CN104593425B - 一种石斛红曲制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵领域，特别涉及一种石斛红曲制备方法，是将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物即为石斛红曲。本发明提供的石斛红曲制备方法，结合中草药和微生物源性生成抗氧化活性物质的共同特点，利用抗氧化作用疗效确切的金钗石斛与已有研究报道具有生成抗氧化性物质的红曲霉进行共同发酵培养，在红曲霉代谢转化金钗石斛的同时，金钗石斛也对红曲霉的代谢流产生影响，两者产生互补及增效的作用，得到的石斛红曲达到了非常显著的抗氧化效果，这种效果是单纯利用红曲霉发酵或金钗石斛无法达到的。

Description

一种石斛红曲制备方法

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体而言，涉及一种石斛红曲制备方法。

背景技术

健康长寿是人类共同的愿望，也是医学和生命科学研究的永恒主题。现代医学研究表明：活性氧自由基不仅会使人体内的脂质与蛋白质发生链式氧化反应导致细胞膜、组织、酶和基因受损，对肌体造成了损害和衰老，而且会促使有关的基因突变，诱发相关的疾病(如早衰、关节炎、局部缺血与再灌注损伤、老年痴呆及癌症等)。因此，清除自由基的抗氧化药物在抗衰老和防治多种相关疾病中具有重要的作用。近时以来，抗氧化作用的研究发展到一个非常的高度，许多文章、鉴定和研究报告层出不穷。

结合中草药源性和微生物源性抗氧化物质的特点，利用微生物转化中药活性成分，微生物转化的本质是利用微生物生长代谢过程中产生的酶对特定底物进行结构修饰的化学反应，利用微生物发酵炮制中药的过程实际上就是一种生物转化反应，中药成分的生物转化是研究开发新药的重要方面。微生物在生长过程中可以分泌几十种胞外酶于培养基中，其生命活动所产生的胞内酶更是成百上千，这些丰富而强大的酶系就可能成为中药发生化学反应的物质基础。由于微生物具有种类繁多、繁殖快等特点，所以微生物转化常被用来对天然产物的结构进行修饰，以获得一些结构更合理或活性更好的先导化合物。其优点可概括为：1)保护中药活性成分免遭破坏，使药物的有效组分、活性物质最大限度地得以提取、利用；2)提高中药药性，降低药物的毒副作用；3)所优选的有益菌种本身能补充或增强原有药物的功能；4)产生新的活性物质；5)为中药活性成分结构修饰提供新途径；6)节省药材资源，保护环境；7)是实现中药现代化、具有高科技水平的又一新技术，生产工艺可控，所得产物精确，制剂方便，便于与国际接轨。

石斛作为传统珍稀名贵中药，石斛在临床上广泛用于慢性萎缩性胃炎及降血糖、抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力等多种疾病，而这些疾病的产生在很大程度上都与体内活性氧的代谢失调有关，目前有研究表明联苄类和酚酸类成分具有抗氧化活性。同时，有研究报道红曲霉次级代谢产物中的Dimerumic acid、酚类、色素、黄酮、dihydromonacolin-MV、他汀类、类黄酮等都具有较好的抗氧化作用。特别是Dimerumic acid，在较低的浓度就表现出很强的抗氧化活性。所以红曲霉无论直接食用还是作为添加剂，都可以为人体提供抗氧化物质，减少氧化损伤。

红曲霉不但自身丰富的代谢产物具有很高的药用价值，而且它丰富的酶系对中草药活性成分的转化与修饰存在巨大的潜力，是双向发酵体系用菌种的良好选择，石斛作为传统珍稀名贵中药，石斛在临床上广泛用于慢性萎缩性胃炎及降血糖、抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力等多种疾病，而这些疾病的产生在很大程度上都与体内活性氧的代谢失调有关，目前有研究表明联苄类和酚酸类成分具有抗氧化活性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石斛红曲制备方法，金钗石斛与红曲霉互相影响，协同增效，达到预料不到的抗氧化效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种石斛红曲制备方法，将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物即为石斛红曲。

本发明提供的石斛红曲制备方法，结合中草药和微生物源性生成抗氧化活性物质的共同特点，利用抗氧化作用疗效确切的金钗石斛与已有研究报道具有生成抗氧化性物质的红曲霉进行共同发酵培养，在红曲霉代谢转化金钗石斛的同时，金钗石斛也对红曲霉的代谢流产生影响，两者产生互补及增效的作用，得到的石斛红曲达到了非常显著的抗氧化效果，这种效果是单纯利用红曲霉发酵或金钗石斛无法达到的。

其中，红曲霉为市售菌株。

进一步地，所述红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养前，先将红曲霉菌株培养成发酵种子液，将所述发酵种子液接种于添加有金钗石斛的培养基培养。先将红曲霉制成发酵种子液，此时菌体的浓度为，得到的种子液中菌体数量大，菌体生长旺盛，利于下一步的发酵培养。

具体地，每升添加有金钗石斛的培养基含有以下成分：20-50g米粉，由金钗石斛制成的金钗石斛汁，蛋白胨9-11g，加水定容。本发明提供的添加有金钗石斛的培养基营养成分全面，红曲霉能很好的生长，并且红曲霉能很好的转化利用培养基中的金钗石斛，红曲霉与金钗石斛两者相互作用，得到的石斛红曲抗氧化能力大大增强。

进一步地，所述由金钗石斛制成的金钗石斛汁为：由50-60g新鲜金钗石斛或4-5g干的金钗石斛制成的金钗石斛汁。每升培养基添加该含量的金钗石斛，很好的满足了红曲霉与金钗石斛两者之间的相互作用，得到的斛红曲抗氧化能力大大增强。

进一步地，所述金钗石斛汁由以下方法制备：称取50-60g新鲜或4-5g干的金钗石斛，加水250-400ml，打成混合浆液即得。该方法易于制得金钗石斛汁，并且其中的成分分布更为均匀。

优选地，所述发酵种子液按体积百分比为8％-11％进行接种于添加有金钗石斛的培养基培养。以该百分比的接种量进行接种，既利于红曲霉在添加有金钗石斛的培养基快速扩增，并很好的转化金钗石斛的成分，获得的石斛红曲抗氧化成分含量高，且活性强。

进一步地，所述发酵种子液由以下方法制备：

将浓度为3×10⁶-7×10⁶cfu的红曲霉孢子悬液按体积百分比为6-10％接种于种子培养基，30℃±1，180-250r/min振荡培养72-80h，制备得到发酵种子液；

每升所述种子培养基包括以下成分：麦芽糖4-6g，蛋白胨9-11g，酵母膏4-6g，葡萄糖19-21g，加水定容。

制得的发酵种子液的OD600值达到0.7-0.9，菌体生长旺盛，利于下一步的发酵培养。

优选地，所述孢子悬液在制备前先进行活化；

所述活化优选为：将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基，30℃±1培养4-6d取出；

再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30℃±1培养7-8d，即可。

菌种在培养前先进行活化，以增强菌体的活力。

进一步地，每升所述斜面培养基包括以下成分：麦芽糖4-6g，蛋白胨9-11g，酵母膏4-6g，琼脂19-21g，葡萄糖19-21g，加水定容。该斜面培养基使红曲霉菌种很好的生长，得到的菌株活力高。

优选地，所述将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养的条件具体为：

30℃±1℃，180-210rmp振荡培养3-4d；然后27℃±1℃静止培养4-6d发酵终止。

先对红曲霉进行振荡培养，以使红曲霉快速扩增，并将金钗石斛的有效成分进行吸收转化；然后静止一段时间，以使活性物质累积。培养得到的石斛红曲为半固体到固体状，颜色粉红到深红色，抗氧化成分含量高，且抗氧化活性高。

将发酵产物从摇瓶中取出，30-50℃烘干，磨粉至80-200目即得石斛红曲产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用抗氧化作用疗效确切的金钗石斛与红曲霉进行共同发酵培养，红曲霉代谢转化金钗石斛的同时，金钗石斛也对红曲霉的代谢流产生影响，两者产生互补及增效的作用，得到的石斛红曲达到了非常显著的抗氧化效果；

(2)本发明还提供了特定成分含量的添加有金钗石斛的培养基，红曲霉能很好的生长，并且红曲霉能很好的转化利用培养基中的金钗石斛，红曲霉与金钗石斛两者相互作用，得到的石斛红曲抗氧化能力大大增强；

(3)本发明还提供的金钗石斛汁的制备方法，该方法易于制得金钗石斛汁，并且其中的成分分布更为均匀；

(4)本发明还限定了发酵的接种量以及发酵培养的条件，其中，发酵培养采用对红曲霉进行振荡培养，以使红曲霉快速扩增，并将金钗石斛的有效成分进行吸收转化；然后静止一段时间，以使活性物质累积，培养得到的石斛红曲为半固体到固体状，颜色粉红到深红色，抗氧化成分含量高，且抗氧化活性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实验例2中多酚含量标准曲线图；

图2为本发明实验例3中生物碱含量标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

1.1 培养基的制备

(1)、斜面培养基：麦芽糖4g，蛋白胨9g，酵母膏4g，琼脂21g，葡萄糖21g，水1000ml，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。

(2)、种子培养基：麦芽糖4g，蛋白胨9g，酵母膏4g，葡萄糖21g，加水定容至1000ml，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。

(3)、发酵培养基

添加有金钗石斛的培养基：50g米粉，金钗石斛汁(称取50g新鲜金钗石斛，加300ml水，打浆机打成混合浆液)，蛋白胨9g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20min，冷却待用。

不添加金钗石斛的发酵培养基：50g米粉，蛋白胨9g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20min，冷却待用。

1.2 发酵培养工艺

1.2.1 菌种活化

本发明所用红曲霉为红曲霉(Monascus anka)菌株3.4577，购自中国普通微生物菌种保藏中心；红曲霉也可购买自其它厂家。将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基，30℃±1培养4d取出；再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30℃±1培养8d，备用。

1.2.2 孢子悬液的制备

将培养好的斜面菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶中，充分振荡，制成终浓度为3×10⁶cfu的均一孢子悬液。

1.2.3 种子液的制备

将孢子悬液按10％(v/v)接种于装有200ml种子培养基的500ml摇瓶中，30℃±1，180r/min振荡培养80h，制备得到发酵种子液。

1.2.4发酵培养

将发酵种子液按8％(v/v)接种于装有150ml发酵培养基的1000ml摇瓶中，30℃±1℃，180rpm振荡培养4d；然后27℃±1℃静止培养6d发酵终止。

将发酵产物从摇瓶中取出，30℃烘干，磨粉至80目，得到发酵样品。

实施例2

1.1 培养基的制备

(1)、斜面培养基：麦芽糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。

(2)、种子培养基：麦芽糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，加水定容至1000ml，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。

(3)、发酵培养基

添加有金钗石斛的培养基：35g米粉，金钗石斛汁(称取60g新鲜的金钗石斛，加400ml水，打浆机打成混合浆液)，蛋白胨10g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20min，冷却待用。

不添加金钗石斛的发酵培养基：35g米粉，蛋白胨10g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20min，冷却待用。

1.2 发酵培养工艺

1.2.1 菌种活化

本发明所用红曲霉为红曲霉(Monascus anka)菌株3.4577，购自中国普通微生物菌种保藏中心；红曲霉也可购买自其它厂家。将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基，30℃±1培养5d取出；再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30℃±1培养8d，备用。

1.2.2 孢子悬液的制备

将培养好的斜面菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶中，充分振荡，制成终浓度为5×10⁶cfu的均一孢子悬液。

1.2.3 种子液的制备

将孢子悬液按8％(v/v)接种于装有200ml种子培养基的500ml摇瓶中，30℃±1，200r/min振荡培养75h，制备得到发酵种子液。

1.2.4发酵培养

将发酵种子液按10％(v/v)接种于装有180ml发酵培养基的1000ml摇瓶中，30℃±1℃，200rpm振荡培养4d；然后27℃±1℃静止培养5d发酵终止。

将发酵产物从摇瓶中取出，40℃烘干，磨粉至150目，得到发酵样品。

实施例3

1.1 培养基的制备

(1)、斜面培养基：麦芽糖6g，蛋白胨11g，酵母膏6g，琼脂19g，葡萄糖19g，水1000ml，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。

(2)、种子培养基：麦芽糖6g，蛋白胨11g，酵母膏6g，葡萄糖19g，加水定容至1000ml，pH自然。121℃灭菌20min，冷却待用。

(3)、发酵培养基

添加有金钗石斛的培养基：20g米粉，金钗石斛汁(称取4-5g干的金钗石斛，加250ml水，打浆机打成混合浆液)，蛋白胨11g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20min，冷却待用。

不添加金钗石斛的发酵培养基：20g米粉，蛋白胨11g，加水定容至1000ml，121℃灭菌20min，冷却待用。

1.2 发酵培养工艺

1.2.1 菌种活化

本发明所用红曲霉为红曲霉(Monascus anka)菌株3.4577，购自中国普通微生物菌种保藏中心；红曲霉也可购买自其它厂家。将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基，30℃±1培养6d取出；再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30℃±1培养7d，备用。

1.2.2 孢子悬液的制备

将培养好的斜面菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶中，充分振荡，制成终浓度为7×10⁶cfu的均一孢子悬液。

1.2.3 种子液的制备

将孢子悬液按6％(v/v)接种于装有200ml种子培养基的500ml摇瓶中，30℃±1，250r/min振荡培养72h，制备得到发酵种子液。

1.2.4 发酵培养

将发酵种子液按11％(v/v)接种于装有200ml发酵培养基的1000ml摇瓶中，30℃±1℃，210rpm振荡培养3d；然后27℃±1℃静止培养4d发酵终止。

将发酵产物从摇瓶中取出，50℃烘干，磨粉至200目，得到发酵样品。

实验例1

多糖的测定

分别取定量发酵样品，分别加10倍体积水、10倍体积90％乙醇，60℃浸提12h，12000r/min，离心15min，取上清液10ml于50ml离心管中，加入40ml 95％乙醇，混匀后醇沉处理12h，经4000r/min离心10min后，弃上清液，再加5ml蒸馏水于沉淀中，待沉淀完全溶解后加0.1g活性炭，去掉色素6h，离心得上清液。吸取上清液0.1～0.5ml于比色管中(使最终稀释液吸光值落在0.1～0.9范围内)，以蒸馏水补至2ml，加入1ml 6％的苯酚溶液摇匀后沿管壁缓慢注入浓硫酸5ml，立即摇匀，然后置于沸水浴中保温15min，冷却至室温后于490nm测OD值，然后以标准曲线(y＝4.9214A₂-0.0022，R²＝0.993)计算多糖含量。标准样品中多糖含量的计算公式：y＝4.9214A₂-0.0022*2*5/V₂*200/10；

式中：y-试样中多糖的含量，单位为毫克/每克(mg/g)；

A₂-苯酚-硫酸法测样品所得OD值；

V₂-吸取去色素后的上清液的体积，单位为ml。

同时，测定金钗石斛汁中的多糖含量。结果如表1所示。

表1多糖含量

从表1可以看出，本发明将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物石斛红曲中的多糖含量大幅提升。

实验例2

多酚含量测定

(1)样品制备

称取红曲发酵样品5g，加入70％乙醇40mL，超声提取3次，每次30min，合并滤液，浓缩定容至100mL为样品提取液。

(2)试剂配制

(a)FC显色剂

采用相关文献(李静等,2011)方法，称取25.0g钨酸钠和6.25g钼酸钠，用200ml蒸馏水溶于500mL回流瓶中，加入12.5ml磷酸和25ml盐酸，混匀，微沸回流2h，加入37.5g硫酸锂、25ml蒸馏水和数滴溴水，开口沸腾15min(至溴水挥尽为止)，冷却，定容至500ml，过滤，置棕色瓶中，于冰箱冷藏备用。

(b)10％碳酸钠溶液

称取25g碳酸钠，溶于200ml温水，混匀，冷却，定量至250ml。

(c)没食子酸标准溶液

称取0.0111g没食子酸标准品(含量90.1％计)，用蒸馏水溶解、定容至100ml，此标准溶液质量浓度为100mg/L。

(3)标准曲线绘制

吸取没食子酸标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分别加入蒸馏水4ml，FC显色剂1mL，10％碳酸钠溶液3ml，定容至10ml，(标准品的浓度分别为0、1、2、3、4、5、6μg/ml)，在30℃水浴中反应2h，于765nm处测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线，如图1所示。

(4)样品测定取样品提取液0.5ml，分别加入蒸馏水4ml，FC显色剂1ml，10％碳酸钠溶液3ml，定容至10ml，在30℃水浴中反应2h，于765nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品总多酚含量。

同时，测定金钗石斛汁中的多酚含量。结果如表2所示。

表2多酚含量

从表2可以看出，本发明将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物石斛红曲中的多酚含量大幅提升。

实验例3

生物碱含量测定

(1)苦参碱对照品溶液的配制

准确称取苦参碱标准品10mg，溶于氯仿溶液中，并定容至100ml，得到质量浓度为0.1mg/ml的对照品溶液。

(2)溴麝香草酚蓝显色剂配制

准确称取溴麝香草酚蓝0.125g溶于1000ml的一定pH值的磷酸缓冲溶液中，显色剂浓度为2.0×10^–4mol/L。缓冲溶液由0.2mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O与0.2mol/L的NaH₂PO₄·2H₂O配制而成。

(3)酸性染料比色法试验条件的确定

(a)酸性染料比色法最大吸收波长扫描

取1.0ml氯仿溶液为空白，取样品溶液1.0ml和对照品溶液0.5ml，对照品溶液加氯仿至1.0ml，分别在空白、对照和样品溶液中加入2.0×10^-4mol/L的溴麝香草酚蓝显色剂6.0ml，氯仿5.0ml，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h；取氯仿层4.0ml，在氯仿溶液中加入无水硫酸钠(105℃干燥4h)0.2g，摇匀，放置10min，于300～700nm范围内扫描确定最大吸收波长。

(b)溴麝香草酚蓝显色剂pH值的确定

取样品溶液6份，每份1.0ml，分别加入pH值为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的2.0×10^{- 4}mol/L溴麝香草酚蓝显色剂6.0ml，氯仿5.0ml，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0ml，在氯仿溶液中加入无水硫酸钠0.2g，摇匀,放置10min，于最大吸收波长处测定吸光度。

(c)溴麝香草酚蓝显色剂用量的确定

取样品溶液7份，每份1.0ml，分别加入pH值7.0的2.0×10^-4mol/L溴麝香草酚蓝显色剂2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml，氯仿5.0ml，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0ml，在氯仿层中分别加入无水硫酸钠0.2g，摇匀，放置10min，于最大吸收波长处测定吸光度。

(4)标准曲线的绘制

准确吸取苦参碱对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分别加入氯仿至1.0ml，再加入pH值为7.0的2.0×10^-4mol/L溴麝香草酚蓝显色剂5.0ml，氯仿5.0ml，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0ml，在氯仿层中分别加入无水硫酸钠0.2g，摇匀，放置10min，以未加苦参碱的试验样为空白对照，于最大吸收波长处测定吸光度。以苦参碱对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出标准曲线和线性回归方程，结果如图2所示。

(5)总生物碱提取液的制备及其测定

取1g发酵样品用甲醇20ml浸泡24h，过滤，取滤液为提取液；提取3次，合并提取液、浓缩为浸膏。然后用质量分数2％HCl的溶液洗涤溶解，共洗涤3次，合并酸液，并在5000rpm条件下离心10mim。取其上清液，用质量分数10％的NaOH调至pH 10，再用等体积氯仿萃取3次，合并萃取液、浓缩并定容至10ml。硫酸钠0.2g，摇匀，放置10min，以未加苦参碱的试验样为空白对照，于最大吸收波长处测定吸光度。根据标准曲线回归方程计算样品生物碱含量。

同时，测定金钗石斛汁中的生物碱含量。结果如表3所示。

表3生物碱含量

从表3可以看出，本发明将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物石斛红曲中的生物碱含量下降。

实验例4

抗氧化活性测定

采用ABTS自由基清除实验、DPPH自由基清除实验、抗脂质过氧化抑制实验3种体外抗氧化试验，对双向发酵产品提取物的体外抗氧化活性进行分析。

(1)ABTS自由基清除实验

将2.5ml的ABTS(7mmol/L)和44μl的K₂S₂O₈(140mmol/L)溶液充分混合，在室温、避光条件下静置过夜(12h-16h)，得到ABTS⁺储备液。将ABTS⁺储备液用PBS缓冲液(20mmol/L，pH值为7.4)稀释，用紫外分光光度计测量，使其在波长734nm处的吸光度值为0.700±0.002，得到ABTS⁺工作液。取30μl发酵液与3.0ml ABTS⁺工作液混合，充分反应6min，常温条件下在波长734nm处测定吸光度值。计算公式为：

清除率＝(A_空白-A_对照品)/A_空白×100％

式中：A_空白为3.0ml ABTS⁺工作液加30μl甲醇，测得的吸光度值；A_对照品为30μl VC溶液与3.0ml ABTS⁺工作液反应6min后，测得的吸光度值；检测样品时，将A_对照品换成A_样品即可。得到的结果如表4所示。

同时，同样的方法测定金钗石斛汁以及不添加金钗石斛的发酵液与金钗石斛汁1:1(v/v)的混合物中的ABTS自由基清除率。结果如表4所示。

表4ABTS自由基清除率

从表4可以看出，不添加金钗石斛的发酵液与石斛汁以体积比为1:1混合后，ABTS自由基清除率显著下降，说明两者之间存在拮抗作用；而将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基发酵培养后，红曲霉将金钗石斛的有效活性成分进行了转化利用，ABTS自由基清除率明显提升，达到了预料不到的抗氧化效果。

(2)DPPH自由基清除实验

取lml DPPH(0.1mmol/L，乙醇为溶剂)，0.95ml Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH值为7.4)，1ml乙醇和50μl样品混合30min后在波长517nm处常温条件下测定吸光度值，吸光度值越小，其对自由基的清除能力越强。计算公式为：

清除率(％)＝(A_空白组-A_对照品)/A_空白×l00％

式中：A_空白指以50μl甲醇代替样品测得的吸光度值；A_对照品指50μl VC与DPPH反应2min后测得的吸光度值；检测样品时，将A_对照品换成A_样品即可。

同时，同样的方法测定金钗石斛汁以及不添加金钗石斛的发酵液与金钗石斛汁1:1(v/v)的混合物中的DPPH自由基清除率。结果如表5所示。

表5DPPH自由基清除率

从表5可以看出，不添加金钗石斛的发酵液与石斛汁以体积比为1:1混合后，DPPH自由基清除率显著下降，说明两者之间存在拮抗作用；而将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基发酵培养后，红曲霉将金钗石斛的有效活性成分进行了转化利用，DPPH自由基清除率显著提升，达到了预料不到的抗氧化效果。

(3)脂质过氧化抑制实验

使用10％鸡蛋黄匀浆液(体积分数)作为反应的脂质媒介。取0.1ml待测发酵液同0.5ml鸡蛋黄匀浆液、0.4ml纯水及50μl硫酸亚铁溶液(FeSO₄·7H₂O，70mmol/L)混合，于37℃下孵育30min，迅速加入1.5ml乙酸溶液(20％，体积分数，PH为3.5)及1.5ml硫代巴比妥酸溶液(0.8％，质量浓度，用1.1％十二烷基硫酸钠溶液配制)，高速混匀后于95℃下水浴60min。待反应物冷却至室温后，再加入5ml正丁醇，充分摇匀，混合物在5000r/min下离心15min，取上清液测定其在532nm处的吸光度，纯水做空白对照。计算公式为：

脂质过氧化抑制率(％)＝(1-实验组吸光度/空白组吸光度)×100％。

同时，同样的方法测定金钗石斛汁以及不添加金钗石斛的发酵液与金钗石斛汁1:1(v/v)的混合物中的脂质过氧化抑制率。结果如表6所示。

表6脂质过氧化抑制率

从表6可以看出，不添加金钗石斛的发酵液与石斛汁以体积比为1:1混合后，脂质过氧化抑制率显著下降，说明两者之间存在拮抗作用；而将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基发酵培养后，红曲霉将金钗石斛的有效活性成分进行了转化利用，脂质过氧化抑制率非常显著的提升，达到了预料不到的抗氧化效果。

综上可以看出，本发明结合中草药和微生物源性生成抗氧化活性物质的共同特点，利用抗氧化作用疗效确切的的金钗石斛跟已有研究报道具有生成抗氧化性物质的红曲霉进行共同发酵，在红曲霉代谢转化金钗石斛的同时，金钗石斛也可以对红曲霉的代谢流产生影响，产生互补及增效的作用，达到了预料不到的抗氧化效果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种石斛红曲制备方法，其特征在于，将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物即为石斛红曲；

每升所述添加有金钗石斛的培养基含有以下成分：20-50g米粉，由金钗石斛制成的金钗石斛汁，蛋白胨9-11g，加水定容；

所述将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养的条件具体为：

30℃±1℃，180-210rmp振荡培养3-4d；然后27℃±1℃静止培养4-6d发酵终止。

2.根据权利要求1所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养前，先将红曲霉培养成发酵种子液，将所述发酵种子液接种于添加有金钗石斛的培养基培养。

3.根据权利要求1所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述由金钗石斛制成的金钗石斛汁为：由50-60g新鲜金钗石斛或4-5g干的金钗石斛制成的金钗石斛汁。

4.根据权利要求1所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述金钗石斛汁由以下方法制备：称取50-60g新鲜或4-5g干的金钗石斛，加水250-400ml，打成混合浆液即得。

5.根据权利要求2所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述发酵种子液按体积百分比为8％-11％进行接种于添加有金钗石斛的培养基培养。

6.根据权利要求2所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述发酵种子液由以下方法制备：

将浓度为3×10⁶-7×10⁶cfu的红曲霉孢子悬液按体积百分比为6-10％接种于种子培养基，30℃±1，180-250r/min振荡培养72-80h，制备得到发酵种子液；

每升所述种子培养基包括以下成分：麦芽糖4-6g，蛋白胨9-11g，酵母膏4-6g，葡萄糖19-21g，加水定容。

7.根据权利要求6所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述孢子悬液在制备前先进行活化。

8.根据权利要求7所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述活化为：将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基，30℃±1培养4-6d取出；

再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30℃±1培养7-8d，即可。

9.根据权利要求8所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，每升所述斜面培养基包括以下成分：麦芽糖4-6g，蛋白胨9-11g，酵母膏4-6g，琼脂19-21g，葡萄糖19-21g，加水定容。