CN104587449A - 一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，本发明公开了一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒及其制备方法，本发明的纳米粒的活性组分为基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor一1α，SDF一1α)，所用载药纳米材料为硫醇缩酮聚合物(1,4-phenyleneacetone dimethylenethioketal，PPADT)所述纳米粒粒径范围为70nm～130nm。本发明还公开了所述纳米粒的制备方法，制备载药纳米粒的过程为复乳溶媒蒸发法。本发明的产品的缓释效果好，制备方法中减少蛋白变性，提高包封率，稳定性较好，生物毒性低。

Description

一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒及其制备方法。

背景技术

创面修复是一个复杂的生物系统工程，过程中有多种细胞、生长因子及细胞因子共同参与，通过多种细胞水平及分子水平的改变，重建皮肤的屏障功能(1.Balaji,Sundeep G.Keswani,and Timothy M.Crombleholme.The Role of Mesenchymal Stem Cells in the Regenerative Wound Healing Phenotype，ADVANCES IN WOUND CARE,VOLUME 1,NUMBER 4，2012:159-165)。其中，骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为一种有多向分化潜能的细胞(2.Singer NG and Caplan AI.Mesenchymal stem cells:mechanisms of inflammation.Annu Rev Pathol 2011；6:457.)，可参与皮肤重建过程的血管化及上皮化过程。BMSCs的动员、趋化、聚集主要由基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor一1α，SDF一1α)的趋化作用实现。当组织损伤或缺血、缺氧时，可以诱导局部组织的SDF-1α表达上调，产生的SDF-1α可趋化、诱导BMSCs到损伤部位并归巢，参与局部血管化和创面修复(3.Lataillade JJ,Clay D,Bourin P,Hérodin F,Dupuy C,Jasmin C,Le Bousse-Kerdilès MC.Stromal cell-derived factor1 regulates primitive hematopoiesis by suppressing apoptosis and by promoting G(0)/G(1)transition in CD34(+)cells:evidence for an autocrine/paracrine mechanism.Blood,2002；99(4):1117-29.)。因此，局部形成高浓度SDF-1α是吸引并捕捉干细胞参与血管修复的必要条件。

然而，如何在局部形成SDF-1α浓度梯度分布是一个难题。直接局部血管内注射SDF-1α迅速被血液稀释进入全身循环而不能在局部形成有效浓度(4.Preeti Misra,Djamel Lebeche,Hung Ly,Martina Schwarzkop,George Diaz,Roger J.Hajjar,Alison D.Schecter,and John V.Frangioni.Quantitation of CXCR4Expression in Myocardial Infarction using 99mTc-Labeled SDF-1αJ Nucl Med.2008 June；49(6):963–969.doi:10.2967/jnumed.107.050054.)；而直接组织内注 射SDF-1α分布不均匀，易降解，且进入循环的效率不确定。将蛋白质多肽类药物通过可生物降解的微球系统给药，不仅能有效防止药物在体内的快速降解，还可将药物靶向输送至体内有效部位，达到定向释放效应(5.A.K.Bajpai,Sandeep K.Shukla,Smitha Bhanu,Sanjana Kankane.Responsive polymers in controlled drug delivery.Progress in Polymer Science,2008；33:1088-1118.)。实现纳米粒药物的靶向释放，关键是确定病变部位特殊的物理、化学或生物学特性。

西南交通大学的专利申请号为CN201410083750.X，公开号为CN103894328A，发明名称为“在Ti材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法”的中国发明专利申请，本发明公开了一种在Ti材料表面组装携层粘连蛋白和SDF-1α的纳米颗粒的方法。首先制备出载Ln的Hep-PLL纳米颗粒。然后在心血管材料表面制备DM涂层，利用DM与氨基可发生麦克尔加成和西弗碱反应的特性，将含有氨基的纳米颗粒共价固定至样品表面。最后利用纳米颗粒中的肝素能够特异性结合SDF-1α的特性，将SDF-1α组装于纳米颗粒表面，从而构建具有抗凝、抗增生及诱导内皮再生的多功能生物化修饰表面。但也未解决在局部形成SDF-1α浓度梯度分布，且治疗目的不是创面修复。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)作为生物体内病理性存在的致病因子，为纳米粒药物的靶向释放提供了新靶点(6.Napoli A,Valentini M,Tirelli N,Müller M,Hubbell JA.Oxidation-responsive polymeric vesicles.Nature Materials,2004；3:183-189.)。尝试利用局部过氧化特性，研制对ROS敏感的药物载体系统，可以因病变组织内高氧自由基浓度触发聚合物结构变化而释放药物，从而达到靶向治疗的目的。2010年Wilson等在Nature Materials上介绍了新近合成的对活性氧敏感的硫醇缩酮聚合物PPADT，通过复乳溶媒蒸发法制备载有TNF-αsiRNA的纳米粒，纳米粒可在高浓度活性氧环境中解聚，释放药物发挥局部抗炎作用，并取得预期效果(7.Wilson DS,Dalmasso G,Wang L,Sitaraman SV,Merlin D,Murthy N.Orally delivered thioketal nanoparticles loaded with TNF--αsiRNA target inflammation and inhibit gene expression in the intestines.Nature Materials.2010；9:923-8.)。因此研发对活性氧敏感的纳米粒具有潜在的应用价值和前景。

目前尚无文献报道一种对活性氧敏感的能促创面血管化的，并能在进入血液后局部形成有效SDF-1α浓度的纳米粒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒，本发明的另一目的在于提供所述纳米粒的制备方法，本发明的第三目的在于提供所述纳米粒的应用。

本发明的主要技术实施方案如下：

为了实现靶向给药，达到体内缓释作用，维持局部SDF-1α浓度梯度，我们利用苯甲磺酸催化1,4-苯二甲硫醇与2,2-二甲氧基丙烷反应合成的活性氧敏感的硫醇缩酮聚合物PPADT，采用复乳溶媒蒸发/萃取法，控制合成条件，合成包裹SDF-1α，直径在100nm左右的纳米粒，通过静脉给药途径验证其趋化、诱导BMSCs到损伤部位并归巢，促进局部创面血管化，达到修复创面的效果。

本发明的第一方面，提供了一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒，该纳米粒的活性组分为基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)，所用载药纳米材料为硫醇缩酮聚合物(PPADT)，所述纳米粒粒径范围为70nm～130nm。

本发明所述的基质细胞衍生因子1(SDF-1α)，Chromosome 6,NC_000072.6(117168535..117181368)ID:20315。

本发明所述的载药纳米材料为硫醇缩酮聚合物(PPADT)，其化学结构如式Ⅰ所示。所述的硫醇缩酮聚合物是在苯甲磺酸催化下1,4-苯二甲硫醇与2,2-二甲氧基丙烷反应合成的，该硫醇缩酮聚合物对活性氧敏感。

本发明所述的纳米粒为WOW制剂。

本发明的第二方面，提供了一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒的制备方法，所述的制备方法为复乳溶媒蒸发(WOW)。

本发明所述的制备方法包括以下步骤：

A、利用苯甲磺酸催化1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷反应合成的硫醇缩酮聚合物(PPADT)，其反应式如下：

B、应用复乳溶媒蒸发/萃取法，1mg/ml SDF-1αPBS溶液(内水相):10mg/ml PPADT二氯甲烷(油相)按1：:10体积比，冰浴下间断超声120瓦、15s，形成初乳悬液；将初乳悬液加入同体积1％胆酸钠溶液(外水相)中，连续超声200瓦、30s形成复乳悬液；

C、将复乳悬液按1:20体积比，加入0.5％胆酸钠溶液中，4℃500rpm搅拌4小时以去除有机溶剂；梯度离心后收集纳米粒，去离子水重悬，去除溶液中的SDF-1α及胆酸钠，制得SDF-1α-PPADT纳米粒。

步骤B具体为：1mg SDF-1α(murine SDF-1α，Peprospec，USA)溶于100ul PBS溶液作为内水相，10mg PPADT溶于1ml二氯甲烷作为油相，冰浴下间断超声120瓦*15s*2次，形成初乳悬液；将初乳悬液加入1ml 1％胆酸钠溶液(外水相)中，连续超声200瓦*30s形成复乳悬液；

步骤C具体为：将复乳悬液置入40ml 0.5％胆酸钠溶液中，4℃500rpm搅拌4小时以去除有机溶剂；4000rpm、8000rpm、12000rpm梯度离心后收集纳米粒，去离子水重悬，重复三次以去除溶液中的SDF-1α及胆酸钠，-40℃真空抽干后，制得SDF-1α-PPADT纳米粒。

本发明的第三方面，提供了一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒在制备创面修复药物或材料中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明制备的纳米粒子，纳米粒数量粒径为99.18±33.70nm，分布粒径为140.9±55.62nm,分布宽度PDI＝0.107，粒子分布均匀。

本发明制备的纳米粒子，经测量包裹活性蛋白SDF-1α载药量为1％～3％，载药纳米粒在水溶液中稳定，在氧自由基存在情况下可稳定的释放包裹的SDF-1α，达到缓释包裹蛋白的作用。

本发明制备的纳米粒子，动物实验证实其无生物毒性，体内应用时可保持蛋白质活性，促进创面血管化。本发明具有一定的临床应用前景。

附图说明

图1为SDF-1α-PPADT载药纳米粒扫描电镜图，其中箭头所指为本发明所制备的纳米粒，可见其粒径均匀，为100nm左右。

图2为不同浓度的PPADT纳米粒与RAW264.7细胞共培养结果，其中A为control；B为50ugppadt；C为75ugppadt；D为100ugppadt。

图3为SDF-1α-PPADT载药纳米粒的制备流程图。

图4为各脏器组织病理切片HE染色结果，其中AB、CD、EF、GH、IJ、KL分别为心、肝、脾、肺、肾、睾丸，A、C、E、I、K为对照组，B、D、F、H、J、L为实验组。

图5为创面愈合图，其中A:生理盐水、B:50mg/kg空白PPADT纳米粒、C:5ug/kgSDF-1、D:50mg/kg空白PPADT纳米粒+5ug/kg SDF-1α、E：50mg/kg SDF-1α-PPADT纳米粒。

图6创面愈合率，其中A:生理盐水、B:50mg/kg空白PPADT纳米粒、C:5ug/kgSDF-1、D:50mg/kg空白PPADT纳米粒+5ug/kg SDF-1α、E：50mg/kg SDF-1α-PPADT纳米粒。

图7为创面皮肤组织病毒切片免疫荧光，其中A:5*10⁵GFP-BMSCs、B:5*10⁵GFP-BMSCs+50mg/kg空白PPADT纳米粒、C:5*10⁵GFP-BMSCs+5ug/kg SDF-1α、D:5*10⁵GFP-BMSCs+50mg/kg空白PPADT纳米粒+5ug/kg SDF-1α、E:5*10⁵GFP-BMSCs+50mg/kg SDF-1-PPADT。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。其中：

SDF-1α  CHM-324,Prospec,(U.S.)

1,4-苯二甲硫醇，CAS105-09-9，Sigma-Aldrich(U.S.)

2,2-二甲氧基丙烷  CAS:77-76-9,Sigma-Aldrich(U.S.)

间充质干细胞  MUBMX-01001,Cyagen,(China)

实施例1：制备本发明的载药纳米粒

如图3所示，应用w1/o/w2方法，1mg murine SDF-1α溶于100ulPBS溶液作为内水相，10mgPPADT溶于1ml二氯甲烷作为油相，冰浴下间断超声120瓦*15s*2times，形成初乳悬液。将初乳悬液加入1ml 1％胆酸钠溶液(外水相)中，连续超声200瓦*30s形成复乳悬液。而后将复乳悬液置入40ml 0.5％ 胆酸钠溶液中4℃500rpm搅拌4小时以去除有机溶剂。梯度离心后收集纳米粒，去离子水重悬，重复三次以去除溶液中的SDF-1α及胆酸钠，制得SDF-1α-PPADT纳米粒。

粒径仪、透射电镜测得纳米粒数量粒径为99.18±33.70nm，分布粒径为140.9±55.62nm，分布宽度PDI＝0.107，粒子分布均匀(见图1)。

实施例2：SDF-1α-PPADT体外释放实验

以1ml二氯甲烷溶解上步制得的纳米粒，12000g离心10分钟，去除上清，适量PBS溶液溶解附壁的SDF-1α，ELISA法测其含量。当SDF-1α投药量为1mg、PPADT投药量为10mg时，每1mg纳米粒中含18ug SDF-1α。将SDF-1α-PPADT纳米粒100mg分别重悬于1ml去离子水和芬顿试剂(3％H₂O₂加1％氯化亚铁)中，分别于30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h取适量混悬液，20000g离心10min去除纳米粒，ELISA法测上清液中SDF-1α浓度在水溶液中，纳米粒48h内释放出包裹的SDF-1α总量的5％。而在氧自由基存在的情况下，纳米粒中SDF-1α逐步释放，在8h时已释放总量的82.56％，而在48h时基本已释放完全。

证明合成的SDF-1α-PPADT纳米粒在水溶液中基本稳定，而在氧自由基存在的情况下纳米粒可以缓释包裹的SDF-1α。

实施例3：PPADT细胞毒性实验

以加入10％胎牛血清的低糖DMEM细胞培养基于6孔板内培养RAW264.7，细胞密度1X10⁵/孔，试验时分别加入去离子水、1mg/ml空白纳米粒、10mg/ml空白纳米粒、100mg/ml空白纳米粒培养24小时，每组6孔，24小时后以CCK8染色，200X显微镜下分别观察10个视野，计数存活细胞数，并于570nm计数吸光度值，比较各组细胞增殖率，发现不同浓度的PPADT纳米粒与RAW264.7细胞共培养24小时后，细胞增值率与对照组基本相近(表1、图2)。证明纳米粒的细胞毒性弱。

表1：细胞存活率检测

(细胞毒性试验共培养24小时CCK8染色，相对吸光度值)

control	50ugppadt	75ugppadt	100ugppadt
				1	0.987	0.977	0.965
1.023	0.995	0.981	0.96

 

0.983	0.977	0.982	0.963
				0.994	0.984	0.968	0.97
1.043	0.976	0.975	0.954
				0.972	0.985	0.974	0.963
0.985	0.997	0.977	0.965
				1.022	0.984	0.981	0.96
0.982	0.996	0.982	0.963
				0.996	0.975	0.968	0.97
1.056	0.987	0.975	0.954
				0.944	0.984	0.974	0.963

注：细胞存活率如下，以control为100％各组之间p>0.05

实施例4：PPADT生物毒性实验

6周龄雄性C57小鼠80只，体重18-22g，分为4组，分别尾静脉注射生理盐水、1mg/ml空白纳米粒混悬液、10mg/ml空白纳米粒混悬液、100mg/ml空白纳米粒混悬液各0.1ml。观察1周，计数死亡率，1周后处死动物，心、肝、脾、肺、肾、睾丸等脏器以10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色观察形态学改变。结果与对照组相比，注射不同浓度纳米粒的各组小鼠均无一死亡。各脏器组织的形态学检查未见明显异常改变(如图4)。证实纳米粒的具有良好的生物相容性。

实施例5：SDF-1α-PPADT体外活性实验

Transwell小室下室加入分别含A:0ng/ml murine SDF-1α、B:1ng/ml、C:10ng/ml、D:100ng/ml包裹的SDF-1α以及E:100ng/ml SDF-1α标准品的低糖DMEM溶液，上室加入小鼠骨髓间充质干细胞5X10⁴/孔及低糖DMEM共培养6h，去除上室贴壁的骨髓间充质干细胞，以1％甲基紫染色，观察随机10个视野中迁移到下室中的骨髓间充质干细胞数量，并测其在450nm的吸光度，计算各组骨髓间充质干细胞迁移率。结果显示下室仅为DMEM时，共培养6小时迁徙到transwell小室下室的骨髓间充质干细胞几乎为0，而加入100ng/ml的SDF-1α标准品组和100ng/ml处理后的SDF-1α组迁徙到下室的骨髓间充质干细胞之比约为1:0.70。经纳米粒包裹的SDF-1α其生物活性下降，但并未失活。

实施例6：SDF-1-PPADT体内趋化实验 

6周龄雄性C57小鼠100只，于胸背部制备直径8mm全层皮肤缺损模型，分为8组，每组10只，分别每天尾静脉注射A:生理盐水、B:50mg/kg空白PPADT纳米粒、C:5ug/kgSDF-1、D:50mg/kg空白PPADT纳米粒+5ug/kg SDF-1α、E：50mg/kg SDF-1α-PPADT纳米粒,分别于处理后1、3、5、7、10天计算创面收缩率并取创面周围皮肤(如图5)，结果创面收缩率显示(如图6)，愈合速度之比：E>D＝C＝B＝A，证明载药纳米粒有促进创面愈合的作用,而空白纳米粒及静脉注射SDF-1α并不能促进创面愈合。

F:5*10⁵GFP-BMSCs、G:5*10⁵GFP-BMSCs+50mg/kg空白PPADT纳米粒、H:5*10⁵GFP-BMSCs+5ug/kg SDF-1α、I:5*10⁵GFP-BMSCs+50mg/kg空白PPADT纳米粒+5ug/kg SDF-1α、J:5*10⁵GFP-BMSCs+50mg/kg SDF-1-PPADT纳米粒，取创周皮肤组织，做冰冻切片行免疫荧光观察局部GFP-BMSCs数量及外源性来源的CD31阳性细胞数(如图7)。

免疫荧光结果显示，SDF-1α-PPADT实验组GFP标记的CD31阳性细胞明显多于其他组，而其他各组间无明显差异，说明SDF-1α-PPADT有促进骨髓间充质干细胞向创周局部趋化的作用,而空白纳米粒、静脉注射SDF-1α在创周局部并无对骨髓间充质干细胞趋化的作用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (4)

1.一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒，其特征在于，该纳米粒的活性组分为基质细胞衍生因子1α，所用载药纳米材料为硫醇缩酮聚合物，所述纳米粒粒径范围为70nm～130nm。

2.根据权利要求1所述的本发明所述的一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒，其特征在于，所述的硫醇缩酮聚合物，其化学结构如式Ⅰ所示：

3.如权利要求1所述的一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

A、利用苯甲磺酸催化1,4-二甲硫醇苯酚与2,2-二甲氧基丙烷反应合成的硫醇缩酮聚合物；

B、1mg/ml SDF-1αPBS溶液作为内水相，10mg/ml PPADT二氯甲烷作为油相，内水相和油相按1:10体积比，冰浴下间断超声120瓦、15s，形成初乳悬液；将初乳悬液加入同体积的作为外水相的1％胆酸钠溶液中，连续超声200瓦、30s形成复乳悬液；

C、将复乳悬液按1:20体积比，加入0.5％胆酸钠溶液中，4℃500rpm搅拌4小时以去除有机溶剂；梯度离心后收集纳米粒，去离子水重悬，去除溶液中的SDF-1α及胆酸钠，制得SDF-1α-PPADT纳米粒。

4.如权利要求1所述的一种对活性氧敏感的能促创面血管化的纳米粒在制备创面修复药物或材料中的应用。