em microgramas. PLY = pneumolisina O; SLO = estreptolisina O; TL = tetanolisina; HML = a-hemolisina; PLC = fosfolipase C.

[00011] Figure 3. Colesterol em concentrações acima de 30% (p/p) é necessário para lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina para proteger monócitos de pneumolisina, tetanolisina ou a-hemolisina. A) Proteção contra 0,2 micrograma de PLY. B) Proteção contra 0,2 micrograma de TL. C) Proteção contra 1,2 microgramas de HML. c (u.r.) = número de células, mantidas na presença de uma toxina relacionada com o número de células mantidas na ausência de uma toxina, dado em unidades relativas. Ch (%) = percentagem de colesterol (p/p) em lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina. PLY = pneumolisina; TL = tetanolisina; HML = a- hemolisina.

[00012] Figura 4. Lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina protegem monócitos de uma combinação de citolisinas dependentes de colesterol e a-hemolisina de Staphylococcus aureus. A) lipossomos Ch:Sm (p/p 1:1) (6) efeitos exercidos totalmente protetores contra a ação combinada de a-hemolisina (HML; 1,2 micrograma), estreptolisina O (SLO; 0,4 micrograma) e tetanolisina (TL; 0,2 micrograma), visto que lipossomos Ch:PC (p/p 1:1) foram ineficazes (7).

[00013] c (u.r.) = número de células, mantidas na presença de toxinas (2-7) relacionados com o número de células de controle mantido na ausência de toxinas (1), em unidades relativas. 1 = Controle (sem toxina); 2 = SLO, sem lipossomos; 3 = TL, sem lipossomos; 4 = HML, sem lipossomos; 5 = SLO + TL + HML, sem lipossomos; 6 = SLO + TL + HML, lipossomos Ch:Sm; 7 = SLO + TL + HML, lipossomos Ch:PC. Ch = colesterol; PC = fosfatidilcolina; Sm = esfingomielina.

[00014] B) O efeito de proteção total contra a ação combinada de HML (1,2 micrograma), SLO (0,4 micrograma) e TL (0,2 micrograma) foi observado em 25 microgramas de lipossomos compostos de Ch:Sm (p/p 1:1). LP (mkg) = quantidade de lipossomos em microgramas. C) Experimentos de centrifugação confirmaram que todas as três toxinas ligam-se diretamente a lipossomos Ch:Sm (p/p 1:1). As toxinas pré-incubadas com (6) ou sem (2-5) lipossomos Ch:Sm. Após centrifugação, os sobrenadantes foram adicionados às células. 1 = Controle (sem toxina); 2 = SLO, sem lipossomos; 3 = TL, sem lipossomos; 4 = HML, sem lipossomos; 5 = SLO + TL + HML, sem lipossomos; 6 = SLO + TL + HML, lipossomos Ch:Sm.

[00015] Figura 5. Lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina (p/p 1:1) protegem monócitos de toxinas Streptococcus pyogenes. A, B) Células THP-1 proliferam-se na presença de caldo BHI (quadrados, linha tracejada em (A)). Sobrenadantes de cultura de 5 cepas de Streptococcus pyogenes (GAS = 1-5 isolados clínicos; todos crescidos em caldo BHI) efetivamente mataram células THP-1 (triângulos), entretanto, as células foram protegidas do efeito de toxinas de estreptococos por lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina (círculos). 105c = número de células x 105. t (p) = tempo após tratamento (dias). C) Lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina protegem monócitos de sobrenadantes de cultura de Streptococcus pyogenes em quantidades de microgramas. c (%) = percentagem de células, mantidas na presença de sobrenadantes bacterianos relacionadas com células mantidas na ausência dos sobrenadantes bacterianos (100%). LP (mkg) = quantidade de lipossomos em microgramas.

[00016] Figura 6. Lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina (p/p 1:1) em combinação com lipossomos apenas esfingomielina protegem completamente monócitos de toxinas de Streptococcus pneumoniae A, B) Células THP-1 proliferam-se na presença de caldo BHI (quadrados). Sobrenadantes de cultura de cepas de Streptococcus pneumoniae 2 (Pneumo = 1 isolado clínico e Pneumo 2 = cepa D39, cultivadas em caldo BHI) efetivamente mataram células THP-1 (triângulos), entretanto, as células foram parcialmente protegidas do efeito de toxinas de Streptococcus pneumoniae por lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina (p/p 1:1) (círculos). 105c = número de células x 105. t (p) = tempo após tratamento (dias). C) A mistura de lipossomos contendo colesterol e sem colesterol, lipossomos apenas esfingomielina foi totalmente protetora contra toxinas de Streptococcus pneumoniae. O gráfico mostra o efeito protetor das misturas de lipossomos compostas de quantidade constante (400 microgramas) de lipossomos de colesterol:esfingomielina (p/p 1:1) e quantidades variáveis (0 - 400 pg) de lipossomos apenas esfingomielina.

[00017] c (u.r.) = número de células, mantido na presença de um sobrenadante bacteriano relacionado com o número de células mantidas na ausência do sobrenadante, é dado em unidades relativas (u. r.). Sm LP (mkg) = quantidades de lipossomos apenas esfingomielina em microgramas.

[00018] Figura 7. Lipossomos de colesterol:fosfatidilcolina (p/p 1:1) e uma mistura de colesterol:fosfatidilcolina (p/p 1:1) e lipossomos de esfingomielina protegem monócitos de toxinas secretadas por cepa Staphylococcus aureus MRSA 2040.

[00019] Células THP-1 proliferam-se na presença de caldo BHI (quadrados). Sobrenadantes de cultura de Staphylococcus aureus (crescido em caldo BHI) eficazmente matam as células THP-1 na ausência de lipossomos (triângulos). (A) 900 microgramas (losangos) de lipossomos de colesterol: fosfatidilcolina (p/p 1:1) proporcionam proteção significativa contra toxinas bacterianas, visto que apenas proteção limitada foi observada em 600 microgramas (círculos). (B) A proteção total foi observada por uma mistura de 600 microgramas de lipossomos de colesterol: fosfatidilcolina (p/p 1:1) com 75 microgramas de lipossomos Sm (losangos). 900 microgramas de lipossomos Sm usados isolados foram ineficazes (círculos). 105c = número de células x 105. t (p) = tempo após tratamento (dias).

[00020] Figura 8. Lipossomos contendo esfingomielina sem colesterol e uma mistura de lipossomos de colesterol:fosfatidilcolina (p/p 1:1) e lipossomos apenas esfingomielina protegem monócitos de toxinas secretadas por cepa Doppelhof de Straphylococcus aureus A, B) Células THP-1 proliferam-se na presença de caldo BHI (quadrados). Sobrenadantes de cultura de Staphylococcus aureus (crescido em caldo BHI) eficazmente matam as células THP-1 na ausência de lipossomos (triângulos). (A) 1.200 microgramas (losangos) de lipossomos de esfingomielina proporcionam proteção significativa contra toxinas bacterianas. (B) Quando usados em 600 microgramas, a proteção mais potente foi observada em relação a uma mistura de esfingomielina e esfingomielina:fosfatidilcolina (p/p 1:1) (losangos), visto que lipossomos de esfingomielina isolados (círculos) e esfingomielina:fosfatidilcolina (p/p 1:1) (asteriscos) foram menos eficazes. C) Uma mistura de lipossomos apenas de esfingomielina contendo colesterol e livre de colesterol foi totalmente protetora contra toxinas secretadas pela cepa Doppelhof de Staphylococcus aureus. O gráfico mostra o efeito protetor das misturas de lipossomos compostas de quantidade constante (600 microgramas) de lipossomos de colesterol:fosfatidilcolina (p/p 1:1) e quantidades variáveis (0 - 1.200 microgramas) de lipossomos apenas de esfingomielina.

[00021] 105c = número de células x 105. t (p) = tempo após tratamento (dias). c (u. r.) = número de células, mantido na presença de um sobrenadante bacteriano relacionado com o número de células mantido na ausência do sobrenadante, é dado em unidades relativas (u. r.). Sm LP (mkg) = quantidades de lipossomos apenas de esfingomielina em microgramas.

[00022] Figura 9. Uma mistura de 4 componentes de lipossomos de colesterol:esfingomielina (p/p 1:1), apenas de esfingomielina, esfingomielina:fosfatidilcolina (p/p 1:1) e colesterol:fosfatidilcolina (p/p 1:1) protegem monócitos de toxinas secretadas tanto por cepas de Doppelhof quanto por MRSA 2040 de Staphylococcus aureus.

[00023] Células THP-1 proliferam-se na presença de caldo BHI (quadrados). Sobrenadantes de cultura de cepas MRSA 2040 (A) ou Doppelhof (B) de Staphylococcus aureus (crescidas em caldo BHI) eficazmente matam as células THP-1 na ausência de lipossomos (triângulos), entretanto, as células são completamente protegidas de qualquer toxina de MRSA 2040 (A) ou Doppelhof (B) por 1.200 microgramas da mistura lipossomal de 4 componentes (1:1;1:1).

[00024] 105c = número de células x 105. t (p) = tempo após tratamento (dias).

[00025] Figura 10. Lipossomos protegem camundongos de bacteriemia por Staphylococcus aureus, de pneumonia por Streptococcus pneumoniae e de bacteremia por Streptococcus pneumoniae. A) Camundongos de laboratório foram injetados por via intravenosa com uma dose letal da cepa de Doppelhof de Staphylococcus aureus. Em 1, 5 e 24 horas após injeção de bactérias, os camundongos foram injetados com 25-50 microlitros de solução salina normal (losangos) ou 25 microlitros (1 mg) de lipossomos de colesterol:esfingomielina (p/p 1:1) (quadrados) ou 50 microlitros (2 mg) de uma mistura 1:2:2 de lipossomos de colesterol::esfingomielina (p/p 1:1) + lipossomos apenas de esfingomielina + lipossomos de esfingomielina:fosfatidilcolina (p/p 3:1) (triângulos), B) Camundongos foram infectados por via intranasal com a cepa D39 de Streptococcus pneumoniae. 30 minutos após injeção de bactérias, os camundongos receberam uma injeção de 50 microlitros de solução salina normal (losangos) ou uma única injeção intranasal de 50 microlitros (2 mg) de uma mistura 1:1:1:1 de lipossomos de colesterol:esfingomielina (p/p 1:1) + colesterol:fosfatidilcolina (p/p 1:1) + apenas de esfingomielina + esfingomielina:fosfatidilcolina (p/p 3:1) (triângulos). C) Camundongos foram injetados por via intravenosa com uma dose letal da cepa D39 de Streptococcus pneumoniae. Em 8 e 12 horas após injeção de bactérias, por via intravenosa, os camundongos receberam 75 microlitros/injeção (3 mg) dos seguintes lipossomos: 1) uma mistura 1:1 de lipossomos de colesterol:esfingomielina (p/p 1:1) + apenas de esfingomielina (triângulos); 2) lipossomos de colesterol:esfingomielina (p/p 1:1) (quadrados); 3) lipossomos apenas de esfingomielina (círculos) ou 4) solução salina normal (losangos).

[00026] S (%) = percentagem de camundongos sobreviventes. t (d) = tempo após infecção (dias).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00027] Projetados para possuir maiores afinidades in vivo a toxinas com direcionamento a membranas, lipossomos vazios inalados ou injetados intravenosamente ou infundidos e misturas de lipossomos servem como armadilhas para toxinas bacterianas que residem no sangue e nas vias aéreas de pacientes infectados, preparando caminho para uma nova terapia sequestrante de toxina antibacteriana.

[00028] A invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios de composição lipídica definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas, em particular, bacteriemia, meningite, infecções bacterianas da pele, infecções do trato respiratório, tais como, pneumonia, e infecções abdominais, tal como peritonite.

[00029] Lipossomos da invenção são lipossomos vazios, isto é, lipossomos que não encapsulam qualquer antibiótico ou outro fármaco. Os lipossomos, se desejados, podem ser usados em combinação com fármacos que transportam lipossomos conhecidos ou novos.

[00030] O presente estudo mostra que lipossomos artificiais de composição lipídica precisamente definida ou misturas de lipossomos de composição lipídica precisamente definida eficazmente sequestram toxinas formadoras de poros e fosfolipase C, evitando desse modo, sua ligação com as células-alvo. Consequentemente, a aplicação de lipossomos ou suas misturas impede a lise de células epiteliais cultivadas e monócitos induzidos pela aplicação de toxinas purificadas ou sobrenadantes de cultura de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus e protege camundongos de laboratório de morte devido a uma bacteriemia ou pneumonia induzida experimentalmente.

[00031] A invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios de composição lipídica definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00032] A invenção, além disso, refere-se a bicamadas de lipídios ou monocamadas de lipídios de composição lipídica definida que cobre superfícies não lipídicas, para utilização no tratamento e prevenção de infecções bacterianas. Superfícies não lipídicas consideradas são, por exemplo, aparelhos médicos, contas biodegradáveis e nanopartículas.

[00033] Lipossomos considerados são lipossomos artificiais de 20 nm a 10 pm, preferencialmente, de 20 a 500 nm, compreendendo lipídios ou fosfolipídios selecionados do grupo de esteróis, esfingolipídios e glicerol-lipídios, em particular, selecionados do grupo que consiste em colesterol, esfingomielinas, ceramidas fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, diacilgliceróis, e ácidos fosfatídicos que contêm um (liso) ou dois (diacil), ácidos graxos saturados ou insaturados mais de 4 átomos de carbono e até 28 átomos de carbono.

[00034] A composição de bicamadas lipídicas ou monocamadas lipídicas considerada é a mesma conforme indicada para lipossomos.

[00035] Ácidos graxos compreendendo entre 4 e 28 átomos de carbono são, por exemplo, ácidos alcanocarboxílicos saturados lineares, preferencialmente, com um mesmo número de átomos de carbono, tais como, entre 12 e 26 átomos de carbono, por exemplo, ácidos láuricos, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, ou beênico, ou ácidos alcanocarboxílicos insaturados lineares, de preferência, com um mesmo número de, entre 12 e 26 átomos de carbono e um, dois ou mais, de preferência, até seis ligações duplas em configuração trans ou, preferencialmente cis, por exemplo, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linoleico, ácido araquidônico, ácido erúcico.

[00036] Lipossomos vazios significam que os lipossomos considerados na presente invenção não incorporam antibióticos ou outros fármacos. "Incorporado", como usado neste relatório significa encapsulado na cavidade do lipossomo, dentro da camada dupla potencial do lipossomo, ou como parte da camada de membrana do lipossomo. Os lipossomos conforme utilizados neste relatório também excluem lipossomos modificados com agentes de ligação tais como, anticorpos e monoligossacarídeos e oligossacarídeos, por exemplo, como em glicolipídios. Contudo, lipossomos modificados com polietileno-glicol (PEG) são considerados como parte desta invenção. Sabe-se que PEG modifica o tempo de circulação de lipossomos.

[00037] Em particular, a invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios compreendendo colesterol e esfingomielina, e de misturas de lipossomos vazios compreendendo colesterol e esfingomielina, ou fosfatidilcolina e esfingomielina, com outros lipossomos vazios de composição lipídica definida, tais como, lipossomos compreendendo lipídios ou fosfolipídios selecionados do grupo que consiste em esteróis, esfingolipídios e glicerolipídios, em particular, selecionado do grupo que consiste em colesterol, esfingomielinas, ceramidas, fosfatidil-colinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, diacilgliceróis, e ácidos fosfatídicos, contendo um ou dois ácidos graxos saturados ou insaturados, mais de 4 átomos de carbono e até 28 átomos de carbono, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00038] Em uma modalidade, a invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios compreendendo esfingomielina e 30% (p/p) ou mais de colesterol, e de misturas de lipossomos vazios compreendendo esfingomielina e 30% (p/p) ou mais de colesterol com outros lipossomos vazios conforme definidos neste relatório, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas. Em particular, a invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios consistindo em esfingomielina e de 30% (p/p) ou mais de colesterol, e de misturas de lipossomos vazios consistindo em esfingomielina e de 30% (p/p) ou mais de colesterol com outros lipossomos vazios conforme definidos neste relatório, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas. Mais particularmente, a invenção refere-se à utilização de lipossomos vazios consistindo em esfingomielina e de, entre 35% e 65% (p/p) de colesterol, preferencialmente, entre 40% e 55% (p/p) de colesterol, em particular, entre 45 % e 55% (p/p) de colesterol, tal como, em torno de 50% (p/p) de colesterol, e de misturas de lipossomos vazios consistindo emem esfingomielina e de, entre 35% e 65%, ou 40% e 55%, ou de 45% e 55%, por exemplo, em torno de 50% (p/p) de colesterol com outros lipossomos vazios como definidos neste relatório, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00039] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à utilização de uma mistura lipossômica de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e esfingomielina, com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00040] Em outra modalidade, a invenção refere-se à utilização de uma mistura lipossômica de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina com outros lipossomos vazios conforme definidos neste relatório, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas. Em particular, a invenção refere- se à utilização de uma mistura lipossômica de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00041] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se à utilização de uma mistura lipossômica de três componentes de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina, e com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00042] Em ainda outra modalidade particular, a invenção refere-se à utilização de uma mistura de lipossomos de quatro componentes de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina, com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina, e com lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e fosfatidilcolina, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00043] A composição particular de bicamadas lipídicas ou monocamadas lipídicas considerada é a mesma conforme indicada por lipossomos, preferencialmente, compreendendo colesterol e esfingomielina, e opcionalmente, fosfatidilcolina.

[00044] Deve-se entender que os lipossomos vazios conforme definidos acima, as misturas de lipossomos vazios conforme definidas acima, e as bicamadas lipídicas ou monocamadas lipídicas podem ser usadas juntamente com compostos adicionais. Por exemplo, é possível adicionar componentes para preparar composições farmacêuticas padrão. É também considerado adicionar fármacos ou compostos similares a fármacos, ou adicionar lipossomos adicionais incorporando fármacos ou compostos similares a fármacos no interior do lipossomo.

[00045] Fármacos considerados são, em particular, antibióticos. Tais antibióticos são, por exemplo, carbapenemos, tais como, imipenemo/cilastatina, meropenemo, ertapenemo, e doripenemo; cefalosporinas de 1a geração, tais como cefadroxila e cefalexina; cefalosporinas de 2a geração, tais como, cefuroxima, cefaclor e cefprozila; cefalosporinas de 3a geração, tais como ceftazidima, ceftriaxona, cefixima, cefdinir, cefditoreno, cefotaxima, cefpodoxima, e ceftibuteno, cefalosporinas de 4a geração, tal como cefepima; cefalosporinas de 5a geração, tais como fosamil ceftarolina e ceftobiprol; glicopeptídeos, tais como vancomicina, teicoplanina, e telavancina; macrolídeos, tais como claritromicina, azitromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina e espiramicina; penicilinas, tais como amoxicilina, flucloxacilina, oxacilina, carbeniclina e piperacilina; combinações de penicilina, tais como amoxicilina/clavulanato, piperacilina/tazobactama, ampicilina/sulbactama e ticarcilina/clavulanato; quinolonas, tais como ciprofloxacina (por exemplo, ciprofloxacina lipossômica de Aradigm) e moxifloxacina; fármacos contra micobactérias, tais como rifampicina (rifampicina nos EU), clofazimina, dapsona, capreomicina, cicloserina, etambutol, etionamida, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifapentina, e estreptomicina; outros antibióticos, tais como metronidazol, arsfenamina, cloranfenicol, fosfomicina, ácido fusídico, linezolida, mupirocina, platensimicina, quinupristina/dalfopristina, rifaximina, tianfenicol, tigeciclina e tinidazol; aminoglicosídeos, tais como amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina (por exemplo, tobramicina de fluidossomos de AxentisTM) e paromomicina; sulfonamidas, tais como, mafenida, sulfonamidocrisoidina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfadiazina de prata, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilamida, sulfassalazina, sulfisoxazol, trimetoprima e sulfametoxazol-trimetoprima (co- trimoxazol, TMP-SMX); tetraciclinas, tais como, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, e tetraciclina; lincosamidas, tais como, clindamicina e lincomicina; e lipopeptídeos, tais como daptomicina.

[00046] Fármacos adicionais considerados são agentes anticancerosos, por exemplo, sulfato de vincristina, vincristina, citarabina, daunorrubicina e doxorrubicina.

[00047] Ainda outros fármacos considerados são fármacos antiinflamatórios, por exemplo, corticosteroides (glicocorticoides), tais como, hidrocortisona (cortisol), cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, triancinolona, beclometasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA), aldosterona, budesonida, desonida, e fluocinonida; fármacos antiinflamatórios não-esteroidais, por exemplo, salicilatos, tais como, aspirina (ácido acetilsalicílico), diflunisal, e salsalato; derivados de ácido propiônico, tais como, ibuprofeno, dexibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, cetoprofeno, dexcetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, e loxoprofeno; derivados de ácido acético, tais como, indometacina, tolmetina, sulindac, etodolac, cetorolac, diclofenac, e nabumetona; derivados de ácidos enólicos (oxicamos), tais como, piroxicamo, meloxicamo, tenoxicamo, droxicamo, lornoxicamo, e isoxicamo; derivados de ácido fenâmico (fenamatos), tais como, ácido mefenâmico, ácido meclofenâmico, ácido flufenâmico e ácido tolfenâmico; inibidores seletivos de COX-2 (coxibs), tal como, celecoxib; e outros, tal como licofelona.

[00048] Fármacos adicionais considerados são vasopressores e vasoconstritor, por exemplo, vasopressina, oximetazolina, fenilefrina, propilexedrina, pseudoefedrina, epinefrina, norepinefrina, dopamina e anti-histamínicos.

[00049] Também considerados são outros tipos de fármacos, por exemplo, paracetamol (analgésico), anfotericina B (contra infecções fúngicas), bupivacaína (controle da dor pós-cirúrgica), vacinas contra hepatite A, influenza, tétano, MRSA evasivo, coqueluche, difteria, meningococo, cólera, febre tifoide, antraz, pneumococo (por exemplo, Prevenar 13®), e outras vacinas antibacterianos, morfina (analgésico), verteporfina (doenças oftalmológicas), estradiol (distúrbios da menopausa), compostos Aganocide®, por exemplo, auricloseno (NVC- 422, N,N-dicloro-2,2-dimetiltaurina (antibacterianos), partículas de lipossomas de M. Bio. Technology’s compreendendo antígenos bacterianos lipídicos específicos, por exemplo, partículas mímicas de bactéria como vacinas (infecções por micoplasma, incluindo, pneumonia), e bacteriófagos.

[00050] Fármacos adicionais considerados são antitoxinas, por exemplo, antitoxina tetânica, tais como imunoglobulina antitetânica, nanoesponjas, nanopartículas poliméricas, núcleo de nanopartículas biomiméticas circundada por membranas de células hospedeiras (tais como, membranas de glóbulos vermelhos), anticorpos monoclonais direcionando a toxina e fragmentos de anticorpos, compostos naturais inibidores de produções de toxina específica, inibidores do sistema de secreção da toxina bacteriana, tais como, inibidores de T3SS, proteínas de fusão do tipo mucina de ligação a toxinas, receptores de células T solúveis que atuam como armadilha para neutralizar toxinas, e peptídeos que inibem o processamento de toxinas.

[00051] Além disso, a invenção refere-se a novas misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida. Em particular, a invenção refere-se a, misturas de lipossomos vazios compreendendo colesterol e esfingomielina, ou fosfatidilcolina e esfingomielina, com outros lipossomos vazios de composição lipídica definida, tais como lipossomos compreendendo lipídios ou fosfolipídios selecionados do grupo de esteróis, esfingolipídios e glicerol-lipídios, em particular, selecionados do grupo que consiste em colesterol, esfingomielinas, ceramidas, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, diacilgliceróis e ácidos fosfatidícos contendo um ou dois ácidos graxos saturados ou insaturados maiores que 4 átomos de carbono e até 28 átomos de carbono, para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas.

[00052] Misturas particulares consideradas são misturas de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina e colesterol com outros lipossomos vazios conforme definidos neste relatório, tais como misturas de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e esfingomielina, com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina.

[00053] Outras misturas particulares consideradas são misturas de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina com outros lipossomos vazios conforme definidos neste relatório, tais como misturas de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina.

[00054] Outras misturas particulares consideradas são misturas lipossômicas de três componentes de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina, e com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina.

[00055] Misturas particulares adicionais consideradas são misturas lipossômicas de quatro componentes de lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina, com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina, e com lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e fosfatidilcolina.

[00056] Dentre os lipossomos, os componentes poderão estar presentes em diferentes quantidades, dependendo da tendência de se formar lipossomos, da estabilidade dos lipossomos de diferentes composições e o uso pretendido. Exemplos são lipossomos que consistem de dois componentes em aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 ou 5:1 (peso por peso) da composição. Componentes adicionais podem ser misturados em quantidades de, aproximadamente, 10, 20 ou 25% (p/p).

[00057] Nos lipossomos preferidos da invenção colesterol está presente em uma quantidade de 30 - 70%, preferencialmente, 40-60%, por exemplo, 45-55%, em particular, em torno de 50% (p/p), fosfatidilcolina está presente em uma quantidade de 10-60%, preferencialmente, de 20-60%, preferencialmente, de 40-60%, por exemplo, de 45-55%, mais preferencialmente, em torno de 50% (p/p); e esfingomielina está presente em uma quantidade de 10-100%, preferencialmente, de 20-60% ou 100%, de preferência, de 40-60%, por exemplo, 45-55%, mais preferencialmente, em torno de 50% (p/p) ou 100%, a razão de colesterol:esfingomielina situa-se entre 5:1 e 1:2, preferencialmente, de 2:1 e 1:2, em particular, em torno de 1:1 (p/p), e a razão de colesterol:fosfatidilcolina ou fosfatidilcolina:esfingomielina situa-se entre 5:1 e 1:5, preferencialmente, entre 2:1 e 1:2, em particular, em torno de 1:1 (p/p).

[00058] Nas misturas lipossomais individuais componentes de lipossomos com diferentes composições são misturados em proporções definidas por necessidades de tratamento. Exemplos são aproximadamente 1:1, 2:1, ou 3:1 (p/p) de misturas de 2 componentes; aproximadamente 1:1: 1,2:1:1 ou 2:2:1 (p/p) de misturas de 3 componentes; e aproximadamente 1:1:1:1, 2:1:1:1, 2:2:1:1 ou 2:2:2:1 (p/p) de misturas de 4 componentes.

[00059] Os lipossomos considerados consistem de uma ou mais bicamadas de fosfolípidios. Preferem-se vesículas unilamelares grandes (LUVs) e vesículas multilamelares (MLVs). Mais preferidos são, vesículas unilamelares pequenas (SUVs).

[00060] Os lipossomos são fabricados de acordo com métodos de extrusão ou sonicação ou microfluidização (por exemplo, homogeneização sob alta pressão) conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, os lipídios são misturados em um solvente orgânico, tal como, clorofórmio. Clorofórmio é evaporado e a película seca de lipídio é hidratada em uma solução aquosa, tal como, solução salina normal (NaCl a 0,9%) solução de Krebs, ou solução de Tyrode e adicionalmente sonicada para produzir lipossomos. Se necessário, o tamanho dos lipossomos pode ser controlado por meio de sua extrusão através de filtros de membrana de diâmetro de poros fixo. Lipossomos individualmente produzidos de diferentes composições de lipídios são misturados nas proporções necessárias imediatamente antes de aplicação.

[00061] As células epiteliais constituem a barreira física para agentes patogênicos. Lipossomos artificiais são capazes de proteger células epiteliais de rim embrionário humano (HEK 293) a partir de lise induzida por estreptolisina O (SLO). Os poros SLO formados na membrana plasmática são grandes o suficiente para causar um efluxo de proteínas citoplasmáticas com Mr até 100 kDa. A ligação direta de lipossomos contendo colesterol foi confirmada por pré-incubação dos lipossomos com a toxina seguida por centrifugação. Após centrifugação, os lipossomos, recuperados no pellet, foram descartados e os sobrenadantes livres de lipossomos foram adicionados às células. Os sobrenadantes não infligem qualquer dano nas células expostas, sugerindo que a toxina fosse eficientemente removida a partir da solução, devido sua ligação aos lipossomos.

[00062] Lipossomos protegeram não apenas células epiteliais, mas também, células do sistema imune inato contra uma variedade de toxinas formadoras de poros (PFTs). Os efeitos de PFTs na proliferação linhagem de células monocíticas humana THP-1 foram avaliados na presença ou ausência de lipossomos de várias composições de lipídios. Proliferação de células THP-1 foi completamente inibida na presença de 200 ng de pneumolisina (PLY), 400 ng de estreptolisina O (SLO), 200 ng de tetanolisina (TL), 1,2 pg de a-hemolisina (LMH) de S. aureus, ou 4,5 microgramas de fosfolipase C de Clostridium perfringens. Conforme mostrado na Figura 1 AD, lipossomos contendo colesterol em combinação (p/p 1:1) com qualquer fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (Sm) ou fosfatidilserina (PS), mas não com fosfatidiletanolamina (PE) protegeram células THP-1 de citolisinas dependente de colesterol (PLY, SLO, TL) ou fosfolipase C (PLC), visto que lipossomos, os quais não continham nenhum colesterol, foram ineficazes (Fig. 1F).

[00063] Em contraste, lipossomos Ch:PC (1:1 p/p) e lipossomos Ch:PS (1:1 p/p) exibiram nenhum efeito protetor contra a-hemolisina de S. aureus, a qual pertence ao grupo de toxinas formadoras de pequenos poros (Fig. 1 E). Os lipossomas, que continham nenhum colesterol, foram também ineficazes (Figura 1F). Entretanto, lipossomos contendo Ch:Sm (1:1 p/p) foram capazes de exercer um efeito totalmente protetor contra a-hemolisina (Fig. 1 E). Desse modo, apenas lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina foram capazes de proteger células THP-1 a partir de qualquer uma das toxinas testadas.

[00064] Figura 2 mostra que o efeito protetor total de lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p) contra 200 ng de PLY foi observado em 3 pg;. contra 400 ng de SLO em 1,5 pg; contra 200 ng de TL em 3 pg; contra 1,2 pg de HML em 25-50 pg, e contra 4,5 pg de PLC a 100 pg.

[00065] Figura 3 demonstra que colesterol em concentrações iguais ou superiores a 30% (p/p) foi exigido de lipossomos Ch:Sm proteger monócitos de PLY, TL ou HML. A proteção máxima foi observada em 50% (p/p) de colesterol que corresponde a 66% moles de colesterol.

[00066] Uma vez que lipossomos compostos de colesterol e esfingomielina foram capazes de proteger as células de citolisinas dependentes de colesterol ou de a-hemolisinae, foi investigado se esses lipossomos foram eficazes contra uma combinação de tanto ambas as classes de toxina. De fato, 25 pg de lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p) exerceram efeitos totalmente protetores contra a ação combinada de a-hemolisina (1,2 pg), SLO (400 ng) e TL (200 ng), visto que lipossomos compostos de Ch:PC (1:1 p/p) não apresentaram nenhum efeito (Fig. 4 A, B). Experimentos de centrifugação confirmam que todas as três toxinas ligam-se diretamente a lipossomos Ch:Sm (Fig. 4C).

[00067] Lipossomos Ch:Sm são capazes de proteger células cultivadas a partir do palete inteiro de toxinas secretadas por cepas de patógenos bacterianos clinicamente relevantes. Avaliou-se a proliferação de células THP-1 na presença das concentrações líticas dos sobrenadantes de cultura bacteriana e na presença ou ausência de lipossomos.

[00068] Conforme mostrado na Fig. 5A, B, lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p) protegeram as células do efeito de toxinas secretadas por Streptococcus pyogenes. O efeito protetor total contra toxina(s) de Streptococcus pyogenes toxina (s) foi observado em quantidades de microgramas dos lipossomos (Fig. 5 C). Essas quantidades são similares àquelas exigidas para neutralização de concentrações líticas de citolisinas dependentes de colesterol purificadas, mas são muito mais baixas do que àquelas exigidas para a neutralização de a- hemolisina purificada ou fosfolipase C purificada (Fig. 2), sugerindo que citolisinas dependentes de colesterol são unicamente responsáveis pela ação citolítica de Streptococcus pyogenes.

[00069] Lipossomos Ch:Sm também protegeram as células do efeito de toxinas secretadas por Streptococcus pneumoniae (Fig. 6 AC). Visto que apenas proteção limitada foi obtida com lipossomos contendo colesterol (1:1 p/p) (Fig. 6 A-C), a mistura de lipossomos contendo colesterol (400 pg) e livre de colesterol, lipossomos apenas de Sm (400 pg) foi totalmente protetora contra este agente patogênico (Fig. 6 C).

[00070] Staphylococcus aureus é notório por sua resistência aos antibióticos mais potentes. O lipossomo de sequestro de toxina proporciona proteção até mesmo contra este agente patogênico. Lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p) mostraram apenas proteção limitada contra toxinas secretadas pela cepa resistente à meticilina de Staphylococcus aureus (MRSA-2040). Resultados similares foram obtidos para lipossomos Ch:PC (1:1 p/p): tão alto quanto 900 pg de lipossomos Ch:PC foram necessários para obter proteção significativa, visto que 600 pg desses lipossomos mostraram apenas ligeiro efeito (Fig. 7A). Entretanto, a análise detalhada de diferentes misturas lipossomais demonstrou que adição de menos de 75 pg de lipossomos apenas de esfingomielina a 600 pg de lipossomos Ch:PC (1:1 p/p) obteve proteção total contra este patógeno (Fig. 7 B). Lipossomos Sm isolado ou lipossomos PC isolado não apresentaram efeito protetor em quantidades tão altas quanto 900 pg (Fig. 7 B).

[00071] O tratamento lipossomal foi também eficiente contra uma cepa "Doppelhof" de Staphylococcus aureus clinicamente relevante, isolada a partir de um paciente séptico. Nem lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p), nem lipossomos Ch:PC (1:1 p/p) nem sua combinação com lipossomos apenas de Sm foram eficazes quando usados em concentrações que foram protetoras contra cepa MRSA 2040. Contudo, uma análise detalhada da ação protetora de várias composições de lipossomos e suas combinações demonstraram que - em contraste com cepa MRSA 2040 - as toxinas citolíticas secretadas pela cepa Doppelhof foram eficientemente sequestradas por lipossomos apenas de Sm (Fig. 8 A). Visto que, 1.200 pg de lipossomos Sm isolados mostrou proteção significativa contra a cepa Doppelhof, em concentrações mais baixas que a mistura contendo lipossomos Sm e lipossomos Sm: PC foi mais potente do que as mesmas quantidades de lipossomos Sm ou lipossomos SM:PC (Fig. 8 B). A mistura de lipossomos contendo colesterol (1:1 p/p; 600 pg) e livre de colesterol, lipossomos apenas de esfingomielina (1.200 pg) foi totalmente protetora contra toxinas secretadas pela cepa Doppelhof de Staphylococcus aureus (Fig. 8 C).

[00072] Desse modo, não apenas Staphylococcus aureus ou Streptococcus pneumoniae secretam múltiplas toxinas citolíticas, mas também as quantidades relativas de toxinas secretadas variam significativamente entre diferentes cepas que necessitam da utilização de misturas lipossomais complexas para obter alta afinidade de ligação com toxina para sua plena neutralização. Entretanto, devido à seletividade não ideal das interações de lipossomos a toxina, proteção parcial significativa pode ser já alcançada com lipossomos únicos, contanto que sua concentração seja alta o suficiente para promover sua baixa afinidade de ligação com toxina.

[00073] Análise detalhada de diferentes misturas lipossomais demonstrou que 1.200 pg (lipídios totais) de uma mistura 1:1:1:1 de lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p) + lipossomos Ch:PC (1:1 p/p) + lipossomos apenas de Sm + Sm:PC (1:1 p/p), foram necessários para proteção contra tanto cepa MRSA 2040 quanto cepa Doppelhof de Staphylococcus aureus (Fig. 9). De importância, devido à presença de lipossomos contendo colesterol, a mistura de 4-componentes também protege contra toxinas Streptococcal (ver, Figs. 1-5). Desse modo, a mistura lipossomal de quatro componentes (1.200 pg de lipídio total) é capaz de proteger células cultivadas a partir de uma ação combinada de toxinas estreptococas e estafilococas. A mistura de dois componentes consistindo em lipossomos contendo colesterol (50% p/p de colesterol) e lipossomos apenas de esfingomielina apresentou também ação protetora contra todos os sobrenadantes bacterianos testados (Figuras 6-8), contudo, quantidade ligeiramente superior (1.800 pg de lipídio total) dessa mistura foi necessária para a proteção total contra toxinas secretadas pela cepa Doppelhof de Staphylococcus aureus (Fig. 8 C).

[00074] As espécies bacterianas testadas (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes) são conhecidas por induzir ou contribuir para o desenvolvimento de condições que ameaçam a vida, tal como bacteriemia. A mistura de três ou quatro componentes de lipossomos preferidos é capaz de proteger camundongos de laboratório de bacteriemia ou pneumonia induzida experimentalmente.

[00075] Os camundongos foram injetados por via intravenosa com uma dose letal de cepa Doppelhof de Staphylococcus aureus, um isolado clínico de um paciente séptico. Em 1; 5 e 24 horas após injeção de bactérias, os camundongos foram injetados intravenosamente com solução salina normal (controle), com 1 mg/injeção de lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p), ou com 2 mg/injeção de uma mistura 1:2:2 de lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p); lipossomos apenas de Sm e Sm:PC (1:1 p/p). Camundongos sem controle sobreviveram além do 7° dia com 90% dos óbitos ocorridos no prazo de 36 horas (Fig. 10 A). Camundongos tratados com lipossomos de colesterol- esfingomielina sobreviveram 2-3 dias a mais do que aqueles de controle, mas não se recuperaram após bacteriemia. Contudo, o tratamento com os lipossomos da mistura de 3 componentes resultou na recuperação completa de 6 de 8 camundongos.

[00076] No modelo de pneumonia pneumocócica, camundongos foram infectados por via intranasal com a cepa D39 de S. pneumoniae. 30 minutos após injeção de bactérias, os camundongos receberam uma única injeção intranasal de 2 mg de uma mistura 1:1:1:1 de lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p) + lipossomos Ch:PC (1:1 p/p) + lipossomos apenas de Sm + lipossomos Sm:PC (3:1 p/p). Fig. 10 B mostra que a mistura lipossomal proporcionou proteção contra pneumonia.

[00077] No modelo de bacteriemia pneumocócica, camundongos foram injetados por via intravenosa com uma dose letal da cepa D39 de S. pneumoniae. Em 8 e 12 horas após injeção de bactérias, os camundongos receberam intravenosamente 3 mg/injeção dos seguintes lipossomos: 1) uma mistura 1:1 de lipossomos CH:Sm (1:1 p/p) + lipossomos apenas de Sm; 2) lipossomos Ch:Sm (1:1 p/p); 3) lipossomos apenas de Sm ou 4) solução salina normal. Fig. 10 C mostra que nenhum camundongo de controle ou apenas de Sm sobreviveu além de 32 horas. Entretanto, 6 de 8 ratos que receberam mistura lipossomal de Ch:Sm + apenas de Sm e 3 de 8 camundongos que receberam lipossomos Ch:Sm estavam ainda vivos após 56 horas de bacteriemia.

[00078] As doses de lipossomos (50-150 mg/kg) necessárias para a proteção de camundongos contra bacteriemia por estafilococos são conhecidas por serem não tóxicas quando utilizadas como veículos para transferência intravenosa de antibióticos em ratos (400 mg/kg; Bakker-Woudenberg I.A.J.M. e outros, Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia (Antimicrobial Agents and Chemotherapy), 2001, 45: 1487-1492). Além disso, as doses recomendadas de emulsões de lipídios (por exemplo, "Intralipid',"Lipovenos"), que são infundidos intravenosamente em pacientes que sofrem de disfunções no metabolismo de ácido graxo, contêm além de 2,7 g/kg de ácidos graxos, aproximadamente 300 mg/kg de fosfolipídios do ovo; isto é, os fosfolipídios utilizados nas preparações de lipossomos do presente invenção. Desse modo, é seguro administrar lipossomos para o tratamento de infecções bacterianas em pacientes humanos, e lipossomos não elicitará efeitos adversos.

[00079] A eficiência de sequestro lipossomal de toxina pode ser adicionalmente aperfeiçoada. Uma vez que os lipossomos usados neste estudo foram principalmente lipossomos multilamelares e, portanto, pelo menos, metade de seu teor de lipídios estava indisponível para ligação com toxina, a capacidade sequestrante de toxina de lipossomos unilamelares é prevista ser de pelo menos duas vezes tão alta. Lipossomos compostos de lipídios sintéticos selecionados, contendo cadeias de acila uniformes, e espécies de lipídios adicionais (por exemplo, ceramida), conhecidos por melhorar drasticamente bicamadas de mistura lipídica, proporcionar um melhor alvo para toxinas bacterianas do que os lipossomos fabricados a partir de lipídios naturais, os quais foram utilizados neste estudo. Usando derivados de PEG de fosfatidiletanolamina, o tempo de circulação dos lipossomos e assim sua eficácia pode ser do mesmo modo significativamente aumentada.

[00080] A superfície de lipídios (bicamada) de lipossomos forma espontaneamente em solventes à base de água e, portanto, captura água e outras moléculas inorgânicas e orgânicas solúveis em água, as quais podem estar presentes durante a produção de lipossomos, no interior do lipossomo. Os lipossomos vazios, utilizados no presente estudo, são lipossomos produzidos em tampões contendo água e moléculas orgânicas ou inorgânicas simples (por exemplo, NaCl, KCl, MgCl2, glicose, HEPES, e/ou CaCl2). Contudo, as moléculas orgânicas complexas (antibióticos, vitaminas, adjuvantes, e outras) podem da mesma forma ser incluídas durante produção de lipossomos (lipossomos carregados). Essas moléculas orgânicas complexas não se espera que interfira com as propriedades sequestrante de toxina dos lipossomos; entretanto, poderão proporcionar efeitos terapêuticos adicionais.

[00081] A invenção adicionalmente refere-se a um tratamento de infecções bacterianas compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de lipossomos vazios de composição lipídica definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida eficaz para proteção.

[00082] Da mesma maneira, a invenção refere-se à prevenção de infecções bacterianas compreendendo administrar a um indivíduo exposto ao risco de infecção, uma quantidade preventiva de lipossomos vazios de composição lipídica definida ou misturas de lipossomos vazios de composição lipídica definida eficaz para proteção.

[00083] Infecções bacterianas consideradas são infecções do trato respiratório, trato gastrointestinal, trato urogenital, trato cardiovascular, ou da pele, bem como infecções sistêmicas causadas por bactérias que produzem toxinas formadoras de poros e fosfolipases, por exemplo, causadas por Aeromonas hydrophila, Arcanobacterium pyogenic, Bacillus thurgiensis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (incluindo, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes(também conhecida como Streptococcus Grupo A (GAS), Streptococcus equisimilis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus suis, Streptococcus intermedius ou Vibrio cholera.

[00084] Infecções bacterianas adicionais consideradas são infecções do sistema nasofaringe, sistema do SNC, membranas meníngeas, vagina, ossos (por exemplo, osteomielite) e articulações, rins, músculos esqueléticos, ouvido externo (por exemplo, otite externa), e olhos, por exemplo, conjuntivite infecciosa, ceratite bacteriana e infecções intraoculares.

[00085] Infecções bacterianas particulares consideradas como alvo para um tratamento com os lipossomos conforme descritos acima são bacteriemia, lesões de pele infectadas por bactérias, meningite, infecções do trato respiratório, por exemplo, pneumonia, e infecções abdominais, tal como peritonite.

[00086] Dosagens consideradas para o tratamento ou prevenção de infecções são: de 1 mg a 300 g de lipossomos (lipídio total) por inalação/injeção/infusão uma vez ou várias vezes por dia, de preferência, de 100 mg a 10 g uma a três vezes por dia. Uma dose HED (dose equivalente humana) é entre 100 e 1.000 mg/m2, preferencialmente, cerca de 300 mg/m2, ou cerca de 8 mg/kg em seres humanos.

[00087] Lipossomos podem ser administrados como aerossol para o tratamento de infecções do trato respiratório. A preparação de aerossóis de lipossomos, tais como, os lipossomas vazios da invenção, é conhecida no estado da técnica. Por exemplo, a suspensão líquida de lipossomos pode ser transferida com um inalador de dose medida (MDI), isto é, um dispositivo que transfere uma quantidade específica de medicamento para as vias aéreas ou pulmões, na forma de uma breve rajada de medicamento aerossolizado que é inalado pelo paciente.

[00088] Para o tratamento de infecções bacterianas da pele, aplicação dos lipossomos da invenção é considerada na forma de composições farmacêuticas tópicas, tais como suspensões líquidas, e similares. A preparação de uma suspensão de lipossomos tais como, os lipossomos vazios da invenção, é conhecida no estado da técnica. Por exemplo, a suspensão de lipossomo preparada em solução salina normal ou qualquer outra solução aquosa pode ser aplicada diretamente à pele.

[00089] Para o tratamento de infecções bacterianas sistêmicas, lipossomos vazios da invenção são aplicados na forma de injeções intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Soluções para injeção são preparadas por meio de métodos padrão conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como suspensões dos lipossomos em solução salina normal estéril. Tais suspensões podem ser diretamente injetadas. É também considerado aplicar os lipossomos da invenção em uma formulação útil para aplicação sublingual ou bucal. Para o tratamento de peritonite, aplicação intraperitoneal é considerada. Colírios podem ser utilizados para infecção bacteriana dos olhos.

[00090] Os lipossomos vazios da invenção sequestram toxinas bacterianas e, desse modo, impedem que bactérias penetrem o epitélio do hospedeiro ou sua propagação sistêmica. O desenvolvimento de doença sistêmica pode assim ser evitado ou reduzido; e os patógenos podem ser eficientemente absolvidos pelas células do sistema imune inato do hospedeiro, os quais são da mesma forma protegidos de toxinas pelos lipossomas.

[00091] Os próprios lipossomos não são citotóxicos, nem são bactericidas. Portanto, é improvável que exercerão pressão antibacteriana seletiva, que adicionariam a emergência de bactérias resistentes ao fármaco. Os lipossomos vazios da invenção imitam estruturas que já existem nas células do hospedeiro, a fim de atrair toxinas bacterianas. Portanto, é inconcebível que as bactérias adaptariam ao desafio lipossomal: cada tentativa de escapar da isca, diminuindo a afinidade de suas toxinas para os lipossomos inevitavelmente leva ao surgimento de toxinas que são igualmente ineficazes contra as células do hospedeiro.

[00092] Quimioterapia à base de lipossomos é uma alternativa atrativa tanto para terapia com antibiótico quanto para um tratamento com anticorpos sequestrantes de toxina.

[00093] A invenção também se refere a um tratamento de infecções bacterianas compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de lipossomos vazios, antes, após, juntamente ou em paralelo com um tratamento padrão de antibióticos da infecção bacteriana. Em combinação com tratamento antibiótico, além de neutralização de toxinas bacterianas ativamente secretadas durante a fase ativa de uma infecção, o tratamento lipossomal proporcionará benefícios adicionais para um paciente ao sequestrar as toxinas que são liberadas durante tratamento antibiótico por meio de bactérias de lise uma condição que é sabida ser prejudicial, por exemplo, durante meningite, em infecção por Streptococcus pneumoniae(liberação aguda de pneumolisina) e infecção por Streptococcus pyogenes (liberação aguda de estreptolisina O).

[00094] Neste tratamento de combinação, os lipossomos vazios e misturas de lipossomos podem ser considerados como adjuvantes, e o método correspondente de tratamento como tratamento adjunto.

[00095] Uma limitação de terapia lipossomal é sua eficiência restrita em indivíduos imunocomprometidos, uma vez que a depuração (clearance) de bactérias não se encontra com o agente quimioterapêutico, mas com o próprio sistema imunológico do hospedeiro. Contudo, mesmo em pacientes imunodeficientes, tratamento lipossomal em combinação com quimioterapia bactericida será benéfico: ao retardar o desenvolvimento de doença sistêmica, e desse modo, proporcionará o organismo com o tempo muito necessário para permitir que os antibióticos expandam seu potencial bactericida total.

[00096] Tratamento com antibiótico considerado juntamente com o tratamento utilizando lipossomos vazios de acordo com a invenção é, por exemplo, tratamento com cefalosporinas e outros antibióticos p- lactâmicos, glicopeptídeo, lincosamidas, lipopeptídios, macrolídeos, penicilinas e combinações de penicilina, quinolonas, sulfonamidas, cloranfenicol e análogos de cloranfenicol, tetraciclinas, clindamicina e inibidores de folato, conforme listados acima. Antibióticos particulares considerados em um tratamento juntamente com lipossomas vazios da invenção são carbapenemos, tais como, imipenemo, cilastina e meropenemo, cefalosporinas de 2a geração, tal como, cefuroxima, cefalosporinas de 3a geração, tais como ceftazidima e ceftriaxona, cefalosporinas de 4a geração, tais como, cefepima, glicopeptídios, tal como vancomicina, macrolídeos, tal como, claritromicina, penicilinas, tais como, amoxicilina e flucloxacilina, combinações de penicilina, tais como, combinações de amoxicilina/clavulanato e piperacilina/tazobactama, quinolonas, tais como, ciprofloxacina e moxifloxacina, e fluorquinolonas, tais como levofloxacina e gemifloxacina.

[00097] Todos os componentes dos lipossomos vazios da invenção são substâncias, que ocorrem naturalmente em seres humanos. Esses lipossomos são, portanto, bem tolerados e absolvidos do corpo via caminhos fisiológicos. Lipossomos aerossóis devem ser utilizados para a prevenção de pneumonia e outras doenças do trato respiratório pela população geral durante as epidemias sazonais de influenza. Mais importante ainda são medidas profiláticas baseadas em aerossóis de lipossomos ou outras aplicações de lipossomos serão úteis na profilaxia de pneumonia ou bacteriemia por MRSA em hospitais, infecções por Pseudomonas aeruginosa, S. aureus ou S. pneumoniae, e em outros locais, que favorecem a propagação de doenças infecciosas.

EXEMPLOS Toxinas

[00098] Estreptolisina O (SLO) de Streptococcus pyogenes, a- hemolisina de Staphylococcus aureus, tetanolisina (TL) de Clostridium tetani e fosfolipase C de Clostridium perfringens foram adquiridos de Sigma. Pneumolisina foi obtida de Prof. Kadioglu (Cruse G. e outros; J. Immunol. 2012; 184:7108-7115). Outras toxinas incluem leucocidina Panton-Valentine (PVL) de S. aureus, listeriolisina O (LLO) de Listeria monocitogenes, perfringolisina O (PFO) de Clostridium perfringens, suilisina (SLY) de S. suis, intermedilisina (ILY) de S. intermedius, cereolisina O (CLO) de B. cereus, turingiolisina O (TLO) de B. thuringiensis botulinolisina (BLY) de C. botulinum, sordelilisina (SDL) de C. sordelli, piolisina (PLO) de Arcanobacterium pyogenes. Sobrenadantes de cultura de Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus foram obtidos de Profs. K. Muhlemann (Bern) e E. Gulbins (Essen).

Cultura Celular

[00099] A linhagem celular de rim embrionário humano (células HEK 293) foi mantida como descrita por Monastyrskaya K. e outros, Cell Calcium. 2007 41:207-219. A linhagem celular de leucemia monocítica aguda humana (THP-1), foi mantida em meio RPMI 1640 contendo FBS a 10%, L-glutamina 2 mM e 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina.

Transfecções

[000100] PFC (proteína fluorescente ciano) foi transitoriamente expressa em células HEK 293 (Monastyrskaya e outros loc. cit.). Células HEK 293 expressando PFC foram usadas para experimentos de imagem de módulo de varredura a laser (MVL) 2 dias após transfecção.

Lipossomos

[000101] Colesterol (Ch) (C-8667), esfingomielina (Sm) de gema de ovo de galinha (S0756), fosfatidilcolina (PC) de soja (P7443), fosfatidiletanolamina (PE) de cérebro bovino (P9137) e sal de sódio fosfatidilserina (PS) de cérebro bovino (P5660) foram adquiridos de Sigma. Os lipídios foram individualmente dissolvidos em clorofórmio sob concentrações de 1 mg/ml e armazenados a -20oC. Para a preparação de lipossomos, as soluções de clorofórmio de lipídios individuais foram misturadas na composição e as proporções, as quais são fornecidas no texto, para produzir rotineiramente 50-500 pul da solução final. Clorofórmio foi completamente evaporado por 20-50 minutos a 60°C. 50 pl ou 100 pl de tampão de Tyrode (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, pH = 7,4) contendo CaCl2 2,5 mM, foram adicionados aos tubos contendo películas de lipídios secas e vigorosamente submetidas a vórtice. As suspensões de lipídios foram incubadas durante 20-30 minutos a 45°C em um termomisturador Eppendorf com agitação vigorosa. Para produzir lipossomas, as suspensões de lipídios finais foram sonicadas 3 x 5 seg. a 6°C em um sonicador Bandelin Sonopuls a 70% de potência. As preparações lipossomais foram deixadas por pelo menos 1 hora a 6°C antes que fossem utilizadas em experimentos. A concentração de lipídios individuais nos lipossomas é sempre fornecida como a razão de peso por peso (p/p). Em lipossomas contendo colesterol e esfingomielina, a razão de 1:1 (p/p) corresponde a 50% (p/p) ou a 66% molar de colesterol. As quantidades de lipossomas são fornecidas como a quantidade de lipídios totais utilizadas para sua preparação.

[000102] Em um método alternativo, aproximadamente 25 ml de cada formulação foram produzidos pela hidratação de etanol e método de extrusão. As formulações finais foram esterilizadas, filtradas e preenchidas em frascos de vidro de soro em autoclave (concentração final: 40 mg/ml). Os tamanhos de partículas dos lipossomas são na faixa de 80-150 nm, com boa PDI (índice de polidispersibilidade). Os resultados para a medição da osmolaridade são também incluídos. Estes são todos na faixa de cerca de 400 mmol/kg, que é bastante próximo ao nível fisiológico desejado. TABELA 1: ESPECIFICAÇÕES

Lise Celular induzida por toxina e efeitos protetores de lipossomos

[000103] Em células epiteliais de rim embrionário humano (HEK 293), lise induzida por toxina foi monitorizada como um declínio de fluorescência citoplasmática, devido a um efluxo induzido por poros de CFP intracelular. Células confluentes HEK 293 semeadas em 15 mm de lamelas de vidro (2,5 x 105 células por lamela) foram montadas em uma câmara de perfusão a 25°C, em tampão de Tyrode contendo CaCl2 2,5 mM e sua fluorescência foi registrada em um microscópio Axiovert 200 M com um módulo de varredura a laser LSM 510 META (Zeiss, Alemanha), utilizando uma lente de imersão em óleo de *63 (Monastyrskaya e outros, loc. cit.). Em ponto de tempo = 0, o tampão foi substituído por 100 pl ou 200 pl do mesmo tampão contendo adicionalmente uma quantidade citolítica de uma dada toxina (por exemplo, 120 ng de SLO de Streptococcus pyogenes) e 20 mM/L de ditiotreitol (DTT). Para investigar o efeito protetor de lipossomos na lise celular induzida por toxina, em ponto de tempo = 0, as células foram rotineiramente desafiadas com 100 pl de uma mistura contendo toxina/DTT e lipossomos de várias concentrações e de várias composições de lipídios. A mistura de lipossomo-toxina foi preparada imediatamente antes de adição às células (com 20 a 30 segundos de atraso de manipulação). Em alguns casos, 100 pl de solução contendo os lipossomos isolados foram adicionados primeiro às células, seguidos (com 20 a 30 segundos de atraso de manipulação) por 100 pl de solução contendo toxina. Os efeitos protetores dos lipossomos foram similares sob qualquer condição experimental. As imagens foram analisadas usando o pacote de software "avaliação de fisiologia" (Zeiss, Alemanha).

[000104] Os efeitos de PFTs purificados ou sobrenadantes de cultura bacteriana sobre a proliferação de uma linhagem celular de monócitos humanos (THP-1) foram avaliados na presença ou ausência de lipossomos de várias composições de lipídios. Rotineiramente, 100600 pl de solução contendo toxina (Ca2 + tampão de Tyrode ou caldo BHI) foram adicionados a 100 pl (5 x 104 células) de células mantidas em meio de cultura e pré-misturadas com 50-150 pl de lipossomos de várias composições de lipídios. Após incubação por 3 horas, 1-2 ml de meio de cultura fresco foram adicionados aos tubos. As células foram contadas a cada dia ou a cada segundo dia durante 8-12 dias. As toxinas e os lipossomos estavam presentes por toda duração de um experimento. Os dados apresentados nos diagramas correspondem ao 5° dia ou 6° dia, quando o crescimento celular estava ainda na fase linear.

Comparação de lipossomos "vazios" e "preenchidos"

[000105] A proteção contra sobrenadantes de cultura de S. aureus ou S. pneumoniae pela mistura de lipossomos "vazios" Ch:Sm + lipossomos apenas de Sm é comparada com aquela de mistura de lipossomos Ch:Sm + lipossomos apenas de Sm preenchida com um corante fluorescente tais como Fluoresceína, Verde Oregon 488, Rhodamina ou Vermelho Texas.

[000106] A proteção contra sobrenadantes de cultura de S. aureus ou S. pneumoniae pela mistura de lipossomos "vazios" Ch:PC é comparada com aquela de mistura de lipossomos Ch:PC preenchida com um corante fluorescente tais como Fluoresceína, Verde Oregon 488, Rhodamina ou Vermelho Texas.

Proteção por superfícies revestidas com lipídios

[000107] Contas revestidas por colesterol e esfingomielina são testadas em relação à sua atividade sequestrante de toxina contra sobrenadantes de cultura de S. aureus ou S. pneumoniae.

Efeito in vivo em combinação com tratamento antibiótico ou bacteriemia induzida por S. aureusou S. pneumoniae

[000108] A mistura de 2 componentes de lipossomos Ch:Sm e apenas de Sm; mistura de 3 componentes de lipossomos Ch:Sm; apenas de Sm e Sm:PC (1:2:2) e de uma mistura de 4 componentes de lipossomos Ch:Sm, apenas de Sm, Sm:PC e Ch:PC (1:1:1:1) são testadas em modelos de camundongos de bacteriemia induzida por uma cepa de Streptococcus pneumoniaesuscetíveis à penicilina ou por uma cepa de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MSSA). Dois tipos de cepas MSSA são considerados, caracterizados por sua capacidade de secretar ou não a toxina leucocidina Panton-Valentine (PVL). Além disso, a mistura de 2 componentes de lipossomos Ch:Sm e apenas de Sm peguilados (PEG a 2% ou PEG a 5%) são também testados.

[000109] Camundongos de laboratório são inoculados por meio de injeção intraperitoneal (i.p.), intravenosa (i.v.) ou intranasal (i.n.) de aproximadamente 107 ou 108 ufc/ml de bactérias.

[000110] Para cada cepa de bactérias, cada via de infecção, e para cada uma das misturas de lipossomos (mistura LP), injeções intravenosas de duas diferentes doses (2 mg/kg ou 6 mg/kg) da mistura de LP são iniciadas a cada seis horas (t = 6) , 12 horas (t = 12), 18 horas (t = 18) ou 24 horas (t = 24), após o desafio bacteriano (em cada caso, a injeção de mistura LP é seguida por uma injeção adicional de 12 horas ou duas injeções adicionais de 4 horas e 24 horas após a injeção inicial), com ou sem tratamento com penicilina (30 mg/kg). Tratamento com antibióticos é iniciado ao mesmo tempo de tratamento com lipossomos. Dois tipos de controles foram realizados: infecção sem tratamento e infecção tratada com antibiótico isoladamente (em t = 6, t = 12, t = 18, ou t = 24).

[000111] Para cada cepa de bactérias e para cada mistura de lipossomos, e para cada dose de lipossomo e cada via de infecção havia 10 grupos de animais.

[000112] No grupo 1, a sobrevivência de 50% do grupo foi seguida por pelo menos 8 dias, 25% do grupo foram submetidos à eutanásia uma hora após o desafio bacteriano e os 25% restantes, 6 horas após o desafio bacteriano.

[000113] Contagens bacterianas foram determinadas no sangue e diversos órgãos tais como pulmões, baço, e rins.

[000114] Leitura: sobrevivência, sinais de infecções, metabolismo (medições em série de perda de peso e recuperação, consumo de O2 e taxas de produção de CO2 medidas por meio de calorimetria indireta, gasto energético em repouso (GER) calculado com a fórmula de Weir modificada); perfil de citocinas de inflamação (ELISA foi realizado em soro para fator de necrose tumoral (TNF-alfa), proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-2 e IL-1b).

Concentração bactericida mínima (CBM)

[000115] Nenhuma atividade de lipossomos de esfingomielina/colesterol contra cepas usuais:

[000116] O teste da concentração bactericida mínima (CBM) foi realizado seguindo as diretrizes propostas pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (IPCL).

[000117] Para os testes de diluição de microlitro de caldo, placas de 96 poços suplementadas com 50 pL de 0,5 - 16 mg/mL de lipossomos foram inoculadas com 50 pL de caldo de Mueller Hintoncontendo uma suspensão de células bacterianas de 1-5 x 105 unidades formadoras de colônias (UFC) por mL de S. aureus. As placas foram incubadas durante 24 horas a 36°C. CBM foi determinada transferindo alíquotas de 10 pL das placas de diluição por microlitro do caldo em poços sobre ágar Columbia no sangue (Oxoid, Wesel, Alemanha). As placas inoculadas foram adicionalmente incubadas durante 24 horas a 36°C e em seguida, as colônias foram contadas.

Claims (18)

1. Uso de lipossomos vazios, caracterizado pelo fato de que compreendem 30% (p/p) ou mais de colesterol e esfingomielina, ou misturas de lipossomos vazios compreendendo 30% (p/p) ou mais de colesterol e esfingomielina, ou fosfatidilcolina e esfingomielina, com outros lipossomos vazios de composição lipídica definida, para o preparo de uma composição ou um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecções bacterianas.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos outros lipossomos vazios de composição lipídica definida são lipossomos vazios compreendendo lipídios ou fosfolipídios selecionados do grupo que consiste em colesterol, esfingomielinas, ceramidas, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, diacilgliceróis e ácidos fosfatídicos contendo um ou dois ácidos graxos saturados ou insaturados com mais de 4 átomos de carbono e até 28 átomos de carbono.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de lipossomos vazios compreende ou consiste em colesterol e esfingomielina, com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de lipossomos vazios compreende ou consiste em fosfatidilcolina e esfingomielina, com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em esfingomielina.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de lipossomos vazios compreende ou consiste em colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina, e com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita mistura de lipossomos vazios compreende ou consiste em colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em fosfatidilcolina e esfingomielina, com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina, e com lipossomos vazios compreendendo ou consistindo em colesterol e fosfatidilcolina.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que alguns ou todos os lipossomos são modificados com polietileno glicol.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é no tratamento e prevenção de bacteriemia, lesões da pele infectadas por bactérias, meningite e infecções do trato respiratório.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de infecções bacterianas em um paciente em necessidade do mesmo, e em que uma quantidade terapeuticamente eficaz dos ditos lipossomos vazios ou da dita mistura de lipossomos vazios é usada.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade terapeuticamente eficaz dos ditos lipossomos vazios ou da dita mistura de lipossomos vazios é usada antes, depois, junto ou em paralelo com uma medicação antibiótica padrão contra a infecção bacteriana.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na prevenção de uma infecção bacteriana de um indivíduo exposto ao risco de infecção, em que uma quantidade preventiva dos ditos lipossomos vazios ou da dita mistura de lipossomos vazios é usada.

12. Uso de bicamadas lipídicas ou monocamadas lipídicas compreendendo 30% (p/p) ou mais de colesterol e esfingomielina, e opcionalmente, fosfatidilcolina, cobrindo superfícies não-lipídicas, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição ou um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecções bacterianas.

13. Mistura de lipossomos vazios, caracterizada pelo fato de que compreende 30% (p/p) ou mais de colesterol e esfingomielina, ou fosfatidilcolina e esfingomielina, com outros lipossomos vazios de composição lipídica definida.

14. Mistura de lipossomos vazios de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que compreende colesterol e esfingomielina, ou fosfatidilcolina e esfingomielina, com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina.

15. Mistura de lipossomos vazios de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que compreende colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo fosfatidilcolina e esfingomielina, e com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina.

16. Mistura de lipossomos vazios de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende colesterol e esfingomielina com outros lipossomos vazios compreendendo fosfatidilcolina e esfingomielina, com lipossomos vazios consistindo em esfingomielina, e com lipossomos vazios compreendendo colesterol e fosfatidilcolina.

17. Mistura de lipossomos vazios de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de que alguns ou todos os lipossomos são modificados com polietileno glicol.

18. Uso de uma mistura de lipossomos vazios, como definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição ou um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecções bacterianas.

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