CN104583411A - 葡萄糖的生产方法 - Google Patents

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Abstract

通过在纤维素和β-葡萄糖苷酶的存在下培养嗜热厌气性微生物，从而生产纤维素酶，将纤维素分解为纤维寡糖等糖类，进而用β-葡萄糖苷酶将所得的纤维寡糖分解为葡萄糖，并使其蓄积于培养基中。另外，通过将嗜热厌气性微生物在淀粉与纤维素的混合物和β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶的存在下培养，从而生产纤维素酶，将淀粉/纤维素混合物分解为葡萄糖，并使其蓄积于培养基中。

Description

葡萄糖的生产方法
技术领域
本发明涉及使用嗜热厌气性微生物将纤维素分解来生产葡萄糖的方法。
背景技术
蔗渣、稻梗、稻谷壳、蘑菇废菌床、堆肥、木材碎屑等纤维素系生物质作为不对粮食生产形成压力的能量和/或化学工业的原料资源而受到了人们关注。特别是在纤维素系生物质向燃料乙醇的转换方面，人们迫切期望开发出一种高效地将发酵原料糖化的技术。
然而，与淀粉相比纤维素系生物质的糖化技术的难度高。其原因在于，作为纤维素系生物质的构成主体的纤维素是具有坚固的晶体结构的难分解性的高分子多糖。
纤维素系生物质的糖化方法中，已知有物理性糖化、化学性糖化以及酶糖化这3种方法。
物理性糖化处理中有球磨机、振动磨或蒸煮爆碎、加压热水处理等物理性地实施糖化的处理，但是物理性处理需要大量能量，因而大多作为化学性糖化和/或酶糖化的前处理而被并用。
化学性糖化处理中有利用碱、酸的处理，自古以来通常使用酸糖化。酸糖化中有浓硫酸糖化法和稀硫酸二阶段糖化法，但是由于均使用硫酸，因此需要进行废弃物处理、降低环境负荷，可以说在低成本化和能量转换效率方面存在限制。
酶糖化与酸糖化相比，具有废液回收、处理的负荷轻、可降低耐化学品设备等设备成本、不引起过度分解且糖的收率高等优点，因而在大量含有淀粉质的生物质的酶糖化方面得到实用化。但是，关于纤维素系生物质，如前所述，纤维素具有晶体结构以及具有半纤维素、木质素包围结晶性纤维素而成的复杂结构，因此与淀粉系相比，酶糖化是极其困难的。
作为可将纤维素系生物质分解的半纤维素酶和/或纤维素酶，人们正在积极地研究着来自需氧性丝状菌木霉属(Trichoderma)微生物的酶(参照专利文献1)。
另外，近年来已清楚，某种厌气性微生物生产酶复合体纤维体(Cellulosome)，其将纤维素高效地分解为纤维寡糖(参照专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-319040号公报
专利文献2：日本特开2011-115110号公报
非专利文献
非专利文献1：Science 333 pp.1279-1282(2011)
发明内容
发明所要解决的课题
在使用来自微生物的纤维素分解酶将纤维素分解的方法中，为了获得如来自木霉属微生物的酶或来自厌气性微生物的纤维体那样的纤维素分解酶，需要进行如下的二阶段步骤的操作：首先，培养微生物获得含有酶的培养液，接着，向含有酶的培养液中添加纤维素进行分解反应。
然而，在产生纤维体的厌气性微生物的情况下，微生物的增殖速度迟缓，细胞密度也低，因而存在为了获得含有酶的培养液而需要很多时间这样的问题。此外，由于作为纤维素分解的终产物的纤维二糖的蓄积抑制纤维素酶的酶活性，因而存在分解反应的后期纤维素分解效率降低这样的问题。
关于来自瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素分解酶，有人指出基质的分解速度迟缓，因而在实用化时需要大量的酶。
鉴于上述或者后述的各种的课题，本发明的目的在于提供一种方法，其不需要获得含有酶的培养液的步骤，即可将纤维素高效地分解，从而制造葡萄糖。
某种微生物特别是嗜热厌气性微生物虽然产生如纤维素分解酶那样的糖酵解酶，但是并不产生β-葡萄糖苷酶，或者即使生产也仅显示非常低的活性。关于这样的产生纤维素分解酶的嗜热厌气性微生物，已知特别是葡萄糖的摄入能力缓慢，其偏好作为纤维素分解酶反应产物的纤维二糖等纤维寡糖并将其作为营养源而用于增殖中。因此，在将产生纤维素分解酶的嗜热厌气性微生物在β-葡萄糖苷酶的共存下培养的情况下，所产生的纤维寡糖和/或纤维二糖迅速地转换为葡萄糖。另一方面，在这些嗜热厌气性微生物中，也确认有葡萄糖利用性能，通常，如果存在葡萄糖则可进行生长并将该葡萄糖消耗。与在嗜热厌气性微生物和β-葡萄糖苷酶共存的情况、将纤维二糖等纤维寡糖用做碳源的情况相比，微生物的增殖有可能变得不良，有可能引起纤维素分解酶的生产降低，使纤维素分解降低或者停止。
本发明人等研究了：将嗜热厌气性微生物在纤维素的存在下培养，利用β-葡萄糖苷酶在培养基中将生成的纤维素分解物即纤维寡糖转换为葡萄糖。原认为即使存在β-葡萄糖苷酶，在热纤梭菌(Clostridium thermocellum)培养基中的纤维素分解速度也与不存在的情况相同是不变的，即分解不良，但是令人惊讶的是知道了，存在β-葡萄糖苷酶时可将纤维素高浓度分解。此外，其分解得到的纤维素的最终分解产物即葡萄糖的大部分未被利用而蓄积在培养基中，本发明人等着眼于此而完成了本发明。
推测嗜热厌气性微生物从培养初期开始，利用通过产生纤维素酶和分解纤维素而生成的纤维二糖、纤维寡糖进行增殖，并研究了如通常那样伴随着菌体增殖而生产酶。然而菌体浓度的增加使得酶生产进展，并且纤维素分解酶在增加时，纤维素分解的速度提高，在共存的β-葡萄糖苷酶的作用下，游离的纤维寡糖迅速地被分解为葡萄糖。可是，嗜热厌气性微生物原本的葡萄糖利用性能缓慢，因而无法将已转换的葡萄糖良好地利用，从而可以解释葡萄糖得以蓄积。
即，本发明通过在将嗜热厌气性细菌与纤维素培养时使β-葡萄糖苷酶存在，从而利用了纤维寡糖转换为葡萄糖的现象与葡萄糖的利用速度停滞的现象的时间差。当产生纤维素分解酶的嗜热厌气性微生物的葡萄糖利用性能缓慢时，则可预见若葡萄糖利用性能缓慢则对微生物增殖和/或酶生产产生负影响，此外葡萄糖通常是对微生物而言非常容易利用的糖源，因此基于上述预见和常识，很难想到如本发明这样微生物不利用葡萄糖而将之蓄积在培养基中，因此这是仅通过目前为止的认识和/或信息无论如何也不能想到的认识。
用于解决课题的手段
即，本发明涉及一种葡萄糖的生产方法，其特征在于，在纤维素的存在下培养嗜热厌气性微生物时使β-葡萄糖苷酶共存。其中，微生物优选为厌气性微生物，进一步优选为可将纤维素、半纤维素分解的嗜热厌气性微生物。
本发明还提供一种葡萄糖的生产方法，其特征在于，在含有淀粉的纤维素系生物质的存在下，使β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶共存来培养嗜热厌气性微生物。
发明效果
通过本发明的葡萄糖的生产方法，能够省略培养嗜热厌气性微生物以获得含有糖酵解酶的培养液和酶溶液的步骤。
特别是，在使用了嗜热厌气性微生物的情况下，可将培养条件设为高的温度条件，因而微生物的污染少，可防止含有葡萄糖的培养基的腐败。
附图说明
图1是表示实施例1的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时不添加β-葡萄糖苷酶的情况下的纤维素的分解效率的曲线图。
图2是表示实施例1的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时添加了β-葡萄糖苷酶的情况下的纤维素的分解效率的曲线图。
图3是表示实施例2的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时不添加β-葡萄糖苷酶的情况下的纤维素的分解效率的曲线图。
图4是表示实施例2的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时添加了β-葡萄糖苷酶的情况下的纤维素的分解效率的曲线图。
图5是表示实施例3的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时添加了β-葡萄糖苷酶的情况下的氨水浸渍稻梗的分解能力和葡萄糖蓄积量的曲线图。
图6是表示实施例3的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时添加了β-葡萄糖苷酶的情况下的杉木浆的分解能力和葡萄糖蓄积量的曲线图。
图7是表示实施例4的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时添加了表面活性剂等的情况下的通过水热前处理稻梗分解而得到的葡萄糖蓄积量的曲线图。
图8是表示实施例6的在具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的培养时添加了β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶的情况下的木薯浆的葡萄糖生产的曲线图。
具体实施方式
以下，一边参照实施例一边详细地说明本发明。
本发明的葡萄糖的制造方法的特征在于，将嗜热厌气性微生物在纤维素和β-葡萄糖苷酶的存在下培养。
嗜热厌气性微生物是厌气性的微生物，是最适生长温度为50℃以上的微生物，优选为产生将纤维素分解为纤维寡糖和/或单糖类的糖酵解酶的嗜热厌气性微生物。已知通常而言，产生糖酵解酶的嗜热厌气性微生物利用通过糖类分解产生的纤维寡糖来进行生长，但对作为单糖的葡萄糖，具有弱的利用性。即，嗜热厌气性微生物是产生糖酵解酶的微生物，更优选为具有弱的葡萄糖利用性的微生物，进一步优选为葡萄糖的摄入速度迟缓的微生物。
以下，将产生糖酵解酶的嗜热厌气性微生物称为具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物。作为这样的微生物，例如可列举出热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)、热解糖梭菌(Clostridium thermolacticum)、解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)、贝茜热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)、奥布斯底安斯热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor obsidiansis)、解纤维素嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter cellulolyticus)、嗜热厌气菌(Anaerocellum thermophilum)、嗜热螺旋菌(Spirochaeta thermophila)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、岸生闪烁杆菌(Fervidobacterium riparium)、海岛闪烁杆菌(Fervidobacterium islandicum)。
具有糖酵解酶分解能力的嗜热厌气性微生物优选为产生纤维体的微生物。作为这样的微生物，可列举热纤梭菌(Clostridium thermocellum)。
β-葡萄糖苷酶是将糖的β-糖苷键分解的酶，优选选择最适反应温度与具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的最适生长温度范围一致的耐热性的酶。通过将嗜热厌气性微生物与耐热性的β-葡萄糖苷酶组合，能够在培养中防止其它种类微生物的污染。
β-葡萄糖苷酶是最适反应温度为45℃以上且70℃以下、优选为50℃以上且70℃以下的具有耐热性的酶，优选使用来自嗜热性微生物的酶。
关于来自嗜热性微生物的β-葡萄糖苷酶，可使用来自热酸菌属(Acidothermus属)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor属)、梭菌属(Clostridium属)、土芽孢杆菌属(Geobacillus属)、喜热裂孢菌属(Thermobifida属)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter属)、高温双孢菌属(Thermobispora属)、热脱硫弧菌属(Thermodesulfovibrio属)、热微菌属(Thermomicrobium属)、高温单孢菌属(Thermomonospora属)、栖热腔菌属(Thermosipho属)、热袍菌属(Thermotoga属)、栖热菌属(Thermus属)、甲苯单胞菌属(Tolumonas属)、密螺旋体属(Treponema属)、Aciduliprofundum属、热杆菌属(Caldivirga属)、除硫球菌属(Desulfurococcus属)、嗜苦菌属(Picrophilus属)、热棒菌属(Pyrobaculum属)、热球菌属(Pyrococcus属)、葡萄热菌属(Staphylothermus属)、硫化叶菌属(Sulfolobus属)、热球菌属(Thermococcus属)、热丝菌属(Thermofilum属)、热原体属(Thermoplasma属)、热变形菌属(Thermoproteus属)、热球形菌属(Thermosphaera属)、热球形菌属(Thermosphaera属)的β-葡萄糖苷酶。
进一步优选为来自嗜热厌气性微生物的β-葡萄糖苷酶，例如有来自布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的酶。除此之外，还可同样地利用假乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)、乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、韦氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)。另外，也可同样地利用来自解木聚糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)、热解糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillusacidophilus)、嗜酸热脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的β-葡萄糖苷酶。
需要说明的是，β-葡萄糖苷酶并不限于上述微生物所生产的酶，也可以是通过基因重组将由大肠杆菌等生产的酶或氨基酸序列的一部分改变而得到的酶，也可以是在上述最适反应温度的范围内具有将β-糖苷键分解的活性的酶。
例如，可使用在β-葡萄糖苷酶中融合有纤维素结合区域(CBM)的嵌合型的β-葡萄糖苷酶。
作为CBM，可使用碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active enzymes Database：http：//www.cazy.org/)中属于糖类结合模块家族分类(Carbohydrate-Binding Module familyclassification)的CBM。优选可使用属于该模块家族分类表中的家族3的CBM。
本发明的生产葡萄糖的方法可以在含有纤维素的培养基中开始培养嗜热厌气性微生物后，添加β-葡萄糖苷酶。优选可以在含有纤维素的培养基中嗜热厌气性微生物的培养开始的数小时后添加β-葡萄糖苷酶。关于培养温度以及培养pH，只要在适于嗜热厌气性微生物的条件下进行即可。β-葡萄糖苷酶可从培养初期起共存于培养基中，也可以在培养中添加于培养基中。
当将嗜热厌气性微生物在含有纤维素的培养基中与β-葡萄糖苷酶一同培养时，纤维素通过微生物所产生的糖酵解酶分解为纤维二糖等纤维寡糖以及单糖类。而后，作为分解产物的纤维寡糖通过β-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。另一方面，嗜热厌气性微生物由于作为主要碳源的纤维寡糖变少，因而变为将葡萄糖作为碳源利用。然而，葡萄糖的消耗速度缓慢，因而考虑葡萄糖在培养基中蓄积。
在糖酵解酶为纤维体的情况下，纤维二糖成为糖类分解活性的抑制物质，但是由于被β-葡萄糖苷酶从培养基中除去，因而糖类分解活性不被抑制而得以维持。
需要说明的是，在本发明中，除了嗜热厌气性微生物所产生的糖酵解酶之外，也可辅助性地使培养基中含有适于培养条件的其它纤维素酶和/或半纤维素酶。
纤维素除了可以为纸等之外，也可以为蔗渣、稻梗、稻谷壳、蘑菇废菌床、堆肥、木材碎屑等含有木质素的纤维素系生物质。其中，含有木质素的纤维素系生物质优选提前进行除去木质素的前处理。关于这样的处理，例如，可以将含有木质素的纤维素系生物质浸渍于氨水和/或氢氧化钠。
在纤维素是纤维素系生物质或除去了木质素的纤维素系生物质的情况下，添加浓度的选自各种蛋白性阻断剂、高分子化合物以及表面活性剂中的1种以上进行培养，这对于提高糖化效率也具有效果。具体而言，作为蛋白性阻断剂，优选使用脱脂奶(skimmed milk)或酪蛋白，表面活性剂优选使用以Tween20或Tween80为代表的非离子性表面活性剂。
当添加蛋白性阻断剂等并在β-葡萄糖苷酶的存在下培养嗜热厌气性微生物时，考虑可抑制糖酵解酶与存在于植物细胞壁的木质素以及木质素-半纤维素复合体、木质素-无机物复合体等除纤维素和半纤维素以外的具有疏水性基团等反应基团的物质的非特异性吸附。
纤维素系生物质中存在大量除纤维素之外还混合存在有淀粉的纤维素系生物质。例如，木薯浆、甜菜的提取残渣和/或其它薯类的淀粉提取后的残渣、提取木薯淀粉后的剩余残留物等。
当由这样的含有淀粉的纤维素系生物质生产葡萄糖时，在除了β-葡萄糖苷酶以外还存在α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的条件下培养嗜热厌气性微生物。
作为淀粉分解酶，通常已知有α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、异淀粉酶(EC3.2.1.68)。对淀粉分解特别重要的是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的作用。α-淀粉酶是将淀粉、糖原的1,4-α-键不规则地切断而产生多糖乃至寡糖的酶。为了将具有α-葡糖苷键的寡糖进一步变为葡萄糖，需要葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶正式命名为葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶，别名为1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶、外切1,4-α-葡萄糖苷酶、γ-淀粉酶、溶酶体α-葡萄糖苷酶或者淀粉葡糖苷酶。葡糖淀粉酶将糖链的非还原末端的1,4-α键分解而产生葡萄糖。亦知也有切断1,6-α键的α-淀粉酶。
将嗜热厌气性微生物在β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶的存在下、在含有淀粉混合存在的纤维素系生物质的培养基中培养时，淀粉被淀粉酶、葡糖淀粉酶分解而变为葡萄糖，并且纤维素被微生物所产生的糖酵解酶分解为纤维二糖等纤维寡糖和单糖类。而后，作为分解产物的纤维寡糖被β-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。另一方面，嗜热厌气性微生物由于作为主要碳源的纤维寡糖变少而变为将葡萄糖作为碳源利用。然而，由于葡萄糖的摄入速度缓慢，因而考虑葡萄糖在培养基中蓄积。
淀粉酶和葡糖淀粉酶优选选择最适反应温度与具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物的最适生长温度范围一致的酶。即，优选具有耐热性的淀粉酶和葡糖淀粉酶。通过将具有耐热性的淀粉酶和葡糖淀粉酶与具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物组合，能够在培养中防止其它种类微生物的污染，因而是有利的；所述具有糖类分解能力的嗜热厌气性微生物以与该淀粉酶或葡糖淀粉酶的耐热性同程度的温度为最适生长温度。
淀粉酶和葡糖淀粉酶是具有45℃以上且70℃以下、优选具有50℃以上且70℃以下的耐热性的酶，可使用来自嗜热性微生物的酶。
关于具有耐热性的淀粉酶或葡糖淀粉酶，可使用来自芽孢杆菌属(Bacillus属)、热酸菌属(Acidothermus属)、厌氧纤维菌属(Anaerocellum属)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor属)、梭菌属(Clostridium属)、土芽孢杆菌属(Geobacillus属)、喜热裂孢菌属(Thermobifida属)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter属)、高温双孢菌属(Thermobispora属)、热脱硫弧菌属(Thermodesulfovibrio属)、热微菌属(Thermomicrobium属)、高温单孢菌属(Thermomonospora属)、栖热腔菌属(Thermosipho属)、热袍菌属(Thermotoga属)、栖热菌属(Thermus属)、甲苯单胞菌属(Tolumonas属)、密螺旋体属(Treponema属)、Aciduliprofundum属、热杆菌属(Caldivirga属)、除硫球菌属(Desulfurococcus属)、嗜苦菌属(Picrophilus属)、假单胞菌属(Pseudomonas属)、热棒菌属(Pyrobaculum属)、热球菌属(Pyrococcus属)、葡萄热菌属(Staphylothermus属)、硫化叶菌属(Sulfolobus属)、乳酸杆菌属(Lactobacillus属)、链球菌属(Streptococcus属)、热球菌属(Thermococcus属)、热丝菌属(Thermofilum属)、热原体属(Thermoplasma属)、热变形菌属(Thermoproteus属)、热球形菌属(Thermosphaera属)、热球形菌属(Thermosphaera属)的酶。
更详细而言，作为来自嗜热性微生物的具有耐热性的淀粉酶或葡糖淀粉酶，例如有来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、糖解梭菌(Clostridium saccharolyticum)、植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentans)、热解淀粉梭菌(Clostridium thermoamylolyticum)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脱氮土芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、喜热噬油土芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterbrockii)的酶。除此之外，还可同样地利用假乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterpseudethanolicus)、乙醇嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、韦氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii)。
另外，也可同样地利用来自解木聚糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumxylanolyticum)、热解糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)、嗜酸热脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜热厌氧菌(Anaerocellum thermophilum)的β-葡萄糖苷酶。
关于具有耐热性的淀粉酶或葡糖淀粉酶，除了上述微生物以外，还可以是来自Pyrococcus、Thermococcus属等古生菌(古细菌)，来自黑曲霉菌米根霉(Rhizopus oryzae)、曲霉菌黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)的酶，另外，也可以是从虽然为常温菌但也可生产耐热性淀粉酶和葡糖淀粉酶的丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putid)、乳酸杆菌属(Lactobacillus属)微生物获得的酶。
另外，也可以是通过基因重组将从大肠杆菌等生产的酶或氨基酸序列的一部分改变而得到的酶，也可以是在上述最适反应温度的范围内具有将β-糖苷键分解的活性的酶。
需要说明的是，可以在嗜热厌气性微生物消耗纤维素后添加纤维素，反复进行葡萄糖的生产，从而连续地生产葡萄糖。例如，可以设定为通过半分批培养补充嗜热厌气性微生物所消耗的纤维素。
如上所述，在β-葡萄糖苷酶和淀粉酶、葡糖淀粉酶的存在下培养嗜热厌气性微生物的葡萄糖的生产方法中，在培养时，添加适当浓度的选自各种蛋白性阻断剂、高分子化合物以及表面活性剂中的1种以上进行培养，这对于提高糖化效率也具有效果。
具体而言，作为蛋白性阻断剂，可列举出脱脂奶、酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、聚蛋白胨等，其中含有酪蛋白的蛋白性阻断剂优异。另外表面活性剂可以是阴离子系、阳离子系、两性、非离子性表面活性剂中的任一种，但优选为非离子性表面活性剂。特别优选使用以Tween20或Tween80为代表的非离子性表面活性剂。另外在高分子化合物中，二醇类良好，可利用聚乙二醇(PEG)200以上的二醇类。特别优选聚乙二醇4000～6000。
当添加蛋白性阻断剂等并在β-葡萄糖苷酶的存在下培养嗜热厌气性微生物时，考虑可抑制糖酵解酶与植物细胞壁所具有的木质素以及木质素-半纤维素复合体、木质素-无机物复合体等除纤维素和半纤维素以外的具有疏水性基团等反应基团的物质的非特异性吸附。
以下，列举实施例详细地说明本发明。需要说明的是，本发明并不限于以下所示的实施例。
实施例1
[β-葡萄糖苷酶的制备]
制作嗜热厌气性微生物布氏嗜热厌氧杆菌ATCC33075(Thermoanaerobacter brockii)(以美国菌株保藏中心的β-葡萄糖苷酶为基础得到的重组β-葡萄糖苷酶(以下称为CglT)。
来自布氏嗜热厌氧杆菌的基因组DNA按照以下方法提取。
使用含有0.5％纤维二糖的BM7CO-CB液体培养基培养布氏嗜热厌氧杆菌，然后在4℃下以10,000转、5分钟进行离心分离，回收菌体。为了使得到的菌体溶菌，将10％SDS(月桂基硫酸钠)按照最终浓度达到0.5％的方式添加，并且将蛋白酶K(1mg/ml)溶液按照达到5μg/ml的方式添加，在37℃下使其反应1小时。进而将10％十六烷基三甲基溴化铵-0.7M氯化钠溶液按照达到1％浓度的方式添加，在65℃下使其反应10分钟，然后加入等量的氯仿/异戊醇溶液并且充分地搅拌，通过15,000转、5分钟离心分离获得水层。
向该水层中添加等量的苯酚/氯仿/异戊醇混液，搅拌并再次通过15,000转、5分钟离心分离获得水层。向该水层中加入0.6倍容量的异丙醇，使基因组DNA析出，再次通过离心分离制备基因组DNA。用70％乙醇将该基因组DNA洗涤、干燥。
关于BM7CO-CB培养基的组成，由磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾2.9g/L、尿素2.1g/L、酵母提取物6.0g/L、碳酸钠4g/L、半胱氨酸盐酸盐0.05g/L、矿物质溶液(将5g的MgCl2·6H2O、0.75g的CaCl2·2H2O、0.0063g的FeSO4·6H2O溶解于水4ml中)0.2ml制备。另外，向培养基中将纤维二糖按照达到5g/L的方式加入作为碳源。将最终的培养基的pH调整为7.0左右。
关于Cg1T，使用上述制备的基因组DNA，合成寡聚核苷酸引物CglTF(如序列号1所示：5’-CGCGGATCCGGCAAAATTTCCAAGAGAT-3’)和CglTR(如序列号2所示：5’-ATTGCTCAGCATCTTCGATACCATCATC-3’)，通过PCR得到约1.4千碱基对(kilobase)长的双链扩增DNA序列。将扩增的CglT基因序列示于序列号3。
为了将设计的寡聚核苷酸引物CglTF和CglTR插入到大肠杆菌表达载体中，附加有限制性内切酶(restriction enzyme)位点BamHI和Bpu1102位点。其中，关于布氏嗜热厌氧杆菌ATCC33075的β-葡萄糖苷酶CglT基因序列，可通过国立生物技术信息中心(NBIC)的主页(http：//www.Ncbi.nlm.nih.gov/)获得基因序列(GenBank登录序号；CAA91220.1)。
关于PCR，利用ExTaq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.制)进行16srRNA基因的扩增。关于PCR的条件，在将98℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟循环30次的条件下进行扩增。
关于PCR产物，在0.8％琼脂糖凝胶电泳中确认到扩增得到的条带后，使用QIAGEN PCR精制试剂盒(QIAGEN公司制)进行精制。所精制的PCR产物使用BamHI(Takara Bio Inc.制)和Bpu1102(Takara Bio Inc.制)在37℃下进行限制性内切酶处理过夜。
限制性内切酶处理完成的PCR产物再次通过0.8％琼脂糖凝胶电泳与限制性内切酶分解产物分离，从凝胶中切出目标条带，利用凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)进行精制。
为了使CglT基因在大肠杆菌中表达，也使用pET19b表达载体(Merck公司制)。该载体设计为：在想表达的目标蛋白的N末端侧融合有6个残基的组氨酸标签。关于pET19b表达载体，同样地使用BamHI和Bpu1102，在37℃下进行限制性内切酶处理过夜。限制性内切酶处理后，为了进行限制性内切酶酶切位点的脱磷酸，将碱性磷酸酶(Takara Bio Inc.制)在50℃下处理1小时。反复进行苯酚/氯仿提取，使碱性磷酸酶失活，然后进行乙醇沉淀处理，回收限制性内切酶处理完成的pET19b表达载体。
为了构建CglT表达载体，用T4连接酶(Takara Bio Inc.制)将上述限制性内切酶处理完成的CglT基因和pET19b表达载体在16℃下孵育过夜，使其连接。将该表达载体CglT-pET19一次转化到大肠杆菌JM109中，用含有50μg/ml氨苄青霉素钠和1.5％琼脂的Luria-Bertani培养基(LB培养基)在37℃下培养过夜。
LB培养基的组成如下所示。细菌蛋白胨1g/L、氯化钠1g/L、酵母提取物1g/L并将最终的培养基的pH调整为7.0左右。
从生长出的菌落中选择具有目标表达载体CglT-pET19的克隆。选择是使用质粒提取试剂盒(QIAGEN公司制)从大肠杆菌克隆中提取表达载体CglT-pET19，然后利用上述引物并采用BigDye(注册商标)Terminator v3.1(Applied Biosystems公司)、PRISM(注册商标)3100Genetic Analyzer(Applied Biosystems公司制)或者PRISM(注册商标)3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems公司制)读取DNA序列。
为了确认所读取的基因序列是否正确，通过国立生物技术信息中心(NBIC)的主页，使用所得的DNA序列数据进行同源性(homology)检索，确定正确性。为了使具有正确的基因序列的表达载体CglT-pET19大量地表达CglT蛋白，再次转化到大肠杆菌BL21(Merck公司制)中，得到蛋白大量表达的大肠杆菌克隆。
为了获得CglT，将具有表达载体CglT-pET19的大肠杆菌BL21在含氨苄青霉素钠的LB培养基中进行37℃、4小时的培养，然后加入1mM浓度的异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)并进一步进行12小时的培养。
具有CglT-pET19的大肠杆菌BL21(DE3)通过离心分离(8,000转、4℃、10分钟)回收菌体。将所回收的菌体一次地在－80℃下冷冻过夜，然后悬浮于溶菌缓冲液(50mM的磷酸缓冲液、300mM的氯化钠、10mM的咪唑、pH为8.0)中，然后在冰中利用超声波破碎机进行破碎。将得到的溶菌混浊液离心分离，将透明的溶菌液与沉淀的未破碎菌体分离，然后仅将溶菌液回收并用0.45μm过滤器过滤。
使溶菌液通过镍琼脂糖凝胶色谱柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶；QIAGEN公司制)，得到组氨酸标签融合CglT。进而使进行了洗脱的CglT通过脱盐色谱柱(Bio-Rad公司制)进行精制。关于组氨酸标签融合CglT的蛋白量测定，在根据需要用蒸馏水稀释后，利用BCA/蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific公司制)进行测定。蛋白的标准曲线使用牛血清白蛋白制作。
将CglT的氨基酸序列示于序列号4。
关于β-葡萄糖苷酶的活性测定，按照Wood,WA.,Kellog,S.T.,1988.Methods inEnzymology.160,New York：Academic Press.中记载的，以对硝基苯酚半乳糖吡喃糖苷为基质，测定通过酶反应而游离出的对硝基苯酚量，由此算出活性(单位)。将在一分钟内生成1μ摩尔对硝基苯酚的量定义为1单位(U)的酶活性。
[热纤梭菌的前培养]
使用含有微晶纤维素10g/L的BM7CO-CL培养基将热纤梭菌JK-S14株(NITE P-627)在60℃下培养4天。
[利用热纤梭菌和β-葡萄糖苷酶的葡萄糖的生产]
在使用上述前培养得到的热纤JK-S14株并使用含有高浓度结晶性纤维素(100g/L)的BM7CO培养基时，测定不添加β-葡萄糖苷酶时和同时添加β-葡萄糖苷酶(CglT、10个单位)时培养液中的纤维素残留量、纤维二糖生成量、葡萄糖生成量的经时性变化。
关于培养液中的纤维素残留量，在培养期间中，对充分悬浮了的培养液经时性地进行逐个0.5ml的取样，向预先测定了重量的0.45μm的滤杯中加入样品的一部分。对该滤杯进行离心分离(13,000rpm、5分钟、4℃)，将培养液和残渣的纤维素分离。将含有纤维素残渣的滤杯在70℃下干燥2天，再次测定滤杯的重量，通过从空的滤杯的重量中减去而算出残留的纤维素残量。
关于培养液中的纤维二糖和葡萄糖浓度的测定，使用取样并用滤杯进行离心分离而得到的上述培养液，通过使用了差示折射检测器的高效液相色谱法(岛津制作所制，Prominence)测定培养液中的纤维二糖和/或葡萄糖，所述差示折射检测器使用Aminex HPX-87P和AminexHPX-87H色谱柱(Bio-Rad公司制)。关于测定得到的葡萄糖量和纤维二糖量，以所使用的纤维素重量为参考，算出按葡萄糖和纤维二糖换算的总糖量并将其作为100％量。
将其结果分别示于图1和图2。图中，实线经时性地表示纤维素的消耗，黑四边形符号(■)表示培养液中的葡萄糖含量，黑圆点符号(●)表示培养液中的纤维二糖含量。
如图1所示，在热纤梭菌JK-S14株培养时不添加β-葡萄糖苷酶的情况下，最终纤维素残留接近约6％。另外在培养期间中，几乎未见葡萄糖的游离，纤维二糖虽然在培养液中少许地存在，但是保持在1％以下的非常低的量。
如图3所示，在热纤梭菌JK-S14株培养时同时添加了β-葡萄糖苷酶的情况下，10％纤维素最终全部被分解而残留量微少。此外可知，培养液中的游离纤维二糖量保持为低的状态，但是游离葡萄糖量在培养第2天以后急剧地升高。该结果表明，热纤梭菌JK-S14所生产的含有纤维体的纤维素酶虽然将纤维素分解，但是β-葡萄糖苷酶将从纤维素游离的纤维二糖迅速地转换为葡萄糖。另外，葡萄糖对纤维体等纤维素酶的活性抑制的影响低，因而纤维素分解反应与残留有纤维二糖的状态相比有所进展。另一方面，根据游离生成的葡萄糖量进行换算时，葡萄糖的约1.5％～2％在热纤梭菌JK-S14的生长等中被消耗，但是约8％的葡萄糖蓄积于培养液中。这表明，热纤梭菌的葡萄糖消耗速度极其迟缓，可清楚其是因为纤维素分解反应比葡萄糖消耗更早地进行所致。其结果可知，在以纤维素基质为碳源培养热纤梭菌的情况下，若同时添加β-葡萄糖苷酶时，则可在该培养液中蓄积葡萄糖。
实施例2
解糖热解纤维素菌
[解糖热解纤维素菌的前培养]
使用含有微晶纤维素10g/L的BM7CO-CL培养基将解糖热解纤维素菌ATCC 43494(美国菌株保藏中心)在60℃下培养4天。
[利用解糖热解纤维素菌和β-葡萄糖苷酶的葡萄糖的生产]
在使用上述前培养得到的解糖热解纤维素菌ATCC 43494株、并使用含有高浓度结晶性纤维素(50g/L)的BM7CO培养基时，测定不添加β-葡萄糖苷酶时和同时添加β-葡萄糖苷酶(CglT、10个单位)时培养液中的纤维素残留量、纤维二糖生成量、葡萄糖生成量的经时性变化。
关于培养液中的纤维素残留量，与实施例1同样地，在培养期间中，对充分悬浮了的培养液经时性地进行逐个0.5ml的取样，向预先测定了重量的0.45μm的滤杯中加入样品的一部分。对该滤杯进行离心分离(13,000rpm、5分钟、4℃)，将培养液和残渣的纤维素分离。将含有纤维素残渣的滤杯在70℃下干燥2天，再次测定滤杯的重量，通过从空的滤杯的重量中减去而算出残留的纤维素残量。
关于培养液中的纤维二糖和葡萄糖浓度的测定，与实施例1同样地，使用取样并用滤杯进行离心分离而得到的培养液，通过高效液相色谱法(岛津制作所制，Prominence)测定培养液中的纤维二糖和/或葡萄糖。关于测定得到的葡萄糖量和纤维二糖量，以所使用的纤维素重量为参考，算出按葡萄糖和纤维二糖换算的总糖量并将其作为100％量。
将其结果分别示于图3和图4。图中，实线经时性地表示纤维素的消耗，黑四边形符号(■)表示培养液中的葡萄糖含量，黑圆点符号(●)表示培养液中的纤维二糖含量。
如图3所示，在解糖热解纤维素菌ATCC 43494株培养时不添加β-葡萄糖苷酶的情况下，最终纤维素残留约1.5％。另外在培养期间中，可见葡萄糖的产生。这考虑在解糖热解纤维素菌培养液中存在β-葡萄糖苷酶活性。另一方面，纤维二糖在培养液中也少许存在，但是保持在1％以下的非常低的量。
如图4所示，与解糖热解纤维素菌ATCC 43494株培养时不添加β-葡萄糖苷酶的情况相比，培养液中的葡萄糖的蓄积明显增加。该结果表明，以纤维素基质为碳源培养解糖热解纤维素菌的情况下，当添加β-葡萄糖苷酶时，可在培养液中蓄积葡萄糖。5％的纤维素最终全部被分解而残留量微少。培养液中的游离纤维二糖量保持为低的状态，但是可知葡萄糖量在培养第3天以后急剧地升高。最终来自5％的纤维素的3.5％的葡萄糖蓄积于培养液中。该结果表明，解糖热解纤维素菌所生产的纤维素酶将纤维素分解进行增殖，同时表明β-葡萄糖苷酶将由纤维素分解生成的纤维二糖迅速地转换为葡萄糖。可知，根据所生成的葡萄糖量进行换算时，约3成的葡萄糖量在生长中被消耗。这表明，解糖热解纤维素菌ATCC 43494株也同样地葡萄糖消耗速度极其迟缓，可清楚其是因为纤维素分解反应比葡萄糖消耗更早地进行所致。
实施例3
为了确认即使在使用纤维素系生物质作为碳源的情况下也在培养液中蓄积葡萄糖，使用经氨水浸渍处理的前处理稻梗以及经碱蒸解和漂白处理的杉木碎屑进行了试验。
氨水浸渍是向干燥稻梗10g中加入10倍量的28％氨水溶液，放入密闭容器在60℃下放置7天。其后，用蒸馏水反复充分地洗涤直到变为中性，挤掉水后，制成氨水浸渍前处理稻梗样品。为了测定氨水浸渍前处理稻梗的总糖成分和/或量，通过硫酸水解将稻梗水解，通过高效液相色谱法对所得的水解液进行测定。
关于碱蒸解处理杉木浆的制备，按照氢氧化钠达到23％的方式在杉木碎屑1g中加入氢氧化钠溶液，在耐压容器中在170℃下反应3小时。其后，充分地水洗，用亚氯酸(相对于单位木浆为3.5％)在60℃下进行30分钟的漂白处理。进而用相对于杉木浆1g为4％的氢氧化钠在60℃下进行30分钟处理，反复水洗直至成为中性。为了测定漂白杉木浆的总糖成分和/或量，通过硫酸水解制备水解液，然后通过高效液相色谱法进行测定。
将热纤梭菌JK-S14株接种于按干燥重量计含有5％(重量％)氨水浸渍稻梗或杉木漂白木浆的BM7CO培养基，同时添加β-葡萄糖苷酶，在60℃进行培养。经时性(随时间的推移)地进行取样并测定残留于培养液中的稻梗的重量和葡萄糖量。
图5示出了，将β-葡萄糖苷酶添加于按干燥重量计含有5％氨水浸渍稻梗的BM7CO培养基，培养热纤梭菌JK-S14株时培养液中的稻梗残留量和葡萄糖蓄积量。实线经时性地表示稻梗的培养液中的残留量，黑四边形符号(■)表示培养液中的葡萄糖蓄积量。
图6示出了，将β-葡萄糖苷酶添加于按干燥重量计含有5％杉木漂白木浆的BM7CO培养基，培养热纤梭菌JK-S14株时培养液中的稻梗残留量和葡萄糖蓄积量。实线是经时性地表示稻梗的培养液中的残留量的曲线。黑四边形符号(■)表示培养液中的葡萄糖蓄积量。
从图5和图6可知，从培养第1天起可见培养液中的葡萄糖浓度升高，在氨水浸渍稻梗的情况下(参照图5)，在培养液中蓄积了约2.5％的葡萄糖，和在杉木漂白木浆的情况下(参照图6)，在培养液中蓄积了约4％葡萄糖。与此同时，培养液中的稻梗、杉木漂白木浆残量减少。
关于氨水浸渍稻梗的纤维素含量，单位干燥重量的60％为纤维素。另外根据水解后的HPLC分析可知，杉木漂白木浆的干燥重量的90％为纤维素。另一方面表明，当测定残留的稻梗、漂白杉木浆中的纤维素含量时，最终残渣中不含有纤维素，若考虑游离的葡萄糖量和热纤梭菌JK-S14株的消耗量，则稻梗和漂白杉木浆中所含的纤维素被利用了100％。
为了研究是否可进一步提高纤维素浓度而蓄积高浓度的葡萄糖，在氨水浸渍稻梗和漂白杉木浆被分解且葡萄糖蓄积量达到平衡状态的时间点(分别为第5天)，将氨水浸渍稻梗或漂白杉木浆分别按干燥重量计再次追加5％。将结果示于图5和图6。再添加纤维素后，纤维素的残留量急剧减少，并且发生葡萄糖蓄积。可知，关于纤维素再添加后的葡萄糖蓄积量，可见具有与初次分解时得到的葡萄糖的蓄积量大致同样的倾向，可知最终，作为葡萄糖量，在氨水浸渍稻梗的情况下，可蓄积约5％，在漂白杉木浆的情况下可蓄积约8％。
另外，根据此结果可知，纤维素分解后，即使进一步添加纤维素，也可反复进行葡萄糖的生产。
实施例4
在为如上述Sigmacell那样纯粹的纤维素的情况下，即使为10％的浓度也可不被抑制地完全分解。另一方面可知，在使用了上述稻梗等草本系生物质、杉木等木质系生物质的情况下，即使进行如木质素除去那样的前处理，也会干扰残留的半纤维素和/或木质素，若从最初即添加高浓度基质，则糖化效率显著降低。通过最近的研究可知，这是由于基质与酶的非特异性吸附、由其所导致的酶的失活、进而酶彼此之间在纤维素表面的拥塞现象导致的(非专利文献1)。作为消除该现象的方法，已知当添加表面活性剂、涂布剂或高分子化合物等时酶的糖化能力提高。然而，在热纤梭菌培养时添加β-葡萄糖苷酶的情况下，添加上述药剂带来的效果并不明显。已知，特别是表面活性剂作为将微生物的细胞膜、细胞壁溶解的药剂而用于DNA和/或蛋白质提取时，对微生物具有毒性。
因此，对使用非离子性表面活性剂对水热前处理稻梗是否具有效果进行试验。其中，水热前处理稻梗与使用了碱的前处理相比，变得不易糖化。
关于水热前处理稻梗的制备，向干燥稻梗10g中加入3倍量的蒸馏水，放入密闭容器使其在170℃反应12小时。其后，用蒸馏水反复充分地洗涤直到变为中性，挤掉水后，制成水热前处理稻梗样品。其中，为了测定该水热前处理稻梗的总糖成分和/或量，通过硫酸水解来制备水解液，然后通过高效液相色谱法进行测定。
使用酪蛋白(和光纯药株式会社制)作为涂布剂，使用Tween20(和光纯药株式会社制)作为表面活性剂，并且使用PEG6000(和光纯药株式会社制)作为高分子化合物。
与实施例1同样地，在热纤梭菌JK-S14株培养时添加β-葡萄糖苷酶，并且每1g水热前处理稻梗添加0.025g的酪蛋白、0.05g的Tween20或0.025g的PEG6000，开始培养。
图7是表示在培养基中使用水热前处理稻梗10％(干燥重量％)培养热纤梭菌时，添加了β-葡萄糖苷酶和涂布剂、表面活性剂或高分子化合物的情况下的糖化的曲线图。
图中的黑菱形符号(◆)表示没有添加时、黑圆点符号(●)表示添加酪蛋白时、黑三角符号(▲)表示添加PEG6000时、黑四边形符号(■)表示添加了Tween20时的从水热前处理稻梗游离的葡萄糖量。已知含有的水热前处理稻梗的纤维素浓度为约40％。因此100％糖化时游离的葡萄糖浓度为约4％。
没有加入添加剂的情况下，水热前处理稻梗时可见1.4％的葡萄糖在培养基中蓄积。因此可知，至少糖化效率为35％，但是酪蛋白添加物时为2.1％的葡萄糖蓄积，PEG6000添加时为2.7％的葡萄糖蓄积，Tween20添加时为2.9％的葡萄糖蓄积，糖化效率分别为52.5％、67.5％、72.5％，葡萄糖蓄积量和糖化效率均显著地升高。可知，特别是添加高分子化合物、表面活性剂时具有高的效果。
因此还同时可知，在培养热纤梭菌时，通过同时添加β-葡萄糖苷酶和涂布剂、表面活性剂或高分子化合物，能够飞跃性地提高来自纤维素的葡萄糖生产、在培养液中的蓄积。
实施例5
将序列号5所示的热纤梭菌JK-S14(NITE BP-627)株的CBM与CglT融合而制作嵌合β-葡萄糖苷酶(以下称为CBM融合CglT)。
在设计CBM融合CglT时，分别制成了将CBM融合于N末端侧的类型(以下表示为CBM-CglT)和将CBM融合于C末端侧的类型(以下表示为CglT-CBM)。
[CBM-CglT的制作]
在制成CBM-CglT时，CBM的扩增使用了寡聚核苷酸引物CBMF1(如序列号6所示：5’-CGCGGATCCGGTTGGCAATGCAACACCG-3’)和CBMFusionN(如序列号7所示：5’-ACGAAATCTCTTGGAAATTTTGCATTCGGATCATCTGACGGCGG-3’)。
按照对寡聚核苷酸引物CBMF1附加BamHI的限制性内切酶位点的方式进行了设计，并且按照使CBMFusionN部分包含CglT的N末端氨基酸序列的方式进行了设计。
将热纤梭菌JK-S14株(NITE BP-627)的基因组DNA作为模板，通过PCR对CBM基因片段进行了扩增。将扩增的CBM的基因序列示于序列号8。
在制成CglT时，使用了引物CglTFusion(N)(如序列号9所示：5’-CCGCCGTCAGATGATCCGAATGCAAAATTTCCAAGAGATTTCGTT-3’)和CglTR(如序列号10所示)。
关于引物CglTFusion(N)，以将CBM的C末端侧进行了部分重复的方式设计了引物。使用分别扩增的CBM基因(在3’侧包含编码CglT的N末端氨基酸序列的基因)和CglT基因(在5’侧包含编码CBM的C末端氨基酸序列的基因)作为模板，使用寡聚核苷酸引物CBMF1和CglTR进行了PCR反应。
通过PCR反应得到了约1.9kb的CBM-CglT的DNA片段(序列号11)。
[CglT-CBM的制作]
在制作将CBM融合于C末端侧而得到的类型CglT-CBM时，CglT基因的扩增使用了寡聚核苷酸引物CglTF(序列号1)和CglTR-Fusion(C)(如序列号12所示：5’-CGGTGTTGCATTGCCAACATCTTCGATACCATCATC-3’)。
对于寡聚核苷酸引物CglTR-Fusion(C)，以将CBM的N末端侧进行部分重复的方式设计了寡聚核苷酸引物。
在CBM基因向C末端侧扩增时，使用了寡聚核苷酸引物CBM3F-Fusion(C)(如序列号13所示：5’-GATGATGGTATCGAAGATGTTGGCAATGCAACACCG-3’)和寡聚核苷酸引物CBM3R(如序列号14所示：5’-ATTGCTCAGCATTCGGATCATCTGACGGCGGTAT-3’)。
对于寡聚核苷酸引物CBM3F-Fusion(C)，以将编码CglT的C末端侧的氨基酸序列的基因进行部分重复的方式进行了设计。
按照赋予限制性内切酶Bpu1102的酶切位点的方式设计了寡聚核苷酸引物CBM3R。
使用分别扩增的CglT基因(在3’侧包含编码CBM的C末端氨基酸序列的基因)和CBM基因(在5’侧包含编码CglT的N末端氨基酸序列的基因)作为模板，使用寡聚核苷酸引物CglTF和CBM3F-Fusion(C)进行PCR反应。
PCR的结果获得了在融合了CglT和CBM的情况下得到的约2kb的DNA片段(序列号15)。
将由PCR得到的1个融合基因分别用BamHI和Bpu1102的限制性内切酶切断，然后进行精制，插入到pET19b的BamHI和Bpu1102限制性内切酶位点间，制成CBM融合CglT表达质粒。将2个表达质粒导入大肠杆菌BL21并进行转化，分别得到了表达株。
为了确认融合了CBM的β-葡萄糖苷酶的一般特征，使各重组蛋白表达并进行了精制。所精制的蛋白两者皆为在N末端侧附加有组氨酸标签的结构，因而与上述记载的重组CglT同样地在镍琼脂糖色谱柱中进行了精制直至在SDS-PAGE中成为单一条带。
为了测定精制的CBM融合型β-葡萄糖苷酶的纤维素结合能力，对使用了纤维素的结合能力进行了试验。关于纤维素结合能力，使用精制蛋白0.2mg，与含有10mg Avicel的50mM乙酸钠缓冲液(pH为6.0)混合，在4℃下放置过夜。其后，通过离心分离将上清与沉淀(即纤维素)分离，然后用50mM乙酸钠缓冲液(pH为6.0)进行3次洗涤。通过再次离心分离将沉淀回收后，用50mM乙酸钠缓冲液(pH为6.0)悬浮，供于SDS-PAGE。
在与CglT相比的情况下，CBM-CglT和CglT-CBM均在沉淀级分中可见与CglT相同的条带。在上清和缓冲液洗涤级分中可见CglT，因而可知该融合了的CBM基因具有纤维素结合能力并且在CglT内发挥功能。
另外，为了确认β-葡萄糖苷酶活性是否发生变化，测定了CBM-CglT和CglT-CBM的β-葡萄糖苷酶活性。
β-葡萄糖苷酶的活性测定按照Wood,WA.,Kellog,S.T.,1988.Methods in Enzymology.160,New York：Academic Press.中记载的，将对硝基苯酚半乳糖吡喃糖苷作为基质，测定通过酶反应而游离的对硝基苯酚量，由此算出活性(单位)。将在一分钟内生成1μ摩尔对硝基苯酚的量定义为1单位(U)的酶活性。将结果示于表1。
表1
CglT显示出25U/mg蛋白质的非常高的活性，相对于此，关于CBM融合型的CglT，在CBM-CglT时为4U/mg蛋白，在CglT-CglT时为2U/mg蛋白，导致了剧烈的β-葡萄糖苷酶活性的降低。考虑这是因为，融合了CBM导致立体结构变化从而对酶催化剂部分造成了影响。
将CMB-CglT和CglT-CBM替换成CglT，使用热纤梭菌JK-S14株，分别在与实施例1相同的培养条件下对纤维素的分解和葡萄糖的蓄积进行研究，结果确认了在培养基中葡萄糖蓄积。
实施例6
为了确认即使是如含有淀粉那样的纤维素系生物质，葡萄糖也在培养液中蓄积，使用木薯浆(淀粉提取后的残渣)进行了试验。
用30℃的温水将冷冻生木薯浆解冻，将其用60℃的干燥机吹掉水分干燥，然后保存。将热纤梭菌JK-S14株接种于按干燥重量计含有5％(质量％)的木薯浆的BM7CO培养基，同时添加β-葡萄糖苷酶(10个单位)、α-淀粉酶(Bacillus amyloliquefaciens：Sigma·Aldrich公司制，10个单位)和来自热纤梭菌的重组型葡糖淀粉酶(10个单位)，在60℃进行培养。经时性地进行取样，测定残留于培养液中的葡萄糖量。使用总淀粉测定试剂盒(Megazyme公司制)测定糖化前的木薯浆中的淀粉量，结果为63.5质量％(基于干燥木薯浆)。另外将该经脱淀粉的纤维素纤维性残渣一次地在上述条件下干燥，然后进行测定，结果为30.5质量％(基于干燥木薯浆)。
[葡糖淀粉酶的制备]
制成以热纤梭菌JK-S14株的葡糖淀粉酶为基础的重组葡糖淀粉酶(以下称为CgA)。使用含有0.5％纤维二糖的BM7CO-CB液体培养基，与上述从布氏嗜热厌氧杆菌提取基因组DNA的方法同样地提取热纤梭菌JK-S14株的基因组DNA。
关于CgA，使用上述制备的基因组DNA，合成寡聚核苷酸引物CgAF(如序列号16所示：5’-CGCGGATCCGGCGAACACATACTTT-3’)和CgAR(如序列号17所示：5’-AAAGAGGCGGGGGTTTTAGTCGACCGCA-3’)，通过PCR获得约1.4千碱基对长的双链扩增DNA序列。将扩增的CglT基因序列示于序列号18。
关于设计的寡聚核苷酸引物CgAF和CgAR，为了插入到大肠杆菌表达载体中，附加有限制性内切酶位点BamHI和SalI位点。其中，关于热纤梭菌的葡糖淀粉酶CgA基因序列，可通过国立生物技术信息中心(NBIC)的主页(http：//www.Ncbi.nlm.nih.gov/)获得基因序列(GenBank登录序号：YP_001038201)。
关于PCR，利用ExTaq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.制)进行16srRNA基因的扩增。关于PCR的条件，在将98℃1分钟、55℃1分钟、72℃分钟循环30次的条件下进行扩增。
关于PCR产物，在0.8％琼脂糖凝胶电泳中确认到扩增得到的条带后，使用QIAGEN PCR精制试剂盒(QIAGEN公司制)进行精制。所精制的PCR产物使用BamHI(Takara Bio Inc.制)和Sal I(Takara Bio Inc.制)在37℃下进行限制性内切酶处理过夜。
限制性内切酶处理完成的PCR产物再次通过0.8％琼脂糖凝胶电泳与限制性内切酶分解产物分离，从凝胶中切出目标条带，利用凝胶提取试剂盒(QIAGEN公司制)进行精制。
为了使CgA基因在大肠杆菌中表达，也使用pET22b表达载体(Merck公司制)。该载体设计为：在想表达的目标蛋白的N末端侧融合有6个残基的组氨酸标签。对于pET22b表达载体，同样地使用BamHI和SalI，在37℃下进行限制性内切酶处理过夜。限制性内切酶处理后，为了进行限制性内切酶酶切位点的脱磷酸，将碱性磷酸酶(Takara Bio Inc.制)在50℃下处理1小时。反复进行苯酚/氯仿提取，使碱性磷酸酶失活了，然后进行乙醇沉淀处理，回收限制性内切酶处理完成的pET19b表达载体。
为了构建CgA表达载体，用T4连接酶(Takara Bio Inc.制)将上述限制性内切酶处理完成的CgA基因和pET22b表达载体在16℃下孵育过夜，使其连接。将该表达载体CgA-pET22一次转化到大肠杆菌JM109中，用含有50μg/ml氨苄青霉素钠和1.5％琼脂的Luria-Bertani培养基(LB培养基)在37℃培养过夜。
LB培养基的组成如下所示。细菌蛋白胨1g/L、氯化钠1g/L、酵母提取物1g/L并将最终的培养基的pH调整为7.0左右。
从生长出的菌落中选择具有目标表达载体CgA-pET22的克隆。选择是使用质粒提取试剂盒(QIAGEN公司制)从大肠杆菌克隆中提取表达载体CgA-pET22，然后利用上述引物并采用BigDye(注册商标)Terminator v3.1(Applied Biosystems公司)、PRISM(注册商标)3100Genetic Analyzer(Applied Biosystems公司制)或者PRISM(注册商标)3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems公司制)读取DNA序列。
为了确认所读取的基因序列是否正确，通过国立生物技术信息中心(NBIC)的主页，使用所得的DNA序列数据进行同源性检索，确定正确性。为了使具有正确的基因序列的表达载体CgA-pET22大量表达CgA蛋白质，再次转化到大肠杆菌BL21(Merck公司制)中，得到蛋白质大量表达的大肠杆菌克隆。
将具有表达载体CgA-pET22的大肠杆菌BL21在含氨苄青霉素钠的LB培养基中进行37℃、4小时的培养，然后加入1mM浓度的异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)并进一步进行12小时的培养。
具有CgA-pET22的大肠杆菌BL21(DE3)通过离心分离(8,000旋转、4℃、10分钟)回收菌体。将所回收的菌体一次地在－80℃冷冻过夜，然后悬浮于溶菌缓冲液(50mM的磷酸缓冲液、300mM的氯化钠、10mM的咪唑、pH为8.0)中，然后在冰中利用超声波破碎机进行破碎。将得到的溶菌混浊液离心分离，将透明的溶菌液与沉淀的未破碎菌体分离，然后仅将溶菌液回收并用0.45μm过滤器过滤。
使溶菌液通过于镍琼脂糖凝胶色谱柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶；QIAGEN公司制)，得到组氨酸标签融合CgA。进而使进行了洗脱的CgA通过脱盐色谱柱(Bio-Rad公司制)进行精制。关于组氨酸标签融合CglT的蛋白量测定，在根据需要用蒸馏水而稀释后，利用BCA/蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific公司制)进行测定。蛋白的标准曲线使用牛血清白蛋白制作。
将CgA的氨基酸序列示于序列号19。
图8示出了，向按干燥重量计含有5％木薯浆的BM7CO培养基中添加β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、上述来自热纤梭菌JK-S14的葡糖淀粉酶并培养热纤梭菌JK-S14株时的培养液中的葡萄糖蓄积量。黑四边形符号(■)表示培养液中的葡萄糖蓄积量。
从图8可知，将热纤梭菌JK-S14株在含有α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、葡糖淀粉酶这3种酶和含有如淀粉那样的纤维素系生物质的培养基中培养的情况下，在添加α-淀粉酶时可见葡萄糖浓度的蓄积，还回收了3.6％的除木薯浆的淀粉以外的纤维量为约80％的葡萄糖，如果考虑用于增殖和/或酶生产而消耗的量，则分解了以葡萄糖为结构单元的多糖质的90％以上。这些结果表明，在使用含有淀粉的纤维素系生物质使葡萄糖有效蓄积的情况下，除了β-葡萄糖苷酶以外，添加α-淀粉酶和葡糖淀粉酶来培养热纤梭菌也是有效的。
保藏号
NITE BP-627(热纤梭菌JK-S14株)

Claims (15)

1.一种葡萄糖的生产方法，其特征在于，在纤维素的存在下培养嗜热厌气性微生物时使β-葡萄糖苷酶共存。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述嗜热厌气性微生物产生糖酵解酶。
3.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述嗜热厌气性微生物是梭菌属微生物或热解纤维素菌属微生物。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述嗜热厌气性微生物为热纤梭菌或解糖热解纤维素菌。
5.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述β-葡萄糖苷酶具有50℃以上的耐热性。
6.根据权利要求5所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述β-葡萄糖苷酶来自嗜热性微生物。
7.根据权利要求6所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述来自嗜热性的β-葡萄糖苷酶来自嗜热厌氧杆菌属微生物。
8.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其特征在于，在纤维素的存在下培养嗜热厌气性微生物时，与β-葡萄糖苷酶一同地加入表面活性剂或高分子化合物、蛋白性阻断剂中的一种以上。
9.根据权利要求8所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述表面活性剂含有吐温，所述高分子化合物含有聚乙二醇，蛋白性阻断剂含有酪蛋白。
10.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述纤维素是纤维素系生物质。
11.根据权利要求1所述的葡萄糖的生产方法，其特征在于，所述纤维素系生物质含有淀粉，并且与β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和葡糖淀粉酶一同地培养嗜热厌气性微生物。
12.根据权利要求11所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶具有50℃以上的耐热性。
13.根据权利要求12所述的葡萄糖的生产方法，其中，所述葡糖淀粉酶来自梭菌属微生物。
14.一种葡萄糖的连续生产方法，其特征在于，在权利要求1所述的葡萄糖的生产方法中，将微生物与纤维素和β-葡萄糖苷酶一同培养，在嗜热厌气性微生物消耗了纤维素之后，反复添加纤维素系生物质。
15.根据权利要求14所述的葡萄糖的连续生产方法，其中，所述纤维素系生物质含有淀粉。
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